本发明涉及蛋白核小球藻培养领域，具体涉及一种利用水稻叶片提取液培养提高蛋白核小球藻产量的方法。
背景技术：
蛋白核小球藻是一种单细胞绿藻，其环境适应性强，易于大规模培养。蛋白核小球藻活细胞可以清除废水中不同形态的氮和磷，能用于工厂化水产养殖废水的净化处理(陈海敏,等，工厂化水产养殖废水菌藻联合处理模式研究.浙江树人大学学报，2002，2(4)：64-67)，还对印染废水中的偶氮染料具有较强的脱色能力(郑金来,等，生物降解常见染料的研究进展.环境污染治理技术与设备，2000，1(3):39-43)，可用于印染废水的净化处理。蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)细胞干物质中蛋白质占50％～65％，油脂占5％～10％，碳水化合物占10％～20％，含有大量具有抗氧化物活性的维生素如维生素C和维生素E，被FAO命名为绿色健康食品(HU Q,PAN B,XU J,et al.Effects of super critical carbon dioxide extraction conditions on yields and antioxidant activity of Chlorella pyrenoidosa extracts[J].Journal of Food Engineering,2007,80(4):997-1001.)，从蛋白核小球藻中还分离出具有增强机体免疫力、抑制肿瘤、降血压、血球凝集素等功效的生物活性成分(汪炬,等.蛋白核小球藻提取物的抑瘤作用及对免疫功能的影响.营养学报，2004，26(2)：136-138；YANG S C,YANG H Y,YANC Y C,et al.Chlorella pyrenoidosa ameliorated L-NAME-induced hypertension and cardiorenal remodeling in rats[J].European Journal of Nutrition,2013,52(2):601-608.)，我国于2012年批准人工养殖的蛋白核小球藻为新型食品资源。蛋白核小球藻藻粉粗蛋白必需氨基酸含量高，是一种优良的饲料蛋白源(李国平.蛋白核小球藻粉中氨基酸含量和饲用价值分析.中国野生植物资源.2003，22(2):23-25)。可见，蛋白核小球藻在环境污水净化处理、制备营养食品饲料、开发医药新产品和生物柴油等领域前景广阔，如何在提高细胞生长速率，短时间内获得大量的藻细胞是开发应用蛋白核小球藻的关键技术环节。
科学家发现天然植物提取液具有促进小球藻生长的效应，从芦苇粗提液中分离出了能够促进蛋白核小球藻生长的生物活性物质。科学家还发现采用低浓度的柳树叶浸提液培养7d可使蛋白核小球藻藻密度提高16.9％-30.9％。应用植物粗提物提高小球藻的生物量具有成本低廉，操作方便等优点，对小球藻的生产具有重要价值。
技术实现要素：
本发明提供了一种利用水稻叶片提取液培养提高蛋白核小球藻产量的方法，应用水稻叶片提取液达到快速增加小球藻生长速率的目的效果。
一种利用水稻叶片提取液培养提高蛋白核小球藻产量的方法，包括：
1)将新鲜的水稻叶片干燥粉碎后，加水提取，得到稻叶提取液；
2)用稻叶提取液代替水(通常为蒸馏水)配制蛋白核小球藻培养基，得到稻叶提取液培养基；
3)用稻叶提取液培养基对蛋白核小球藻进行培养，经细胞分离得到小球藻细胞沉淀和内含水稻叶提取液的上清液。
以下作为本发明的优选技术方案：
步骤1)中，所述的新鲜的水稻叶片为田间或人工培养的水稻植株分蘖盛期叶片。所述的将新鲜的水稻叶片干燥粉碎包括：将新鲜的水稻叶片置于55～65℃烘箱中烘干20～28h，然后粉碎，过筛孔径0.15-0.7mm的筛，得到稻叶干粉。得到的稻叶干粉再加水提取，得到稻叶提取液。进一步优选，所述的将新鲜的水稻叶片干燥粉碎包括：将新鲜的水稻叶片置于60℃烘箱中烘干24h，然后粉碎，过40目筛(筛孔径0.25-0.5mm)得到稻叶干粉。得到的稻叶干粉再加水提取，得到稻叶提取液。
所述的加水提取具体包括：将新鲜的水稻叶片干燥粉碎后得到的稻叶干粉加水在黑暗中15℃～35℃浸提36～60h，之后过滤，得到滤液，即为稻叶提取液。所述的加水提取具体包括：将新鲜的水稻叶片干燥粉碎后得到的稻叶干粉加水在黑暗中25℃浸提48h，之后过滤，得到滤液，即为稻叶提取液。
所述的稻叶干粉与水的质量比为：0.2～5：100。进一步优选，所述的稻叶干粉与水的质量比为：0.5～2：100。更进一步优选，所述的稻叶干粉与水的质量比为2：100，能够更好地促进小球藻的生长，同时提高小球藻叶绿素含量。
