专利名称：包含调节干细胞分化成天然杀伤细胞的基因作为有效成分的分化调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种包含调节干细胞分化成天然杀伤细胞的基因作为有效成分的分化调节剂以及对于该基因的筛选方法。
背景技术：
干细胞具有分化成各种器官的多潜能性并且具有自我更新能力，并且在胚胎和成人中都有所发现。干细胞能够使细胞分化成特定的细胞或器官，从而我们的注意力集中在使用干细胞进行器官移植或细胞治疗的可能性上。
造血干细胞，一种成人干细胞，是能够分化成每一种血液形成细胞如红细胞、白细胞、血小板和淋巴细胞的细胞。参与免疫系统的细胞不断地由骨髓中的造血干细胞进行自我更新。到目前为止造血干细胞已被用来通过骨髓移植的方式进行包括癌症在内的各种血液疾病的治疗。按照近来的报道，造血干细胞在动物模型中能够分化成其它类型的细胞如肌肉、神经、骨等。如果它们能够应用于人，造血干细胞能够用于治疗多种疾病，包括糖尿病、帕金森病、脊髓损伤等，因为它们能够成功地替代其它细胞和器官。
特别地，天然杀伤(下文中称作‘NK’)细胞非特异性地破坏癌细胞。由于它们的细胞毒性能力，NK细胞现在已经用于使用LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)和TLL(肿瘤浸润淋巴细胞)治疗实体肿瘤以及使用供体淋巴细胞输注进行免疫疗法(J Immunol.，1986，36(10)3910-3915；Hematologia，1999，841110-1149)，提示它进一步开创了新的细胞疗法的途径以减少骨髓移植或器官移植后的排斥。还报道了NK细胞的分化和激活中的缺陷与各种疾病相关，所述疾病包括乳腺癌(Breast Cancer ResTreat.，2003，66(3)255-263)，黑素瘤(Melanoma Res.，2003，13(4)349-356)和肺癌(Lung Cancer，2002，35(1)23-18)，从而NK细胞疗法吸引了我们的注意去治疗这些疾病。
因而，本发明人通过使用SAGE(基因表达的连续分析)鉴定了一种调节干细胞分化成NK细胞的新基因，并且通过证实NK细胞分化由上面的基因调节以及进一步证实所述基因能够极大地有助于包括癌症在内的疾病的治疗而完成本发明。
发明内容技术问题本发明的目标是提供包含调节干细胞分化成天然杀伤细胞的基因作为有效成分的NK细胞分化调节剂以及使用SAGE筛选该基因的方法。
技术方案为了实现以上目标，本发明提供了调节干细胞分化成天然杀伤细胞的分化调节剂。
本发明还提供一种调节干细胞分化成未成熟(premature)天然杀伤细胞的分化调节剂。
本发明还提供一种调节未成熟天然杀伤细胞分化成成熟天然杀伤细胞的分化调节剂。
本发明还提供一种通过使用本发明的分化调节剂开发的抗癌剂。
本发明还提供一种基于SAGE的基因筛选方法，所述基因调节干细胞分化成天然杀伤细胞。
在本发明中，“分化调节基因”意为每一种调节干细胞分化成天然杀伤细胞的基因，即，它们能够加速或抑制分化。更确切地，本发明的分化调节基因能够加速分化，从而它促进向下一阶段的发展。同时，它还具有维持每一阶段或抑制向下一阶段发展的功能。
在本发明中，“SAGE”代表“基因表达的连续分析”。SAGE可以通过常规方法或通过生产商的方案(InvitrogenTMlife technologies)(http//www.invitrogen.com)来进行。
在基因名称后的括号中的标记意为GenBank ID，暗示每种基因的序列并且GenBank ID能够轻易地检索到并且被本领域人员所用。
本发明中所用的II型限制性内切核酸酶是遗传工程领域中广泛使用的常规酶。它需要镁离子激活和识别DNA的特异性核苷酸序列，从而它能够精确地剪切所希望的区域或除了识别核苷酸序列之外的邻近区域。本发明中所用的IIS型限制性内切核酸酶意为NlaIII(识别和消化每250个碱基对的CATG区的区域)。
下文中，对本发明进行详细介绍。
本发明提供一种天然杀伤细胞的分化调节剂，其特征是包含一种或多种基因作为有效成分，所述一种或多种基因选自由同源框蛋白MIX(AF15457)，前-原-蛋白酶3(U97073)，成髓细胞白血症(Myb)癌基因(M16499)，角蛋白复合物1，酸性，基因13(NM_010662)，PA-磷酸酶相关的磷酸酯酶(AK002966)，γ-parvin(BC011200)，forkhead-相关转录因子1C(AF330105)，RIKEN cDNA 5730501N20基因(AK017744)，c-myc蛋白(X010223)，核糖体蛋白L10A(AK002613)，Oct 2b基因(X53654)，microlite(AK015601)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(BC003368)，tracle(U81030)，溶菌酶(BC002069)，铁蛋白H链(BC012314)，短小蛋白聚糖(X87096)，基质金属蛋白酶12(BC019135)，EIA-刺激的基因细胞抑制剂(AF084524)，S100钙结合蛋白A9(BC027635)，MPS1蛋白(L20315)，转谷氨酰胺酶2(BC016492)，血清和糖皮质激素调节的蛋白激酶(AF139639)，RIKENcDNA 5830413L19(BC027496)，干扰素诱导的蛋白质(BC003804)，乳脂球膜蛋白EGF因子8(BC018577)，细胞表面糖蛋白p91(U83172)，精氨酸酶1(BC050005)，肿瘤坏死因子受体1(M59378)，类视黄醇诱导的丝氨酸羧肽酶(AF330052)，FLJ11000同源物(BC023802)，白介素-18结合蛋白d前体(AF110803)，氯化物通道7(AK009435)，CD36抗原(BC010262)，锌指蛋白同源物(BC030186)，糖结合蛋白35(J03723)，C-型钙依赖型糖(BC003218)，脂蛋白脂肪酶(NM 008509)，v-maf细纤维束纤维肉瘤癌基因(BC038256)，白介素7受体(NM_008372)，趋化因子(C-C)受体1(BC011092)，neurophilline(MGD|MGI106206)(AK002673)，SERPINA3G(XM_127137)，GABA-A受体亚基6(X51986)，LAPTm5(U51239)，G-蛋白信号调节剂(BC049968)，诱杀剂刺激性因子GPI固定的mRNA(L41366)，Y盒蛋白3(AK019465)，骨桥蛋白前体(J04806)，淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白-结合家族(AK021331)，T细胞受体β亚基类似物(U63547)，免疫相关核苷酸1(BC005577)，更高阶段的转录因子1(NM_009480)，溴感受蛋白MOR267-7(NM_146714)，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(M12056)，破骨细胞癌抑制剂(AB013898)，血小板活性受体同源物(BC024054)，天然杀伤细胞蛋白2-A1(AF016008)，未鉴定的蛋白MGC36662(BC023851)，脑信号蛋白6A前体同源物(AK004390)，神经丝同源物多肽(BC025872)，马鞭草苷(cornin)同源物肌动蛋白结合蛋白2A(BC026634)，溶质传递性家族6(BC015245)，暂时嘌呤受体P2Y10同源物(AK020001)，T细胞受体γ链(X03802)，多A聚合酶α(NM_011112)，OPA-相关蛋白OIP5类似物(AK017825)和mytogen激活的蛋白激酶1类似物(BC006708)组成的组。
本发明还提供一种调节干细胞分化成未成熟天然杀伤细胞的分化调节剂，其特征是包含一种或多种基因作为有效成分，所述一种或多种基因选自由同源框蛋白MIX(AF15457)，前-原-蛋白酶3(U97073)，成髓细胞白血症(Myb)癌基因(M16499)，角蛋白复合物1，酸性，基因13(NM_010662)，PA-磷酸酶相关的磷酸酯酶(AK002966)，γ-parvin(BC011200)，forkhead-相关转录因子1C(AF330105)，RIKEN cDNA5730501N20基因(AK017744)，c-myc蛋白(X010223)，核糖体蛋白L10A(AK002613)，Oct 2b基因(X53654)，microlite(AK015601)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(BC003368)，tracle(U81030)组成的组。
本发明还提供一种调节未成熟天然杀伤细胞分化成成熟天然杀伤细胞的分化调节剂，其特征是包含一种或多种基因作为有效成分，所述一种或多种基因选自由溶菌酶(BC002069)，铁蛋白H链(BC012314)，短小蛋白聚糖(X87096)，基质金属蛋白酶12(BC019135)，EIA-刺激的基因细胞抑制剂(AF084524)，S100钙结合蛋白A9(BC027635)，MPS1蛋白(L20315)，转谷氨酰胺酶2(BC016492)，血清和糖皮质激素调节的蛋白激酶(AF139639)，RIKEN cDNA 5830413L19(BC027496)，干扰素诱导的蛋白质(BC003804)，乳脂球膜蛋白EGF因子8(BC018577)，细胞表面糖蛋白p91(U83172)，精氨酸酶1(BC050005)，肿瘤坏死因子受体1(M59378)，类视黄醇-诱导的丝氨酸羧肽酶(AF330052)，FLJ11000同源物(BC023802)，白介素-18结合蛋白d前体(AF110803)，氯化物通道7(AK009435)，CD36抗原(BC010262)，锌指蛋白同源物(BC030186)，糖结合蛋白35(J03723)，C-型钙依赖型糖(BC003218)，脂蛋白脂肪酶(NM_008509)，v-maf细纤维束纤维肉瘤癌基因(BC038256)，白介素7受体(NM_008372)，趋化因子(C-C)受体1(BC011092)，和neurophilline(MGD|MGI106206)组成的组。
