临床治疗级细胞治疗用成纤维细胞规模化制备人类细胞外基质筛选培养方法
【专利摘要】本发明公开了皮肤临床治疗级成纤维细胞的培养、筛选、扩增技术，这些瓶颈一直是生物学细胞领域研究热点和难点，目前利用基底膜显著黏附特性进行分离纯化，采用三维培养扩增手段获得。该发明适合依赖扩增贴壁型细胞并提供三维高拟体内细胞外基质系统进行目标细胞水平的筛选与分离。高模拟体内贴附环境，体外培养成体(胚胎皮肤)细胞的生物细胞新培养技术。高模拟底物所在环境黏附筛选培养目标成纤维细胞，具有高传代能力，高增殖能力，并可在体外环境下形成皮层结构。筛出免疫原性细胞安全获得免疫逃逸，延长移植时间增加组织工程临床应用，促进创面愈合与皮肤疾病提供了绝对优势临床治疗级细胞的解决方案。
【专利说明】临床治疗级细胞治疗用成纤维细胞规模化制备人类细胞外 基质筛选培养方法 一、【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物细胞技术，组织工程领域。涉及一种体外构建高模拟体内贴附环 境分离筛选，皮肤细胞成纤维细胞的培养、扩增技术。获得临床治疗级成纤维细胞应用于组 织工程皮肤构建技术中的活性种子细胞。
[0002] 二、【背景技术】介绍：
[0003] 皮肤是人体最大的器官，参与抵御生物入侵、紫外线辐射以及防止水分丢失、调节 体温维持个体外貌等方面起着十分重要的生理作用，其是人体免疫系统组成的重要的一部 分，而皮肤细胞是构成这器官的基本单元，皮肤细胞基础研究领域是揭示皮肤健康、发育、 预防、治疗的重要科研途径。
[0004] 细胞外基质（extracellular matrix,ECM)广泛存在于细胞间隙的基本填充成分， 是细胞新陈代谢、生长、繁殖、分化、表达、传递、互惠所依赖的极其重要场所。早期研究学者 认为.外基质只是一种组织内、细胞外的单纯的支持结构。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究发现填充组织间隙的胶原与促进成肌细胞转化肌管的现象。并在两年之后，得以证 明学者们才对这种稳定外物质微环境有了新的认识和思考。
[0005] Hay在11年后报道了 ECM对胚胎发育过程具有重要的诱导作用。ECM影响细胞行 为的现象得以关注并进行广泛的研究，但是并没有成型的理论基础佐证ECM与细胞的密切 关系。直到1982年有学者提出证明并建立ECM与细胞骨架和核基质之间"动态互惠"的模 型。在这个模中，ECM分子与细胞表面受体互相作用，然后把信号通过细胞膜传导进入细胞 浆中，引起从细胞骨架到细胞核的一系列变化，引起某些特定基因的表达。
[0006] 并证明这些基因的表达产物又可以反过来对ECM发生作用，今天的许多研究证实 了这个模型的合理性，并且证明细胞和ECM相互作用直接参与了细胞的黏附、生长、游走、 分化和程序性死（凋亡）的过程；外基质参与调节细胞因子、生长因子的活性；还能够直接 激活、启动细胞内信号传导机制。由于这种对细胞的调节和对信号的传导作用。因此，我们 必须充分了解细胞外基质的化学的、物理的、生物学性质和功能及其在组织的形成和修复 中的作用，才能更好地应用这些生物材料构建成为组织接受，乃至模拟组织完善再生的"生 物构架"。我们建立的高拟细胞外基质材料利用的恰是反向理论，指导我们深入开展对ECM 的认也反作用得到我们可利用的干细胞，这种研究模式促进学科前行及发展。
[0007] 皮肤干细胞在正常皮肤组织中含量极少，干细胞公认是一种在体内具有无限更新 能力，且可分化形成相应全层组织分化细胞，体外培养具有长期生长潜能并可形成无限克 隆。是愈合修复创面，皮肤更新代谢再生的重要参与者。但由于目前缺乏理想筛选方法，对 干细胞进行筛选及鉴定方法报道较少。
[0008] 三、皮肤细胞名称概述
[0009] 成纤维细胞（fibroblast)也称为纤维母细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分， 由胚胎时期的间充质细胞（mesenchymal cell)分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多 为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。根据不同 功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质 嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相 转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重 要的作用。
[0010] 四、成纤维细胞概述
