一种高效合成α‑氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用的制作方法

文档序号:11125947阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种高效合成α-氨基丁酸的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述重组菌单细胞工厂是将重组共表达载体转化到宿主菌中得到的;所述重组共表达载体是在质粒载体上串联L-苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因、提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因;其中,以L-氨基酸脱氢酶基因的表达为基准,控制供辅因子NADH循环的脱氢酶的表达量使辅因子NADH的生成速率处于相对较高的水平,控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量处于相对较合适的水平。

2.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述的重组菌单细胞工厂能得到较优的从L-苏氨酸到中间产物酮丁酸及从酮丁酸到α-氨基丁酸的平衡速率,不会造成中间产物酮丁酸的积累因而不会造成对反应的抑制;同时所述的重组菌单细胞工厂不需要外源添加辅因子,相比于其他方法减少了底物进出细胞或扩散的路径从而增加了转化速率。

3.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述控制,是通过但不限于,启动子和/或rbs序列优化,也可以是增强子、终止子、沉默子优化等。

4.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述重组菌单细胞工厂的构建方法,包括:

(1)根据启动子及L-苏氨酸脱氨酶的基因序列,设计不同强度的rbs序列用来控制L-苏氨酸脱氨酶的表达量从而控制L-苏氨酸到酮丁酸的转化速率;

(2)对辅因子NADH的供应速率进行了调控,主要是对启动子以及rbs序列进行优化来控制提供辅因子NADH循环的脱氢酶表达量从而控制辅因子NADH的再生速率;

(3)将rbs优化后的L-苏氨酸脱氨酶基因、L-氨基酸脱氢酶基因、启动子以及rbs优化后的提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因按顺序连接,构建重组共表达载体,并将重组共表达载体转化宿主菌中,构建基因工程菌单细胞工厂。

5.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述L-苏氨酸脱氨酶基因前有质粒载体自身携带的启动子、针对L-苏氨酸脱氨酶基因和质粒载体设计的表达强度低于质粒载体本身rbs的rbs序列;所述L-苏氨酸脱氨酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因之间通过质粒载体自身携带的rbs连接;所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因前有针对提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因和质粒载体设计的启动子、表达强度高于或等于质粒载体本身rbs的rbs序列。

6.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述宿主菌可以是大肠杆菌,,也可以是其他宿主,比如枯草芽孢杆菌、棒杆菌、酵母等。

7.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述质粒载体可以是任意一种可商业化购买的质粒载体,或者是任意一种已有报道的经改造的质粒载体。

8.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述L-苏氨酸脱氨酶选自但不限于大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶。

9.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述L-氨基酸脱氢酶选自:但不限于,芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。

10.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶选自:但不限于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶、枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶、恶臭假单胞杆菌的葡萄糖脱氢酶。

11.根据权利要求1所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述宿主为大肠杆菌;所述L-苏氨酸脱氨酶基因前的启动子为T7启动子;L-苏氨酸脱氨酶基因前直接连接的rbs序列为序列SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:6所示序列中的任意一种;所述L-苏氨酸脱氨酶基因和L-氨基酸脱氢酶基因通过序列为SEQ ID NO:22所示序列的RBS连接。

12.根据权利要求11所述的重组菌单细胞工厂,其特征在于,所述提供辅因子NADH循环的脱氢酶基因前的启动子为tac启动子,rbs序列为SEQ ID NO:33~SEQ ID NO:39中的任意一种;可选地,rbs序列为SEQ ID NO:37的序列。

13.一种发酵合成α-氨基丁酸的方法,是利用权利要求1~12任一所述的重组菌单细胞工厂。

14.权利要求1~12任一所述的重组菌单细胞工厂应用于α-氨基丁酸、酮丁酸或其相关附属产物的合成。

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