本发明还提供一种调节成熟天然杀伤细胞分化的分化调节剂，其特征是包含一种或多种基因，所述一种或多种基因选自由SERPINA3G(XM_127137)，GABA-A受体亚基6(X51986)，LAPTm5(U51239)，G-蛋白信号调节剂(BC049968)，诱杀剂刺激因子GPI固定的mRNA(L41366)，Y盒蛋白3(AK019465)，骨桥蛋白前体(J04806)，淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白-结合家族(AK021331)，T细胞受体β亚基类似物(U63547)，免疫相关核苷酸1(BC005577)，更高阶段转录因子1(NM_009480)，溴感受蛋白MOR267-7(NM_146714)，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(M12056)，破骨细胞癌抑制剂(AB013898)，血小板活性受体同源物(BC024054)，天然杀伤细胞蛋白2-A1(AF016008)，未鉴定的蛋白MGC36662(BC023851)，脑信号蛋白6A前体同源物(AK004390)，神经丝同源物多肽(BC025872)，马鞭草苷同源物肌动蛋白结合蛋白2A(BC026634)，溶质传递性家族6(BC015245)，暂时嘌呤受体P2Y10同源物(AK020001)，T细胞受体γ链(X03802)，多A聚合酶α(NM_011112)，OPA-相关蛋白OIP5类似物(AK017825)和mytogen激活的蛋白激酶1类似物(BC006708)组成的组。
包括在本发明的分化调节剂中的基因具有以下功能1)调节干细胞分化成未成熟NK细胞，2)调节未成熟NK细胞分化成成熟NK细胞，和3)调节成熟NK细胞的分化，在每一阶段起作用的分化调节基因可以独立地用作从干细胞到NK细胞的分化调节剂。在本发明的优选实施方案中，通过培养用细胞因子处理的HSC细胞来诱导从干细胞分化成未成熟NK细胞并且分化成成熟NK细胞(
图1a-图1c)。从每一阶段中，分离总RNA并且如图2的示意图中所示进行SAGE。通过SAGE，从每一分化阶段选择出显示表达的特异性增加的基因(图3a-图3f)。将所述基因与GenBank中登录的其它基因进行比较。作为结果，那些基因中没有任何基因被报道具有调节从干细胞到pNK细胞(见表3)，从pNK细胞到mNK细胞(见表4)和mNK细胞(见表5)的分化的功能。
所以，本发明的基因是一种新的发现，其具有新的分化调节机制，并且具有一种或多种这些基因的药物组合物能够用于细胞分化的调节。特别地，涉及从干细胞到未成熟NK细胞分化的分化调节剂可以通过使用一种或多种表3中所列的基因制备，而涉及从未成熟NK细胞到成熟NK细胞分化的分化调节剂也可以通过使用一种或多种表4中所列的基因制备。涉及成熟NK细胞分化的分化调节剂可以通过使用一种或多种表5中所列的基因制备。在表3，4和5中所列的全部基因都具有调节从干细胞到NK细胞分化的功能，从而通过使用一种或多种上面提及的基因可以制备调节天然杀伤细胞分化的分化调节剂。
本发明的细胞分化调节剂也可以用于癌症的治疗。本发明的分化调节剂优选地可以应用于这些癌症，如乳腺癌，黑素瘤和肺癌。NK细胞分化和激活的缺陷导致各种癌症，例如，乳腺癌(Breast Cancer Res Treat.，2003，66(3)255-263)，黑素瘤(Melanoma Res.，2003，13(4)349-356)和肺癌(Lung Cancer，2002，35(1)23-18)。因而，述及的癌症可以通过用本发明的NK细胞分化调节剂调节NK细胞分化而有效地进行治疗。
本发明的细胞分化调节剂能够进行口服或胃肠外给药并且能够以药物制剂的一般形式使用。本发明的细胞分化调节剂可以通过混合以通常使用的填充剂、补充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、稀释剂如表面活性剂，或赋形剂而进行制备以用于口服或胃肠外给药。口服给药的固体制剂为片剂、丸剂、扑粉、颗粒和胶囊。这些固体制剂是通过混合以一种或多种合适的赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等制备的。除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂，例如，硬脂酸镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂为混悬液、溶液、乳剂和糖浆，除了一般使用的简单稀释剂如水和液体石蜡之外，上述制剂可以包含各种赋形剂如湿润剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。用于胃肠外给药的制剂为无菌水溶液、不溶于水的赋形剂、混悬液、乳剂，和栓剂。除了活性的一种或多种化合物之外，不溶于水的赋形剂和混悬液可以包含丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射的酯像油酸乙酯(ethylolate)等。除了活性的一种或多种化合物之外，栓剂可以包含witepsol，聚乙烯二醇，吐温61，可可脂，月桂精脂(laurin butter)，甘油，明胶等。
本发明的药剂的有效剂量是0.1～0.2mg/kg，优选0.15mg/kg。本发明的药剂的给药次数可以是一天一次到三次。
本发明还提供基因的筛选方法，所述基因调节从干细胞到天然杀伤细胞的分化，所述方法包括下列步骤1)在从细胞中分离总RNA后合成cDNA；2)在消化步骤1的cDNA后分离标志物；3)将步骤2中分离的每种标志物连接起来并且随后分析其核苷酸序列；和4)基于上面分析的核苷酸序列，通过使用SAGE分析程序，量化基因的表达。
在步骤1中，优选从干细胞分化成天然杀伤细胞的每个阶段中选择细胞。在本发明的优选实施方案中，使用造血干细胞(HSC)作为干细胞，而将未成熟天然杀伤细胞和成熟杀伤细胞用作天然杀伤细胞。任何常规方法，只要它能够以高产量从样品中分离总RNA并且避免RNA酶污染，都可以使用(Sambrook，等，1989，Molecular Cloning)。通常，易于按照生产商的方案通过使用RNA分离试剂分离RNA。为了由总RNA合成cDNA，将寡dT引物附于总RNA上，但这并不是合成cDNA的唯一途径并且能够使用合成cDNA的任何其它方法。在本发明的优选实施方案中，将寡dT引物附于总RNA上以合成cDNA并且在此时，寡dT引物插入聚腺苷酸序列进行mRNA的合成。优选在寡dT引物中重复20-30T序列。并且，还允许磁珠另外附于寡dT引物的一端上，因为通过使用磁珠可以成功地分离标志物而无污染。
在步骤2中，消化cDNA后分离标志物的过程由下列步骤组成a)通过用II S型限制性内切核酸酶1消化cDNA来制备标志物；b)组合两种接头，每种都在步骤a中制备的标志物的一端切割位点上包括II S型限制性内切核酸酶1识别位点；c)通过用II S型限制性内切核酸酶2消化连接到步骤b中接头上的标志物并且从标志物上切下寡dT磁珠来分离标志物；d)通过将步骤c中制备的标志物彼此结合来制备双标志物(ditag)；和e)仅通过用II S型限制性内切核酸酶1消化步骤d中制备的双标志物并切下接头来制备双标志物。
在步骤a中，用II S型限制性内切核酸酶1消化合成的cDNA的原因是该酶消化的切割位点能够制备成标志物结合位点并且事实上易于使用该区域与标志物结合，因为所述切割位点形成5’突出端。作为II S型限制性内切核酸酶1，任何适当的酶都是可能的并且优选NlaIII限制性内切核酸酶。那是因为cDNA在每250bp处具有NlaIII限制性内切核酸酶识别位点，从而常规大小的标志物能够通过用该酶消化cDNA而容易地进行制备。
在步骤b中，两种要连接到标志物切割位点上的接头具有大约40bp长的序列，其彼此互补地结合。所述接头在一端包括NlaIII限制性内切核酸酶识别位点(CATG)，其中结合标志物，并且形成突出端使得与标志物的连接容易。
在步骤c中，用II S型限制性内切核酸酶2消化结合到接头上的标志物。将II S型限制性内切核酸酶2结合到接头的限制性内切核酸酶位点上以切除位于限制性内切核酸酶切割位点下游10-14bp的区域，导致大约50bp长的标志物的分离，所述标志物包含突出在5’端上的4bp大小的末端。优选地将BsmFI用作II S型限制性内切核酸酶2。
在步骤d中，将标志物彼此连接以形成双标志物。确切地说，在标志物的每个5’末端形成突出端的末端，从而能够通过连接那些末端轻易地形成双标志物。得到的双标志物为大约100pb长。
在步骤e中，用II S型限制性内切核酸酶1消化双标志物以切去接头，导致只有纯的双标志物。确切地说，标志物和接头末端结合的结合区域包括II S型限制性内切核酸酶识别位点，所以通过使用II S型限制性内切核酸酶1能够切去接头。作为结果，制备了大约26bp长的纯双标志物。
同时，在步骤3中，将步骤2中获得的10到20个标志物片段进行结合并研究它们的核苷酸序列。研究过程由下列步骤组成a)将通过结合步骤2制备的双标志物而制备的多联体型双标志物克隆到载体中；和b)研究步骤a中用于克隆的载体的标志物的核苷酸序列。
在步骤a中，结合双标志物以形成多联体。确切地说，双标志物的两端都包括II S型限制性内切核酸酶1识别位点，表明能够形成突出端。这些双标志物能够轻易地进行连接，从而连接大约20到50个标志物以形成多联体。将制备的多联体型标志物插入常规的克隆用载体中以研究其核苷酸序列。在本发明的优选实施方案中，使用pZerO-1载体进行克隆。述及的表达载体被包括在提供用于进行SAGE分析的试剂盒(Invitrogen Life Science)中并且非常有用。