[0011] 成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核 仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明 它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤 维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合 成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成 胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是I型胶原纤维，在形态和生化结构 上完全相同。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和 高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变 为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织 中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成 纤维细胞。
[0012] 五、成纤维细胞应用的特点
[0013] 一般创伤修复
[0014] 各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和 细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以 伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4?5天或6天开始合成和分 泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损， 为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮乳头层的局部成 纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与 修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为 创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来， 另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤 处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理 条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生 隹丐化，引起异位骨化（ectopic ossification)。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十 分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨 祖细胞的细胞都有可能参与这一过程骨创伤修复
[0015] 最简单和常见的骨创伤即是骨折，其愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和 骨性骨痂4个阶段。不同阶段参与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第3天起就出现于 骨折局部血肿中，骨折后5天即在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围大量存在，是参与 纤维骨痂阶段的主要细胞成分。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成 和分泌大量I型胶原，使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组织，将骨断端包围起来，形成接合 两骨折断端的巨大的纤维骨痂。然而，这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构 成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的瘢痕组织，而是通过钙盐结 晶在其内部不断沉积，逐渐演变为骨性骨痂，使骨折局部的修复达到骨性愈合，恢复骨组织 的结构。此时，骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞。
[0016] 六、成纤维细胞的分离及鉴别
[0017] 显微镜下观察成纤维细胞呈梭形，呈放射状，漩涡状生长，抗结蛋白单克隆抗体和 肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色呈阴性，抗波形蛋白单克隆抗体呈阳性。
[0018] 七、传统筛分方法介绍
[0019] 因为皮肤细胞对基底膜有较强的粘附性，对细胞胞外基质的粘附速度要比其它类 型细胞快得多，所以利用该种特性进行培养筛选。目前传统的皮肤干细胞筛选如下阐述：