步骤2)中，所述的蛋白核小球藻培养基可采用现有的蛋白核小球藻培养基，将配置蛋白核小球藻培养基的水组分替换成稻叶提取液，配方的含量和其他组分均不变。如可采用常用BG11培养基，将BG11培养基中的水组分替换成步骤1)中的稻叶提取液，配方的含量和其他组分均不变。
步骤3)中，所述的培养的条件为：培养温度为23℃～33℃，光强1500～2500Lux，光周期为10～14hr昼/10～14hr夜，主要为静置培养，每天(即每24hr周期内)摇动培养瓶混匀2～6次直至培养周期结束，培养周期为6～12天。进一步优选，所述的培养的条件为：培养温度为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为6～8天。
所述的蛋白核小球藻，可采用市售产品，可具体采用中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)市售的编号为FACHB-1222的蛋白核小球藻。
步骤3)中，藻细胞沉淀获得为离心法，即所述的细胞分离采用离心法，所述的细胞分离的条件为：在10000～14000r/min离心3～15min。进一步优选，所述的细胞分离的条件为：12000r/min离心10min，使的小球藻细胞沉淀下来。
所获得的内含水稻叶提取液的上清液，可以一定配比添加到藻细胞培养液中重复利用，促进藻细胞生长。
本发明中，小球藻细胞沉淀经洗涤重悬后可作为水中氮、磷、偶氮染料降解等污水净化处理的生物基料，也可经干燥后获得蛋白核小球藻细胞产品，作为制备饲料、提取油脂、蛋白、色素和生长因子等相关生物产品的原料。小球藻细胞沉淀经处理后得到绿色小球藻细胞干粉，绿色小球藻细胞干粉是一种蛋白核小球藻细胞产品。
一种制备绿色藻细胞干粉的方法，包括：
1)根据所述的利用水稻叶片提取液提高蛋白核小球藻产量的方法制备得到小球藻细胞沉淀；
2)将小球藻细胞沉淀经洗涤、离心和干燥后得到绿色藻细胞干粉。
所述的洗涤、离心和干燥具体为：将小球藻细胞沉淀加入水重悬洗涤后，经6000～10000r/min离心5～20min后收集，之后在30℃～50℃低温条件下烘干，得到藻细胞干品。进一步优选，将小球藻细胞沉淀加入水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min后收集，之后在40℃低温条件下烘干，得到藻细胞干品。
绿色蛋白核小球藻细胞干粉可直接制作为食品或/和生物饲料，也可以添加到食品或/和饲料配方中，得到复合食品/和生物饲料。
本发明水稻叶片提取液培养提高蛋白核小球藻产量和叶绿素含量的技术的机理在于：稻叶提取液促进蛋白核小球藻生长的原因一方面稻叶提取液可能含有内源激素或其他生物活性成分，这些成分改变了蛋白核小球藻的基因表达模式，激发了藻细胞內源生长因子合成和对外源营养物质的利用，从而加速了细胞生长和分裂。另一方面，可能是其中的糖类、蛋白质等营养物质提供了优质碳源和/或氮源。藻体中叶绿素a含量往往与藻细胞生长状态和光合作用密切相关，是藻类生长的特征参数。但藻细胞生长量与细胞叶绿素a含量的增加趋势并不完全一致。稻叶提取液对藻细胞分裂速度、细胞干物质积累量和细胞叶绿素合成的影响并不完全同步，因此选择合适的培养周期使得藻细胞增长量和叶绿素含量提高幅度指标可以得到最佳组合，这也是培养周期确定为6天的基础。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明中，蛋白核小球藻活细胞沉淀经洗涤重悬后可作为水中氮、磷、偶氮染料降解等污水净化处理的生物基料，也可经干燥后获得蛋白核小球藻细胞产品，作为制备饲料、提取油脂、蛋白、色素和生长因子等相关生物产品的原料。本发明技术操作简单，成本低廉，具有快速增加蛋白核小球藻细胞生长量的显著效果，采用本发明的利用水稻叶片提取液培养提高蛋白核小球藻产量的方法可使蛋白核小球藻的活细胞获得量比对照提高0.73～2.19倍，培养6天时，含0.5-2.0％稻叶提取液的处理组藻细胞干重产量比对照组增加1.46-2.73倍，2.0％稻叶提取液处理组的藻细胞叶绿素含量分别比对照组提高了1.83倍，在蛋白核小球藻的应用开发方面效益显著，前景广阔。