在步骤4中，通过用SAGE分析程序研究上面获得的核苷酸序列来量化表达。确切地说，将获得的核苷酸序列与GenBank中保存的其它基因序列相比较来鉴定它。随后，将SAGE分析程序用于将序列从高表达序列到低表达的其它序列进行分类。在聚类后，用红色、黄色、绿色和蓝色对它们进行标记，使得表达水平得以清楚地显示。而且表达量可以评估为数值。SAGE分析程序可以由公司提供或者软件的其中之一通过因特网提供。在本发明中，使用一种广泛用于SAGE结果聚类的常规程序(cluster and treeview computer program，http//rana.1b1.gov)。
本发明的筛选方法是基于SAGE分析。该方法的每一步都通过使用一般SAGE分析来进行或者可以按照生产商的说明书通过改进的方法来进行。本发明列出的方法显示于图2的示意图中。
附图描述
图1a-图1c显示在OP9间质细胞存在(+OP9)或缺失(-OP9)的情况下从小鼠造血干细胞(HSC)经过未成熟NK细胞(pNK)到成熟NK细胞(mNK)的分化过程中表面分子的表达的比较。
图1a是一组显示NK细胞分化每个阶段的细胞纯度的图，其通过由流式细胞术测定的两种不同颜色表示。每个象限(quadrant)的数目表示相应细胞的百分比。
Lin-c-kit+(96％)，CD122+NK1.1-(95％)，CD122+NK1.1+(分别为94％，95％)图1b是一组显示在从未成熟NK细胞分化成成熟NK细胞过程中诱导的NK细胞相关的表面标记(NK1.1，DX5，CD94，NKG2A)的表达的图，为此加入OP9间质细胞进行培养。
图1c是一组显示RT-PCR的结果的图。从NK细胞分化的每一阶段由细胞中抽提总细胞质RNA以研究CD122，一种代表性的NK细胞相关基因，以及穿孔蛋白是否表达。
图2是显示检测本发明分化调节基因的SAGE过程的示意图。
图3a-图3f显示通过使用SAGE分析在NK细胞分化过程中获得的基因表达模式的聚类。
图3a显示在HSC细胞中表达最多的基因的组，图3b显示在pNK细胞中表达最多的基因的组，图3c显示在mNK(-OP9)细胞中表达最多的基因的组，图3d显示在mNK(+OP9)细胞中表达最多的基因的组。
图3e显示抑制NK细胞活化的基因，而图3f显示促进NK细胞活化的基因。
在上面图3a-图3f中，从基于SAGE分析的聚类，当聚类频率超过80时，它被标记成红色，当频率为50-79时，它被标记为黄色，当频率为30-49时，它被标记为绿色，而当频率为29以下时，它被标记为蓝色。
图4a-图4d显示RT-PCR研究基因是否确实被表达的结果，所述基因通过SAGE证实调节NK细胞的分化。通过与相当的β-肌动蛋白基因比较来量化表达。
图4a显示在NK细胞分化过程中于HSC细胞中特异性表达的基因，图4b表示在pNK细胞中特异性表达的基因，图4c显示在mNK细胞中特异性表达的基因，而图4d显示LPL以不同的浓度(250ng/ml和500ng/ml)对NK细胞进行处理以研究LPL对NK细胞分化的影响，并且作为结果，促进了分化成mNK细胞。
发明模式如在下面实施例中显示，本发明的实践和目前的优选实施方案是举例说明。
不过，将理解的是，本领域技术人员，在考虑本说明书之后，可以在本发明的精神和范围之内进行修改和改善。
<实施例1>从骨髓中分离干细胞将6-9周龄的C57BL/6小鼠(Dae Han Biolink)的全部骨骼，包括胫骨和股骨进行粉碎。将粉碎的碎片通过70微米的细胞渗滤器并且通过处理裂解溶液(Sigma，St.Louse，MO)将其中的红细胞去除，从而只获得骨髓细胞。将骨髓细胞与进行生物素标记用作系统标记(CD11b巨噬细胞标记，Gr-1粒细胞标记，B220B细胞标记，NK1.1NK细胞标记，CD2T细胞标记，TER-119红细胞标记)的抗体标记反应，随后进行洗涤。随后，将细胞与链霉抗生物素标记的磁珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)反应。通过在MACS(Miltenyi Biotec)的磁场中穿过CS柱(Miltenyi Biotec)而对磁性标记的Lin+细胞进行清除。将穿过该柱的剩余Lin-细胞与连接到c-kit上的磁珠反应并且随后穿过MACS柱(Miltenyi Biotec)，导致保留在柱中的c-kit+细胞。通过FACS(BD Bioscience，Mountainview，CA)测量获得的Lin-c-kit+造血干细胞(下文中称作“HSC细胞”)的纯度。作为结果，确认了细胞具有超过96％的纯度。
<实施例2>诱导从干细胞到NK细胞的分化将实施例1中分离自骨髓的HSC细胞，在添加了小鼠SCF(30ng/ml，BioSource，Camarillo，CA)，小鼠Flt3L(50ng/ml，PeproTech，Rocky Hill，NJ)，小鼠IL-7(0.5ng/ml，PeproTech)，吲哚美辛(2μg/ml，Sigma)，庆大霉素(20μg/ml)和10％胎牛血清的RPMI完全培养基中以2×106细胞/孔的浓度接种到6孔板(Falcon)中。将细胞在37℃，5％CO2温箱中培养6天。从培养的3天后，弃去一半上清液并加入添加了细胞因子以及与上面相同组分的新鲜培养基。6天后，使用FITC标记的CD122抗体和磁珠缀合的抗FITC抗体以MACS分离CD122+未成熟的NK细胞(下文中称为‘pNK细胞’)。通过FACS测量未成熟的NK细胞的纯度，并且由该结果，确认细胞具有超过92％的纯度。
为了诱导分化成成熟NK细胞(下文中称为‘mNK细胞’)，6天后从培养物中回收HSC细胞，并且随后单独或与OP9基质细胞(Science 1994，265(5175)1098-1101；Nakano T，Kodama H，Honjo T.Generation oflymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture)一起在小鼠IL-15(20ng/ml，PeproTech)存在时培养它们。3天后，用具有相同组成的新鲜培养基替换一半的培养基。在第12天，通过使用FITC标记的抗-NK1.1抗体和磁珠缀合的抗FITC抗体分离NK1.1+细胞。使用抗CD122，NK1.1，DX5和NK细胞受体抗体以流式细胞术研究成熟NK细胞。
<实施例3>特异于分化阶段的纯化NK细胞表型的研究为了从每个分化阶段收集特异性NK细胞，将分离自小鼠骨髓的Lin-c-kit+HSC(＞95％)细胞在SCF，Fit-3L和IL-7存在时培养6天。随后，分离CD122+pNK细胞并通过流式细胞术进行分析。对于mNK细胞(-OP9或+OP9)，将IL-15细胞单独或与OP9基质细胞一起再培养6天。通过流式细胞术对回收的细胞进行分析(图1a)。当细胞与OP9基质细胞一起培养时，mNK细胞的数目增多(-OP9；94％和+OP9；＞95％)。mNK细胞表面上的Ly49受体在mNK细胞功能中发挥重要作用并且它们的表达受由与其它免疫细胞通讯进行的信号转导调节。为了证实源于骨髓的HSC细胞和基质细胞的共培养对于mNK细胞Ly49受体的表达是否为必需的，将mNK细胞单独或与OP9细胞一起在IL-15存在时进行培养并且随后研究Ly49的表达(图1b)。当细胞与OP9细胞(+OP9)一起培养时，Ly49C/I和Ly49G2在mNK细胞中得到表达。在另一方面，当细胞独立进行培养时(-OP9)，Ly49C/I或Ly49G2都不表达。该结果表明HSC细胞与OP9细胞的共培养对于NK细胞的成熟是必需的。在按照NK细胞的分化阶段研究了CD122的表达和穿孔蛋白基因的表达之后，证明了HSC细胞在分化过程中成熟为NK细胞(图1c)。
<实施例3>SAGE(基因表达的连续分析)从在实施例2中制备的HSC细胞和从NK分化阶段特异性细胞(pNK和mNK)中分离总RNA。通过使用(dT)25磁珠(Dynal A.S.，Oslo，Norway)从5μg的总RNA中分离并纯化mRNA。将通过寡dT珠分离和纯化的mRNA用作cDNA合成的模板，所述cDNA的合成是使用通过5’-生物素化和3’-连接的寡(dT)引物通过cDNA合成试剂盒(Invitrogen，LifeTechnologies)进行的。按照生产商的说明书(Invitrogen，Life Technologies)，通过图2的示意图中所阐释的方法由cDNA制备SAGE的标志物。将所述cDNA用限制性酶NIaIII进行消化并将3’区结合到涂布了链霉抗生物素的磁珠(Dynal)上。将标志物分成两部分，其分别结合到具有NIaIII识别位点上的接头(Invitrogen，Life Technologies)上。用BsmFI消化接头结合的标志物。用Pfu DNA聚合酶处理分离的标志物和接头以制成平端。将平端连接在一起形成双标志物。通过使用生物素标记的SAGE引物(Invitrogen，Life Technologies)进行PCR以扩增所述双标志物。随后，用NIaIII消化所述双标志物以将其与接头分离。对其进行T4DNA连接酶处理以形成多联体。将制备的多联体克隆入Sph I预消化的pZero-1载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中(图2)。随后，通过使用由SEQ.ID.No.1所示的M13正向引物和由SEQ.ID.No.2所示的M13反向引物进行PCR扩增克隆产物。收集扩增的阳性菌落，并且随后通过测序试剂盒(Big-Dyesequencing kit)和核苷酸测序仪(ABI377 sequencer，Perkin-Elmer AppliedBiosystems，Branchburg，NJ)研究序列。通过SAGE 300软件鉴定标志物的序列。
<实施例4>SAGE数据分析