[0020] 方法一（3T3滋养层法）：人类皮肤细胞体外培养研究已有一个世纪的历史背景， 建立体外扩增培养体系于1975年由学者Rheinwald和Green所设计3TS-J2小鼠胚胎瘤的 成纤维细胞株3T3滋养层细胞，并用γ射线致死剂量照射，防止细胞受到异种物种的影响。 灭活3T3滋养层细胞作为培养表皮细胞的滋养层能促进表皮干细胞筛选的贴附和生长，并 具有未被论证的接触性抑制成纤维细胞生长的功能。实验室所选用的、功能较稳定的各亚 系但还不能完全排除对它的顾虑，还需继续观察和探索有效的替代方法。Green研究这种方 法的3T3虽然它是一个异种的具有问变性质的细胞，有不少实验室曾试图用其他措施予以 取代，但至今为止，它的效果在各种方法中仍是最有效的，继续被广泛应用。从第1例临床 应用至令已近30年，尚未发现因它而造成的不良后果。
[0021] 方法二（纤维蛋白原及凝血酶底物法）=Graziella P学者研究用纤维蛋白原及凝 血酶作为基质分离皮肤细胞；
[0022] 方法三（IV型胶原黏附法）Jone PH等利用上述方法从成人包皮或尸体皮经消 化，利用IV型胶原做底物基质分离皮肤细胞，所选用底物为异种胶原，存在不同种属的污 染可能性，并且底物昂贵，不适合产业化规模或长期培养，适合试验性小剂量研究；
[0023] 方法四（流式细胞仪筛选法）：学者Van Rossum丽j与Kaur P等从人小块活检 组织中得到角朊细胞，利用整合素标记异性标志物利用流式细胞仪分离皮肤细胞，选用方 法复杂且技术要求高，大体应用integrinii 1，细胞黏附分子⑶49,增列细胞核抗原（PCNA) 等多种标记进行特征分离，虽然细胞得以筛选，但是会留有标记物标记滞留细胞无法有效 去除，存在是否影响细胞增殖、分化、变异性等。此方法适合标记鉴定测定细胞，并不适合临 床应用的细胞富集方法；
[0024] 方法五（异种成纤维悬浮筛选法）：学者Hagar B利用DMEM、低钙离子鼠成纤维细 胞条件培养液作为培养基，不用滋养层细胞。但有研究报导表皮干细胞与基底膜脱离可诱 发进入分化周期，分化为过渡性扩充细胞，据猜想表皮干细胞与基底膜的高粘附性有可能 是维持表皮干细胞控制分化特性的可能条件。所以如果不利用滋养层，有可能长期培养过 程中干细胞分化引起后续研究的不可控发展；
[0025] 方法六（同体成纤维贴附筛选法）：学者金岩等利用参考改进学者Hagar B和 Dunnwald鼠成纤维细胞，改成供体预先体外扩增的成纤维细胞为附着底物作为滋养层，培 养同体皮肤细胞，但是专利并没有明确如何制备滋养层平皿的详细步骤，铺皿周期短，成纤 维贴壁力低，筛选反复PBS清洗纯化过程会损失部分培养的目标贴附成功的成纤维细胞， 从而降低目标干细胞的得率，干细胞理论上具有同体同原性，另一技术问题在于，两种细胞 在共有同一培养环境应考虑培养液的复杂性，两种细胞可能出现竞争性的生长增殖抑制等 现象，后续分离皮肤细胞存在技术难度，并不能优于现有的六中常见方法，建议其可把此方 法改成复方加入其它覆皿效果好黏附行为比较大的其它筛选物同用增加目标细胞得率，或 灭活成纤维铺皿层细胞。
[0026] 方法七（甲基纤维素培养皿贴附筛选法）：
[0027] 国外学者利用添加甲基纤维素 B27的DMEN/F12进行培养。
[0028] 综上所述，皮肤细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，体外筛选培养的人成纤维 细胞得以在国内外方法特异性快速发展。而成纤维细胞生物学性能，可以做到增进功能、避 免潜在有害基因及对成纤维细胞控制分化时间与控制不同分化方向等，在基础科研、临床 治疗、皮肤细胞研究方向、皮肤再生损伤修复、高拟组织工程皮肤的构建方面等均有历史时 期的重要不可取代的指导意义。
[0029] 八、组织工程皮肤背景介绍
[0030] 再生组织工程细胞建立系工作始于本世纪（Harrison 1907, Carrel 1912)，指导 引领着生物学，临床医学材料等各大衔接领域，成为重要的基础科学之一。组织构建和细胞 体外培养是至关重要的课题。从供体捐献者活体取组织，模拟体内生理环境等系列特定体 外微环境体系，进行孵化培养、使得组织细胞健康生长。
[0031] 组织工程皮肤建立早期应用于修复烧伤和溃疡以及其它皮肤损伤领域，麻省总医 院的John F. Burke与MIT的Yannas I.V.合作，制备首次人工皮肤替代物。但是这种组织 皮肤替代物并不与细胞生物学相关，隶属于组织工程皮肤支架材料学范畴。随着细胞生物 学的基础学科发展，人们开始整合两大学科，共同协作解决创伤皮肤修复构建，真正的含活 性细胞组织工程皮肤在哈福大学Honward Green与MIT的Eugenen Bellhe合作完成。早 期定制皮肤移植救治取得了生物学医学介瞩目关注。
[0032] 20世纪80年代初期支架材料被FDA许可上市，由胶原网格组成的复合皮肤移植材 料被创造出来，内层为牛胶原和硫酸软骨素构成，外层为硅胶树脂，创面移植后内层与创面 接触被缓慢降解，数周后硅树脂层移除，清创后覆盖自体移植皮肤，覆盖物被临床所接受。