本发明将稻叶提取液应用于小球藻的培养生产，创建了一种应用水稻叶片提取液增加蛋白核小球藻生长速率的和叶绿素含量的培养技术，为蛋白核小球藻的工业化生产提供了新途径。我国是农业生产大国，农作物种植面积大，叶片易收获，将农作物叶片提取液应用于培养营养物质丰富的蛋白核小球藻，这为蛋白核小球藻的生产养殖提供了新思路。应用本发明的培养技术能快速增加蛋白核小球藻的生长速率，在短时间内获得大量蛋白核小球藻细胞，同时操作简单，成本低，收益高。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。给出的实施例仅为了阐释本发明，而不是为了限制本发明的应用范围。以下出现的百分数，如没有特别说明，均为质量百分数。
实施例1：
1)采用水稻品种日本晴种植于浙江省富阳市中国水稻研究所实验基地，取分蘖盛期叶片，置于60℃烘箱中烘干24h，然后将水稻叶片粉碎，过40目筛(筛孔径0.25-0.5mm)得到稻叶干粉，密封于干燥容器中避光备用。
称取稻叶干粉2.5g、5g、10g，分别加500mL蒸馏水在黑暗中室温(25℃)浸提48h，提取液用布氏漏斗经滤纸抽虑，用蒸馏水定容至500mL，得到质量比为0.5％、1.0％、2.0％的稻叶提取液。
采用BG11基本培养基作为对照组，处理组以稻叶提取液代替蒸馏水配制，稻叶提取液BG11培养基，121℃高压灭菌后，分装至100mL三角瓶中，每瓶50mL培养基。
2)采用蛋白核小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，具体为，编号为FACHB-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按10％(v/v)接种量接入BG11液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养。培养条件为：28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，每天早晚各摇动一次。第3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度，作为蛋白核小球藻种子细胞培养液。
3)同时设定BG11基本培养基对照组和稻叶提取液处理组，其中蛋白核小球藻种子细胞初始接种浓度为2×106个cell/mL，两组培养体系均为500ml×3瓶，培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次，培养周期为8天。
4)培养结束后，将培养液震荡混匀后，取培养液1ml采用血球计数板法测定培养液中的蛋白核小球藻细胞数目，结果：对照组蛋白核小球藻在前2d增殖缓慢，至第4d增殖开始加速，第8d培养液的藻细胞浓度达到2.98×107个cell/mL。第8d时，含1.0％和2.0％稻叶提取液的处理组藻密度分别达到9.51×107和9.33×107个cell/mL，比同期对照组增加了2.19和2.13倍；0.5％低浓度处理组到第8d时，藻密度为4.71×107，比同期对照组增加了0.73倍。该实施例表明稻叶提取液具有显著提高蛋白核小球藻生长量的技术效果。
实施例2：
1)采用水稻品种日本晴种植于浙江省富阳市中国水稻研究所实验基地，取分蘖盛期叶片，置于60℃烘箱中烘干24h，然后将水稻叶片粉碎，过40目筛(筛孔径0.25-0.5mm)得到稻叶干粉，密封于干燥容器中避光备用。
称取稻叶干粉2.5g、5g、10g，分别加500mL蒸馏水在黑暗中室温(25℃)浸提48h，提取液用布氏漏斗经滤纸抽虑，用蒸馏水定容至500mL，得到质量比为0.5％、1.0％、2.0％的稻叶提取液。
采用BG11基本培养基作为对照组，处理组以稻叶提取液代替蒸馏水配制。稻叶提取液BG11培养基，121℃高压灭菌后，分装至100mL三角瓶中，每瓶50mL培养基。
2)采用蛋白核小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，具体为，编号为FACHB-1222。取蛋白核小球藻原藻液，按10％(v/v)接种量接入BG11液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养。培养条件为：28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，每天早晚各摇动一次。第3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度，作为蛋白核小球藻种子细胞培养液。
3)同时设定BG11基本培养基对照组和稻叶提取液处理组，其中蛋白核小球藻种子细胞初始接种浓度为2×106个cell/mL，两组培养体系均为500ml×3瓶，培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次，培养周期为6天。