<4-1>生物信息学分析由提交在GenBank中的，包含在小鼠中表达的大多数序列的UniGene小鼠数据库建立参比SAGE-标志物数据库。通过(i)每种转录物的定向，(ii)多聚(A)信号(AATAAA或ATTAAA)的存在或缺失，(iii)多聚腺苷酸尾部的存在或缺失，和(iv)序列中最后的CATG切割位点的存在或缺失来测定SAGE标志物。将由参比序列提取的全部SAGE标志物用于构建参比SAGE数据库。将实验性SAGE标志物与参比SAGE数据库(http//www.hpcl.cs.uchicago.edu/gist)相匹配。为了鉴定相对于每个SAGE标志物的基因，使用计算机程序SAGEmap(Lash A.E等，2000)。
<4-2>按照SAGE图谱的定量分布的聚类分析基于在NK细胞分化过程中显示的其它表达和功能模式，将聚类计算机程序(cluster and treeview computer program，http//rana.1b1.gov)用于研究实施例4-1中获得的SAGE数据的聚类。简言之，在每个阶段，按照频率标记不同的颜色如蓝色、绿色、黄色和红色(需要时，可获得PERL符号(script))。将中点包括在相应的RGB值中。按照色彩结果，选择一些显示清楚和高度表达的标志物并让它们在板(panel)中彼此分离。将剩余的标志物重排，将显示相似表达模式的线列放置在附近以使逐渐的颜色变化作为一个整体。
基于HSC，pNK，mNK(-OP)和mNK(+OP9)细胞的SAGE模式研究NK细胞分化过程中基因表达的增加或减少。作为结果，如图3a-图3f所示，靶基因聚类成4组。确切地说，图3a代表了一种基因群，其表达在HSC中增加但是被NK细胞分化所减少，图3b显示一种基因群，其表达在pNK细胞中高，而图3c代表了一种基因群，其表达在mNK(-OP9)中高。图3d显示一种基因群，其表达在mNK(+OP9)细胞中逐渐增加直到它达到最大。特别地，在pNK细胞中显示最佳表达的基因群(图3b)包括许多免疫调节基因，如淋巴细胞分化抗体，C-C趋化因子受体，肿瘤坏死因子和白介素-18结合蛋白等，表明免疫调节因子在pNK细胞分化中发挥重要作用。接下来，基于已知的(informed)数据库，通调节NK细胞活性的功能对基因进行分类。图3e和图3f分别显示抑制和促进NK细胞活性的基因。在大多数情况下，那些基因在分化的晚期表达。涉及细胞活化的基因包括许多信号因子如促分裂原活化蛋白激酶，磷脂酶A2，IL-2受体，趋化因子受体等。
<实施例5>调节NK细胞分化每一阶段的基因的分析<5-1>按照NK细胞分化每一阶段构建SAGE文库基于实施例4中SAGE的结果，按照NK细胞分化的每一阶段(HSC，pNK，mNK(-OP9)，mNK(+OP9))构建4种不同的SAGE文库。由HSC的SAGE文库，从全部44,998种标志物中鉴定出19,830种单一的转录物，其中，鉴定了12,899种特异性基因。由pNK的SAGE文库，从全部40,771种标志物中鉴定出17,745种单一的转录物，其中，鉴定了11,684种特异性基因。同样地，由mNK的SAGE文库，从42,160种标志物(mNK(-OP9))和42,535种标志物(mNK(+OP9))中每个鉴定出20,803和20,791种单一的转录物，其中，分别鉴定了3,650和14,335种特异性基因。大体上，从以上四种SAGE文库中鉴定出总共170,464种标志物，从中鉴定出59,657种单一的转录物和35,385种特异性基因。在59,657种单一的转录物中，77.9％是单拷贝的，16.8％显示2-4个拷贝，3.2％显示5-9个拷贝，1.9％具有10-99个拷贝，只有0.2％具有超过100个拷贝(表1)。
表1按照NK细胞分化每一阶段的SAGE结果
还基于上述SAGE的结果研究了已知对NK细胞分化具有作用的基因的表达模式的显示(reflection)。结果，如预期，mNK细胞受体诸如粒酶(GenBank ID NM_013542)，NKG2A(GenBank ID AF106008)，2B4(GenBank ID L19057)，Ly49Q(GenBank ID AB033769)和CD94(GenBankID AF057714)的数目在mNK细胞中大，而在HSC和pNK细胞中则未被计数。IL-15(GenBank ID U14332)仅在HSC和pNK细胞中得以检测。ID2(GenBank ID BC006951)的表达从pNK细胞的阶段开始(表2)。
表2分化相关基因的SAGE结果
<5-2>在每个NK细胞分化阶段表达的分化阶段特异性基因的分析据报道，按照NK细胞的分化阶段，有不同的基因表达，因此，本发明人鉴定了分化阶段特异性基因。出于统计学意义，将至少4倍计数的基因进行分组并呈现于表中。
结果证实了有15个基因在HSC中高表达(表3)。特别地，白介素-1受体相关激酶(IRAK)涉及NK细胞激活和信号传导。在考虑这样报道的情况下，本发明的分析正确进行，所述报道是在IRAK缺陷小鼠中，诱导由IL-18导致的NK细胞中的细胞毒性和由激活的NK细胞产生IFN-γ的能力受到严重损害和减少。
表3
并且，30种其它的基因在pNK细胞阶段中异常(exceptionally)表达(表4)。
在它们之中，证实了c-kit配体对于完全分化成mNK细胞是关键的，并且因此从未成熟NK细胞到成熟NK细胞的进程在缺乏c-kit细胞转导的情况下受到抑制。还报道了，2-微球蛋白涉及Ly49受体的表达的开始并涉及多种NK细胞受体，所述NK细胞受体是NK细胞分化的主要调节剂。转化的Fc受体的表达影响NK细胞的发展和功能，导致了CD56+CD3-NK细胞数量的减少，且进一步导致血细胞减少症和其他关键的免疫缺陷综合症状。按照这样的结果，本发明的分析正确进行，所述结果是已知调节NK细胞分化的基因在如预期的正确阶段表达。
表4
同时，自mNK细胞阶段鉴定27种基因(表5)。在它们之中，已知Src家族酪氨酸激酶‘Fyn’涉及NK细胞的激活。
表5
<实施例6>通过RT-PCR研究基因的表达模式基于SAGE数据来进行半定量RT-PCR以研究其它基因的表达模式。按照靶基因来制备用于RT-PCR的引物。将所有的PCR混合物于95℃加热1分钟，并且其它的PCR条件如下；用HSC和mNK细胞进行的PCR在95℃1分钟，在55℃1分钟，在72℃2分钟进行，用未成熟的NK细胞进行的PCR在95℃1分钟，在60℃1分钟，在72℃2分钟进行，将它们重复28或32个循环，并且接着在72℃延伸10分钟。对扩增的PCR产物进行电泳(electrophorezed)并用溴化乙锭染色。
γ-parvinSEQ.ID.No 3和No 4，Forkhead-相关的转录因子1c(Foxplc)SEQ.ID.No 5和No 6，c-myc蛋白质SEQ.ID.No 7和No 8，角蛋白复合物(KC)1SEQ.ID.No 9和No 10，PA-磷酸酶相关的磷酸酯酶(PA-PRP)SEQ.ID.No 11和No 12，白介素1受体相关激酶(IRAK)SEQ.ID.No 13和No 14，核糖体蛋白L10ASEQ.ID.No 15和No 16，前-原-蛋白酶3SEQ.ID.No 17和No 18，成髓细胞白血症癌基因SEQ.ID.No 19和No 20，
糖结合蛋白(CBP)35SEQ.ID.No 21和No 22，IL-7受体SEQ.ID.No 23和No 24，脂蛋白脂肪酶(LPL)SEQ.ID.No 25和SEQ.ID.No 26，铁蛋白H链SEQ.ID.No 27和No 28，基质金属蛋白酶(MMP)12SEQ.ID.No 29和No 30，G-蛋白信号传导的调节剂(RGS)SEQ.ID.No 31和No 32，Serpina 3GSEQ.ID.No 33和No 34，嘌呤能受体P2YSEQ.ID.No 35和No 36，淋巴细胞-特异性蛋白酪氨酸激酶(PTK)SEQ.ID.No 37和No38，脑信号蛋白6A前体SEQ.ID.No 39和No 40，CD122SEQ.ID.No 41和No 42，穿孔蛋白SEQ.ID.No 43和No 44，β-肌动蛋白SEQ.ID.No 45和No 46结果，9个基因，例如，γ-parvin，forkhead-相关转录因子1c(Foxplc)，c-myc，前-原-蛋白酶3，等在HSC中特异性地表达(图4a)。在pNK细胞中IL-7R和基质金属蛋白酶12(MMP12)(图4b)异常表达。在mNK细胞中嘌呤能受体P2Y10和淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(PTK)(图4c)罕见(unusually)表达。
<实施例7>LPL对NK细胞分化阶段的影响在上面的实施例4中，证实了在许多分化阶段特异性基因中，由SEQ.ID.No 47所代表的脂蛋白脂肪酶(下文称为‘LPL’)在NK细胞的分化中在pNK细胞中过度表达。LPL促进NK细胞增殖但是抑制了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)自发的细胞毒性和活性。为了证实LPL的pNK-特异性表达是否是分化成mNK细胞所需要的，将HSC细胞培养6天，接着将其在缺乏OP9基质细胞的情况下，用IL-15和LPL对其进行处理，随后测量NK细胞的百分比。
结果，用IL-15和LPL一起处理HSC时，与仅用IL-15处理其时相比，NK细胞的百分比增加得更多(NK1.1+NKG2A/C/E+细胞；当其仅用IL-15处理时为50％，对比当用IL-15和250ng/ml的LPL一起处理和当用IL-15和500ng/ml的LPL一起处理时的分别为71％和86％)(图4d)。上述结果显示LPL在从pNK细胞分化成mNK细胞中具有重要的作用，并且本发明正确地进行了调节NK细胞分化的基因的搜索。
工业应用性如前文所解释，除了SAGE之外，用于搜索基因的本发明方法在鉴定具有未知功能的新基因中非常有用，所述基因涉及调节干细胞到天然杀伤细胞的分化。