[0033] MIT的科学家Bellhe把材料学和生物学完美结合创造了组织工程皮肤并建立了 世界上第一家组织工程再生公司（Organogenesis Inc)，是科学界商人的典范。这家活性组 织工程皮肤先驱引领公司仍然是在人工皮肤市场占有率最高的组织工程公司之一。
[0034] 1997年通过美国FDA批准上市的第一个组织工程产品由Advanced Bionhealing 公司生产的TransCyte。用于烧伤创面修复治疗。该产品属于胶原支架材料种植灭活性 的纤维细胞，成为商业化的第一个"异体无活性细胞组织工程真皮疗法"。Dermagraft和 Integra以及Organogenesis Inc制造的Apligraf也获得FDA批准，利用新生儿包皮经生 物学体外培养活性细胞，制备的组织工程皮肤，用于溃疡皮肤和大面积烧伤再生治疗。该产 品是严格意义上具有类皮肤组织工程人工皮肤，含活性4?8传代的细胞并具有完整表皮 真皮细胞构建在组织工程支架之上可降解全层人工皮肤。并且部分剔除减少朗格汉斯细 胞，降低了受体的免疫排斥反应，无活性的死亡细胞经过创面组织液及相关体液因子代谢 的作用被分解可用于创面修复的小分子片段基础营养愈合物质被创面吸收利用。这种产品 制成后置于_70°C保存，37°C迅速复苏，复苏后有50 %的活性细胞具有活性，活性维持5天 通过快递邮寄到指定的医疗部门。
[0035] 这些产品的市场准入引领了崭新的再生医学组织工程皮肤时代开创。
[0036] 基于国内国际组织工程人工皮肤现状，建立组织工程皮肤干细胞-高拟体内细胞 外基质，基质附着体外筛选方法设计首例含有表皮干细胞成纤维细胞的全层组织工程人工 皮肤产业化产品。
【发明内容】
[0037] 1. -种用于筛选和培养成纤维细胞的培养基组合，
[0038] 配制培养液A :灭活胎牛血清40?60ml、转铁蛋白5?15 μ g/ml、维生素 B4 0· 5?I X 1CT4/L、维生素 Cl?3 μ g/ml、胰岛素2?4 μ g/ml、霍乱霉素2. 5?4. 5u/L、 EGF5 ?25ng/ml、氢化可的松 0· 4 μ g/ml、DMEM/F12 (3 : 1)定容到 500ml。
[0039] 配制培养液B :配制培养液B :灭活胎牛血清80ml、转铁蛋白6?17 μ g/ml、腺苷 10 ?25mg/ml、维生素 M 0· 5 ?IX 1(T4/L、霍乱霉素 2. 5 ?3. 5u/L、青霉素 50-100u/ml、 膜岛素 4 ?6 μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGF10 ?18ng/ml、牛脑垂体提取物（ΒΡΕ) 1 ?3mg/ L、干细胞生长因子（SCF)5?15ng/ml、氢化可的松0.3yg/ml、DMEM/F12(l : 1)定容到 500ml，ρΗ7· 2 ?7. 4。
[0040] 配制培养液C :灭活胎牛血清60ml、转铁蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ ml、维生素 MO. 5?I X 10_4/L、胰岛素4?6 μ g/ml、bFGFlO?20ng/ml、牛脑垂体提取物 (BPE)2?3mg/L、干细胞生长因子（SCF)IO?30ng/ml、霍乱霉素2. 5?3. 5u/L、链霉素 50 ?100μ g/ml、氢化可的松 0· 3μ g/ml、DMEM/F12(l : 1)定容到 500ml，ρΗ7· 2 ?7. 4。
[0041] 2. -种制备高拟体内细胞外基质的方法，包括以下步骤：a)取材及皮肤消毒处 理；b)脱细胞处理；优选地，还进一步包括将消毒或经脱细胞处理的皮肤进一步进行低温、 脱水、辐照灭菌处理；更优选地步骤b)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶-非离子表面活 性剂-络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。
[0042] 3.权利要求2所述方法，其中冷酶交联剂法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷 消12?48h。用含0.25%戊二醛磷酸缓冲溶液，pH在7. 20?7. 40之间，交联4?6h，超 纯水或注射用水冲洗8?10次。
[0043] 4.权利要求2所述方法，其中酶-非离子表面活性剂-络合剂联合法是：0. 1? 0· 25%中性蛋白酶与0· 01?0· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室温下作用 24 ?48h。
[0044] 5.权利要求2所述方法，其中络合剂加盐-阴离子表面活性剂法是：0.01? 0·02%EDTA含0·6?0·8mol/L氯化钠溶液，37°C下作用12?24h，后用（0·2?0·5%SDS 溶液，室温下作用30?60min)。