4)培养结束后，将培养液震荡混匀后，取30mL藻细胞培养液8000rpm离心10min后去上清并在烘箱中60℃干燥至恒重，称取对应的藻细胞干重W，并计算每升培养液获得的藻细胞干重,以mg/L表示藻细胞干重产量。藻细胞叶绿素a的提取和含量(Chl a)的测定参照Lichienthaler的方法(Lichienthaler H K.Chlorophylls and carotenoids:Pigmenis of photosynthetic biomembranes.Methods in Enzymology,1987,148(1):350-382.)，取5mL藻液，8000rpm离心10min，弃上清。将藻细胞沉淀重悬于5ml甲醇中，放置在4℃冰箱中过夜提取小球藻叶绿素a，再离心取上清。以甲醇为参比，分别在波长665nm处测定吸光度值。应用以下公式计算细胞叶绿素a含量：
Chl a(mg/g)＝13.9×A665/W
将培养6天后对照组和稻叶提取液处理组获得的蛋白核小球藻藻细胞干重产率、藻细胞叶绿素含量结果列于表1：
表1稻叶提取液处理组和BG11基本培养基对照组培养6天时藻细胞干重产率和叶绿素含量的比较
注：表中数据为三组试验平均值。**表示与对照组差异极显著，t>t0.01,P<0.01
表1结果可见，培养6d时，含0.5-2.0％稻叶提取液的处理组藻细胞干重产量均显著高于对照组，分别比对照组增加1.46、2.69和2.73倍；0.5％稻叶提取液的处理组藻细胞叶绿素a含量与对照组相似，差异不显著，含1.0％和2.0％稻叶提取液处理组的藻细胞叶绿素含量分别比对照组提高了1.17倍和1.83倍，效果十分显著。
实施例3：
2％稻叶提取液的处理组蛋白核小球藻种子细胞初始接种浓度为2×106个cell/mL，培养6天，同时设定BG11基本培养基对照组。培养周期结束后，考察了稻叶提取液培养技术对蛋白核小球藻细胞干重、蛋白含量、叶绿素含量的影响效果，并以此考察绿色藻细胞干粉品制备食品和/或生物饲料的品质。
1)对照组获得小球藻细胞培养液直接经8000r/min离心10min收集藻细胞沉淀；在40℃低温条件下烘干藻细胞沉淀至恒重获得小球藻细胞干品，对藻细胞干品进行称量计算藻细胞干重得率(mg/L)，结果见表2；
2)2％稻叶提取液处理组获得的蛋白核小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min收集小球藻细胞沉淀；在40℃低温条件下烘干藻细胞沉淀至恒重获得小球藻细胞干品，对藻细胞干品进行称量计算藻细胞干重得率(mg/L)，结果见表2；
3)采用Lichienthaler的方法，提取和测定绿色藻细胞干粉叶绿素a含量(mg/g)，结果见表2；
4)采用参照Safi等方法(Safi C,Ursu A V,Laroche C,et al.Aqueous extraction of proteins from microalgae:Effect of different cell disruption methods.Algal Research,2014,3(8):61-65.)，将干燥的藻细胞置于研钵中研磨5-10min，藻粉置于三角瓶中，以料液比1:50加入pH＝12的NaOH提取液震荡提取2h，8000r/min离心15min，收集上清，即为可溶性蛋白。采用Bradford方法(Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemisry,1976,72(1):248-254.)以牛血清白蛋白作标准曲线，测定蛋白质浓度，换算出每克干重藻细胞可溶性蛋白质含量：
蛋白含量(mg/g藻细胞)＝蛋白浓度(mg/mL)×提取液体积(mL)/藻细胞干重(g)，结果见表2；
表2稻叶提取液培养对蛋白核小球藻细胞干重得率和营养品质的影响效果
注：表中数据为三组数据平均值。
提高效率＝[(处理组-对照组)/对照组]×100％
本实施例结果表明，采用本发明的稻叶提取液培养技术可使蛋白核小球藻细胞干重得率提高272.6％，藻细胞干粉叶绿素含量比对照提高了183.0％，可溶性蛋白质含量比对照增加了21.5％，促进效果十分显著。
将上述绿色藻细胞干粉产品性状为绿色粉状，质地较膨松，有温和的藻香味，叶绿素a含量为15.0(mg/g)，蛋白质含量为63.48(mg/g)，直接作为食品或生物饲料使用，该产品也可按一定比例如20％～80％的质量比与其他食品或饲料组合配制成复合营养食品或生物饲料，增加食品或饲料的蛋白含量、色泽及口感及营养价值。