序列表正文由SEQ.ID.No 1和No 2代表的核苷酸序列是用于实施例3中的PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 3和No 4代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于γ-parvin的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 5和No 6代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于forkhead相关的转录因子1c的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 7和No 8代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于c-myc蛋白的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 9和No 10代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于角蛋白复合物(KC)1的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 11和No 12代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于PA-磷酸酶相关的磷酸酯酶(PA-PRP)的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 13和No 14代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于白介素1受体相关的激酶(IRAK)的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 15和No 16代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于核糖体蛋白L10A的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 17和No 18代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于前-原-蛋白酶3的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 19和No 20代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于成髓细胞白血症癌基因的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 21和No 22代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于糖结合蛋白(CBP)35的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 23和No 24代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于IL-7受体的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 25和No 26代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于脂蛋白脂肪酶(LPL)的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 27和No 28代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于铁蛋白H链的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 29和No 30代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于基质金属蛋白酶(MMP)12的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 31和No 32代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于G-蛋白信号传导的调节剂(RGS)的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 33和No 34代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于serpina 3G的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 35和No 36代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于嘌呤能受体P2Y的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 37和No 38代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(PTK)的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 39和No 40代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于脑信号蛋白6A前体的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 41和No 42代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于CD122的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 43和No 44代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于穿孔蛋白的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 45和No 46代表的核苷酸序列是在实施例6中用于关于β-肌动蛋白的RT-PCR的引物序列。
由SEQ.ID.No 47代表的核苷酸序列是脂蛋白脂肪酶的核苷酸序列。
由SEQ.ID.No 48代表的核苷酸序列是小鼠蛋白的氨基酸序列。
本领域那些技术人员将理解的是，在前面的描述中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作改进或设计其它实施方案的基础，所述其它实施方案用于与本发明的相同目的。本领域那些技术人员还将理解的是，这些等价的实施方案没有背离如在后附权利要求中提出的本发明的精神和范围。
序列表<110>韩国生命工学研究院<120>包含调节干细胞分化成天然杀伤细胞的基因作为有效成分的分化调节剂<130>4p-01-08<160>48<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M13正向引物<400>1gaccggcagc aaaatg 16
<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M13反向引物<400>2caaaagggtc agtgct 16<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>γ-parvin的正向引物<400>3ctctgaagga cccagcagtc 20
<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>γ-parvin的反向引物<400>4gcagctgtag ggatagcctg 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Foxp1c的正向引物<400>5
cgaatctcca gaaaagcagc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Foxp1c的反向引物<400>6aaatctggac tgtggttggc20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-myc的正向引物
<400>7gcccagtgag gatatctgga20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>c-myc的反向引物<400>8gaatcggacg aggtacagga20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>KC1的正向引物
<400>9ggcaacgaga agatcaccat20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>KC1的反向引物<400>10ccacattgac ctggcctact20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PA-PRP的正向引物