[0045] 6.权利要求2所述方法，其中胰酶联合EDTA交联液是：0. 25?0. 40%胰蛋白酶 和0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交联液中交联4?6h。交联 后用超纯水或注射用水冲洗8?10次。
[0046] 7.由权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质。
[0047] 8.权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质或者权利要求7所述的 高拟体内细胞外基质在筛选成纤维细胞中的用途。
[0048] 9. -种利用权利要求1所述的培养基组合和权利要求7所述的高拟体内细胞外基 质筛选和培养成纤维细胞的方法，包括：
[0049] a)制备表皮细胞悬液：取材，消化，剥离表皮收集皮片，消化，用权利要求1所述的 培养液A终止消化，收集细胞混悬液。离心后加入培养液A养液；
[0050] b)成纤维细胞的筛选及培养：将权利要求7所述的高拟体内细胞外基质加入权利 要求1所述的培养液B，加入步骤a)制备的细胞悬液，培养，清洗，目标表皮干细胞贴壁粘附 于高拟体内细胞外基质，加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培养；
[0051] c)消化富集传代培养：消化，离心后加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培 养。优选地，免疫逃逸方法处理取材前皮肤或获得细胞，免疫逃逸方法可以为射线法、低温 冻融法
【专利附图】
【附图说明】
[0052] 图1高拟体内细胞外基质制备流程
[0053] 图2细胞筛选培养
[0054] -、高拟体内细胞外基质种类
[0055] (涉及的皮肤均为器官捐献，包皮环切皮肤、以及医疗救治过程中植皮取皮废弃皮 肤组织）
[0056] I. 1其特征在于：针对本发明技术的发展现状，本发明的目的是提供一种高拟体 内真皮层作为细胞外基质为筛选贴附，成体或胚胎皮肤成纤维细胞筛选分离和体外培养的 方法，并使获得的高纯度成纤维细胞。
[0057] 1. 2其特征在于：针对本发明技术的发展现状，本发明的目的是提供一种高拟体 内全层皮肤作为为细胞外基质为筛选贴附，成体或胚胎皮肤皮肤干细胞筛选分离和体外培 养的方法，并使获得的高纯度皮肤干细胞。皮肤细胞包括：（成纤维细胞、毛囊干细胞、表皮 干细胞、及其它皮肤附件附属相关的干细胞及皮肤相关细胞）。
[0058] 这种筛选分离和体外培养的方法，获得的成纤维细胞细胞克服以上传统七种方法 的缺陷。
[0059] 发明属生物成体（胎儿）皮肤细胞细胞【技术领域】，涉及成纤维细胞的分离与培养 方法。方法特征包括：同体表皮脱细胞表皮底物预备；同体真皮细胞的分离；利用高拟体内 附着基质成纤维细胞的筛选及培养。目前用该法在体外已稳定培养传代超过43?60 (代）， 经体内外实验证实该细胞无细胞毒，具有强的增殖能力，并可以形成成熟的全层分化真皮 皮层结构为有关皮肤细胞在科研、教学及临床的应用起到不可估量的作用，同时孕育着巨 大学术方向与社会效益和经济效益。通过此种方法理论基础推进我国其他器官细胞的学术 基础建立。
[0060] 二、高拟拟体内细胞基质构成：
[0061] 经分析含有多种胶原并包含IV型、其中I型胶原含量最大（I与III型胶原的比 例为10 : 1)，同时还保留了完整的基底膜结构。
[0062] 三、高拟体内细胞基质底物孔隙率与黏附表面特征：
[0063] 高拟底物电镜观察，测定表皮黏附的底物组织再生的基底膜孔隙直径为32? 145 μ m，促进黏附真皮组织再生底物基底膜多孔孔隙直径为72?191 μ m。这种孔隙率所购 建的空间黏附表面均有利干细胞黏附附着生长、增殖、分化。
[0064] 通过以上制备方法；有效的保留了皮肤细胞外基质的微观构架和完整的基底膜结 构，其主要成分包括各型胶原、弹性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基质成分，可为真 皮干细胞等快速粘附、表皮干细胞、增殖扩展提供有力的支持。因此，高拟底物是目前最理 想的组织工程皮肤干细胞筛选的解决方案。
[0065] 四、皮肤细胞高拟拟体内细胞基质制备具体实施步骤与方法：
[0066] 一、包括以下两个步骤种方法：
[0067] 步骤一：皮肤消毒处理过程：取供体皮肤包括以下（胚胎皮肤、成体包皮外板、头 皮、腋下皮肤、及躯干皮肤均可）含表皮真皮结构的断层皮肤，剪切成组织块浸泡在生理盐 水稀释含〇. 05?0. 1 %苯扎溴铵溶液中10?15min，消毒处理，用无菌生理盐水反复冲洗 残余苯扎溴铵。
[0068] 步骤二：低温-60?_80°C冷冻干燥，真空度达到20?llOpa，脱去组织块90? 95%以上水分，取出密封与真空包装，经辐照25?60KGY剂量灭菌。终品可以在室温中保 存长达5年。启动只需浸泡37°C，PBS液或下面所述营养液复苏15?30min即可应用，浸 泡延长至10?12h效果更佳。使用后并且应用去细胞漂洗液（见下方法中相应提及适合 的脱细胞液）脱细胞处理、再经过上述过程永生反复使用的特点。