<400>11cttattgttg gtgctgccct20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PA-PRP的反向引物<400>12ggttggtcga ggagtgttgt20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IRAK的正向引物<400>13gaagccttgc cagatagcag20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IRAK的反向引物<400>14gcaagacaag aaagcaaggg20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>L10A的正向引物<400>15cacacattgg gcttcacaac20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223L10A的反向引物<400>16tgagttcaca ttccagcagc20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>前-原蛋白酶3的正向引物<400>17acgtgcttct cctccagcta20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>前-原蛋白酶3的反向引物<400>18agggaacaga gctgactcca20<210>19<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>成髓细胞白血症癌基因的正向引物<400>19gaagaaagtg cctcaccagc20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>成髓细胞白血症癌基因的反向引物<400>20gttcaagaac tgcgagggag20<210>21<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP35的正向引物<400>21ctcctcctag tgcctacccc20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CBP35的反向引物<400>22gtcacgactg atccccagtt20<210>23
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IL-7受体的正向引物<400>23tgccagattc atgaggtgaa20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IL-7受体的反向引物<400>24ggagagcaag cattccagac20
<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LPL的正向引物<400>25cagctgggcc taactttgag20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LPL的反向引物<400>26ccatcctcag tcccagaaaa20
<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>铁蛋白H链的正向引物<400>27gaccgagatg atgtggctct20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>铁蛋白H链的反向引物<400>28aaaagatgaa ggcagcctga20
<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MMP12的正向引物<400>29tttggagctc acggagactt20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MMP12的反向引物<400>30
gcttggccat atggaagaaa20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RGS的正向引物<400>31gcagcaacct agaagccatc20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RGS的反向引物
<400>32tgtgagacgg caagaatgag20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Serpina3G的正向引物<400>33ttcaacctca cagagacccc20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>serpina3G的反向引物
<400>34gtaagcttgc ttccacctgc20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>P2Y的正向引物<400>35gccagaaact ggaagcgtag20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>P2Y的反向引物
<400>36ggtcacgaaa ctctgaagcc20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>淋巴细胞特异性PTK的正向引物<400>37gaatctgagc cgtaaggacg20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>淋巴细胞特异性PTK的反向引物<400>38ctgcataaag ccggactagc20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>脑信号蛋白6A前体的正向引物<400>39aagccaccta gagcgatttg20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>脑信号蛋白6A前体的反向引物<400>40gcttccagaa gatcacaggg20<210>41<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD122的正向引物<400>41gtcgacgctc ctctcagctg tgatggctac cata34<210>42<211>36<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>CD122的反向引物<400>42ggatcccaga agacgtctac gggcctcaaa ttccaa36<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>穿孔蛋白的正向引物<400>43gtcacgtcga agtacttggt g21<210>44<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>穿孔蛋白的反向引物<400>44aaccagccac atagcacaca t21<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>β-肌动蛋白的正向引物<400>45gtggggcgcc ccaggcacca 20<210>46<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>β-肌动蛋白的反向引物<400>46ctccttaatg tcacgcacga tttc 24<210>47<211>1425<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(1)..(1422)<223>Mus musculus脂蛋白脂肪酶<400>47atg gag agc aaa gcc ctg ctc ctg gtg gtc ctg gga gtt tgg ctc cag48Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Leu Val Val Leu Gly Val Trp Leu Gln
1 5 10 15agt ttg acc gcc ttc cga gga ggg gtg gcc gca gca gac gca gga aga96Ser Leu Thr Ala Phe Arg Gly Gly Val Ala Ala Ala Asp Ala Gly Arg20 25 30gat ttc tca gac atc gaa agc aaa ttt gcc cta agg acc cct gaa gac144Asp Phe Ser Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu Arg Thr Pro Glu Asp35 40 45aca gct gag gac act tgt cat ctc att cct gga tta gca gac tct gtg192Thr Ala Glu Asp Thr Cys His Leu Ile Pro Gly Leu Ala Asp Ser Val50 55 60tct aac tgc cac ttc aac cac agc agc aag acc ttc gtg gtg atc cat240Ser Asn Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr Phe Val Val Ile His65 70 75 80gga tgg acg gta acg gga atg tat gag agt tgg gtg ccc aaa ctt gtg288Gly Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val85 90 95gcc gcc ctg tac aag aga gaa cct gac tcc aat gtc att gta gta gac336Ala Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn Val Ile Val Val Asp100 105 110