[0069] 1 :步骤二【具体实施方式】：
[0070]
【权利要求】
1. 一种用于筛选和培养成纤维细胞的培养基组合， 配制培养液A :灭活胎牛血清40?60ml、转铁蛋白5?15 μ g/ml、维生素 Μ 0. 5? 1 X 1CT4/L、维生素 Cl?3 μ g/ml、胰岛素2?4 μ g/ml、霍乱霉素2. 5?4. 5u/L、EGF5? 25ng/ml、氢化可的松 0· 4 μ g/ml、DMEM/F12 (31)定容到 500ml。 配制培养液B :配制培养液B :灭活胎牛血清80ml、转铁蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10? 25mg/ml、维生素 Μ 0. 5?1X1(T4/L、霍乱霉素2. 5?3. 5u/L、青霉素50-100u/ml、胰岛素 4 ?6 μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGF10 ?18ng/ml、牛脑垂体提取物（ΒΡΕ) 1 ?3mg/L、干细 胞生长因子（SCF)5?15ng/ml、氢化可的松0. 3μ g/ml、DMEM/F12(1 : 1)定容到500ml， ρΗ7· 2 ?7· 4。 配制培养液C :灭活胎牛血清60ml、转铁蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、维生 素 B40. 5?1 X 1(T4/L、胰岛素 4?6 μ g/ml、bFGF10?20ng/ml、牛脑垂体提取物（ΒΡΕ) 2? 3mg/L、干细胞生长因子（SCF) 10?30ng/ml、霍乱霉素 2. 5?3. 5u/L、链霉素 50?100 μ g/ ml、氢化可的松 0· 3μ g/ml、DMEM/F12(l : 1)定容到 500ml，ρΗ7· 2 ?7· 4。
2. -种制备高拟体内细胞外基质的方法，包括以下步骤：a)取材及皮肤消毒处理；b) 脱细胞处理；优选地，还进一步包括将消毒或经脱细胞处理的皮肤进一步进行低温、脱水、 辐照灭菌处理；更优选地步骤b)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶-非离子表面活性 剂-络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。
3. 权利要求2所述方法，其中冷酶交联剂法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷消 12?48h。用含0. 25%戊二醛磷酸缓冲溶液，pH在7. 20?7. 40之间，交联4?6h，超纯 水或注射用水冲洗8?10次。
4. 权利要求2所述方法，其中酶-非离子表面活性剂-络合剂联合法是：0. 1?0. 25% 中性蛋白酶与〇· 01?〇· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室温下作用24? 48h。
5. 权利要求2所述方法，其中络合剂加盐-阴离子表面活性剂法是：0. 01?0. 02% EDTA含0. 6?0. 8mol/L氯化钠溶液，37°C下作用12?24h，后用（0. 2?0. 5% SDS溶液， 室温下作用30?60min)。
6. 权利要求2所述方法，其中胰酶联合EDTA交联液是：0. 25?0. 40 %胰蛋白酶和 0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交联液中交联4?6h。交联后用 超纯水或注射用水冲洗8?10次。
7. 由权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质。
8. 权利要求2-6所述任一方法制备的高拟体内细胞外基质或者权利要求7所述的高拟 体内细胞外基质在筛选成纤维细胞中的用途。
9. 一种利用权利要求1所述的培养基组合和权利要求7所述的高拟体内细胞外基质筛 选和培养成纤维细胞的方法，包括： a) 制备表皮细胞悬液：取材，消化，剥离表皮收集皮片，消化，用权利要求1所述的培养 液A终止消化，收集细胞混悬液。离心后加入培养液A养液； b) 成纤维细胞的筛选及培养：将权利要求7所述的高拟体内细胞外基质加入权利要求 1所述的培养液B，加入步骤a)制备的细胞悬液，培养，清洗，目标表皮干细胞贴壁粘附于高 拟体内细胞外基质，加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培养； C)消化富集传代培养：消化，离心后加入权利要求1所述的培养液C进行扩增培养。 优选地，免疫逃逸方法处理取材前皮肤或获得细胞，免疫逃逸方法可以为射线法、低温冻融 法。
【文档编号】C12N5/071GK104263698SQ201410482323
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】朱宁文, 王凌仪 申请人:江苏华亿细胞组织工程有限公司