tgg ttg tat cgg gcc cag caa cat tat cca gtg tca gct ggc tac acc384Trp Leu Tyr Arg Ala Gln Gln His Tyr Pro Val Ser Ala Gly Tyr Thr115 120 125aag ctg gtg gga aat gat gtg gcc aga ttc atc aac tgg atg gag gag432Lys Leu Val Gly Asn Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu130 135 140gag ttt aag tac ccc cta gac aac gtc cac ctc tta ggg tac agc ctt480Glu Phe Lys Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu145 150 155 160gga gcc cat gct gct ggc gta gca gga agt ctg acc aat aag aag gtc528Gly Ala His Ala Ala Gly Val Ala Gly Ser Leu Thr Asn Lys Lys Val165 170 175aat aga att act ggt ttg gat cca gct ggg cct aac ttt gag tat gca576Asn Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Asn Phe Glu Tyr Ala180 185 190gaa gcc ccc agt cgc ctt tct cct gat gac gct gat ttt gta gat gtc624Glu Ala Pro Ser Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val195 200 205
tta cac aca ttt acc agg ggg tca cct ggt cga agt att ggg atc cag672Leu His Thr Phe Thr Arg Gly Ser Pro Gly Arg Ser Ile Gly Ile Gln210 215 220aaa cca gtg ggg cat gtt gac att tat ccc aat gga ggc act ttc cag720Lys Pro Val Gly His Val Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln225 230 235 240cca gga tgc aac att gga gaa gcc atc cgt gtg att gca gag aga gga768Pro Gly Cys Asn Ile Gly Glu Ala Ile Arg Val Ile Ala Glu Arg Gly245 250 255ctc gga gac gtg gac cag ctg gtg aag tgc tcg cat gag cgc tcc att816Leu Gly Asp Val Asp Gln Leu Val Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile260 265 270cat ctc ttc att gac tcc ctg ctg aat gaa gaa aac ccc agc aaa gca864His Leu Phe Ile Asp Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Pro Ser Lys Ala275 280 285tac agg tgc aac tcc aag gaa gcc ttt gag aaa ggg ctc tgc ctg agt912Tyr Arg Cys Asn Ser Lys Glu Ala Phe Glu Lys Gly Leu Cys Leu Ser290 295 300tgt aga aag aat cgc tgt aac aat ctg ggc tat gag atc aac aag gtc960
Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Asn Leu Gly Tyr Glu Ile Asn Lys Val305 310 315 320aga gcc aag aga agc agc aag atg tac ctg aag act cgc tct cag atg1008Arg Ala Lys Arg Ser Ser Lys Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ser Gln Met325 330 335ccc tac aaa gtg ttc cat tac caa gtc aag att cac ttt tct ggg act1056Pro Tyr Lys Val Phe His Tyr Gln Val Lys Ile His Phe Ser Gly Thr340 345 350gag aat ggc aag caa cac aac cag gcc ttc gaa att tct ctg tac ggc1104Glu Asn Gly Lys Gln His Asn Gln Ala Phe Glu Ile Ser Leu Tyr Gly355 360 365aca gtg gcc gag agc gag aac att ccc ttc acc ctg ccc gag gtt tcc1152Thr Val Ala Glu Ser Glu Asn Ile Pro Phe Thr Leu Pro Glu Val Ser370 375 380aca aat aaa acc tac tcc ttc ttg att tac acg gag gtg gac atc gga1200Thr Asn Lys Thr Tyr Ser Phe Leu Ile Tyr Thr Glu Val Asp Ile Gly385 390 395 400gaa ctg ctc atg atg aag ctt aag tgg atg agc gac tcc tac ttc agc1248Glu Leu Leu Met Met Lys Leu Lys Trp Met Ser Asp Ser Tyr Phe Ser
405 410 415tgg ccc gac tgg tgg agc agc ccc agc ttc gtc atc gag agg atc cga1296Trp Pro Asp Trp Trp Ser Ser Pro Ser Phe Val Ile Glu Arg Ile Arg420 425 430gtg aaa gcc gga gag act cag aaa aag gtc atc ttc tgt gct agg gag1344Val Lys Ala Gly Glu Thr Gln Lys Lys Val Ile Phe Cys Ala Arg Glu435 440 445aaa gtt tct cat ctg cag aag gga aag gac tca gca gtg ttt gtg aaa1392Lys Val Ser His Leu Gln Lys Gly Lys Asp Ser Ala Val Phe Val Lys450 455 460tgc cat gac aag tct ctg aag aag tct ggc tga1425Cys His Asp Lys Ser Leu Lys Lys Ser Gly465 470<210>48<211>474<212>PRT<213>Mus musculus<400>48
Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Leu Val Val Leu Gly Val Trp Leu Gln1 5 10 15Ser Leu Thr Ala Phe Arg Gly Gly Val Ala Ala Ala Asp Ala Gly Arg20 25 30Asp Phe Ser Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu Arg Thr Pro Glu Asp35 40 45Thr Ala Glu Asp Thr Cys His Leu Ile Pro Gly Leu Ala Asp Ser Val50 55 60Ser Asn Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr Phe Val Val Ile His65 70 75 80Gly Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val85 90 95Ala Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn Val Ile Val Val Asp100 105 110Trp Leu Tyr Arg Ala Gln Gln His Tyr Pro Val Ser Ala Gly Tyr Thr115 120 125Lys Leu Val Gly Asn Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu
130 135 140Glu Phe Lys Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu145 150 155 160Gly Ala His Ala Ala Gly Val Ala Gly Ser Leu Thr Asn Lys Lys Val165 170 175Asn Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Asn Phe Glu Tyr Ala180 185 190Glu Ala Pro Ser Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val195 200 205Leu His Thr Phe Thr Arg Gly Ser Pro Gly Arg Ser Ile Gly Ile Gln210 215 220Lys Pro Val Gly His Val Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln225 230 235 240Pro Gly Cys Asn Ile Gly Glu Ala Ile Arg Val Ile Ala Glu Arg Gly245 250 255Leu Gly Asp Val Asp Gln Leu Val Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile260 265 270
His Leu Phe Ile Asp Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Pro Ser Lys Ala275 280 285Tyr Arg Cys Asn Ser Lys Glu Ala Phe Glu Lys Gly Leu Cys Leu Ser290 295 300Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Asn Leu Gly Tyr Glu Ile Asn Lys Val305 310 315 320Arg Ala Lys Arg Ser Ser Lys Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ser Gln Met325 330 335Pro Tyr Lys Val Phe His Tyr Gln Val Lys Ile His Phe Ser Gly Thr340 345 350Glu Asn Gly Lys Gln His Asn Gln Ala Phe Glu Ile Ser Leu Tyr Gly355 360 365Thr Val Ala Glu Ser Glu Asn Ile Pro Phe Thr Leu Pro Glu Val Ser370 375 380Thr Asn Lys Thr Tyr Ser Phe Leu Ile Tyr Thr Glu Val Asp Ile Gly385 390 395 400
Glu Leu Leu Met Met Lys Leu Lys Trp Met Ser Asp Ser Tyr Phe Ser405 410 415Trp Pro Asp Trp Trp Ser Ser Pro Ser Phe Val Ile Glu Arg Ile Arg420 425 430Val Lys Ala Gly Glu Thr Gln Lys Lys Val Ile Phe Cys Ala Arg Glu435 440 445Lys Val Ser His Leu Gln Lys Gly Lys Asp Ser Ala Val Phe Val Lys450 455 460Cys His Asp Lys Ser Leu Lys Lys Ser Gly465 470
权利要求
1.一种分化调节剂，其调节干细胞向天然杀伤细胞的分化，包含一种或多种基因作为有效成分，所述一种或多种基因选自由同源框蛋白MIX(AF 15457)，前-原-蛋白酶3(U97073)，成髓细胞白血症(Myb)癌基因(M16499)，角蛋白复合物1，酸性，基因13(NM_010662)，PA-磷酸酶相关的磷酸酯酶(AK002966)，γ-parvin(BC011200)，forkhead-相关转录因子1C(AF330105)，RIKEN cDNA 5730501N20基因(AK017744)，c-myc蛋白(X010223)，核糖体蛋白L10A(AK002613)，Oct 2b基因(X53654)，microlite(AK015601)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(BC003368)，tracle(U81030)，溶菌酶(BC002069)，铁蛋白H链(BC012314)，短小蛋白聚糖(X87096)，基质金属蛋白酶12(BC019135)，EIA-刺激的基因细胞抑制剂(AF084524)，S 100钙结合蛋白A9(BC027635)，MPS1蛋白(L20315)，转谷氨酰胺酶2(BC016492)，血清和糖皮质激素调节的蛋白激酶(AF139639)，RIKENcDNA 5830413L19(BC027496)，干扰素诱导的蛋白质(BC003804)，乳脂球膜蛋白EGF因子8(BC018577)，细胞表面糖蛋白p91(U83172)，精氨酸酶1(BC050005)，肿瘤坏死因子受体1(M59378)，类视黄醇诱导的丝氨酸羧肽酶(AF330052)，FLJ11000同源物(BC023802)，白介素-18结合蛋白d前体(AF110803)，氯化物通道7(AK009435)，CD36抗原(BC010262)，锌指蛋白同源物(BC030186)，糖结合蛋白35(J03723)，C-型钙依赖型糖(BC003218)，脂蛋白脂肪酶(NM_008509)，v-maf细纤维束纤维肉瘤癌基因(BC038256)，白介素7受体(NM_008372)，趋化因子(C-C)受体1(BC011092)，neurophilline(MGD|MGI106206)(AK002673)，SERPINA3G(XM_127137)，GABA-A受体亚基6(X51986)，LAPTm5(U51239)，G-蛋白信号调节剂(BC049968)，诱杀剂刺激性因子GPI固定的mRNA(L41366)，Y盒蛋白3(AK019465)，骨桥蛋白前体(J04806)，淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白-结合家族(AK021331)，T细胞受体β亚基类似物(U63547)，免疫相关核苷酸1(BC005577)，更高阶段转录因子1(NM_009480)，溴感受蛋白MOR267-7(NM_146714)，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(M12056)，破骨细胞癌抑制剂(AB013898)，血小板活性受体同源物(BC024054)，天然杀伤细胞蛋白2-A1(AF016008)，未鉴定的蛋白MGC36662(BC023851)，脑信号蛋白6A前体同源物(AK004390)，神经丝同源物多肽(BC025872)，马鞭草苷同源物肌动蛋白结合蛋白2A(BC026634)，溶质传递性家族6(BC015245)，暂时嘌呤受体P2Y10同源物(AK020001)，T细胞受体γ链(X03802)，多A聚合酶α(NM_011112)，OPA-相关蛋白OIP5类似物(AK017825)和mytogen激活的蛋白激酶1类似物(BC006708)组成的组。
2.一种分化调节剂，其调节从干细胞到未成熟天然杀伤细胞的分化，包含一种或多种基因作为有效成分，所述一种或多种基因选自由同源框蛋白MIX(AF15457)，前-原-蛋白酶3(U97073)，成髓细胞白血症(Myb)癌基因(M16499)，角蛋白复合物1，酸性，基因13(NM_010662)，PA-磷酸酶相关的磷酸酯酶(AK002966)，γ-parvin(BC011200)，forkhead-相关转录因子1C(AF330105)，RIKEN cDNA 5730501N20基因(AK017744)，c-myc蛋白(X010223)，核糖体蛋白L10A(AK002613)，Oct 2b基因(X53654)，microlite(AK015601)，二氢硫辛酰胺脱氢酶(BC003368)，和tracle(U81030)组成的组。
3.一种分化调节剂，其调节从未成熟天然杀伤细胞到天然杀伤细胞的分化，包含一种或多种基因作为有效成分，所述一种或多种基因选自由溶菌酶(BC002069)，铁蛋白H链(BC012314)，短小蛋白聚糖(X87096)，基质金属蛋白酶12(BC019135)，EIA-刺激的基因细胞抑制剂(AF084524)，S100钙结合蛋白A9(BC027635)，MPS1蛋白(L20315)，转谷氨酰胺酶2(BC016492)，血清和糖皮质激素调节的蛋白激酶(AF139639)，RIKEN cDNA 5830413L19(BC027496)，干扰素诱导的蛋白质(BC003804)，乳脂球膜蛋白EGF因子8(BC018577)，细胞表面糖蛋白p91(U83172)，精氨酸酶1(BC050005)，肿瘤坏死因子受体1(M59378)，类视黄醇-诱导的丝氨酸羧肽酶(AF330052)，FLJ11000同源物(BC023802)，白介素-18结合蛋白d前体(AF110803)，氯化物通道7(AK009435)，CD36抗原(BC010262)，锌指蛋白同源物(BC030186)，糖结合蛋白35(J03723)，C-型钙依赖型糖(BC003218)，脂蛋白脂肪酶(NM_008509)，v-maf细纤维束纤维肉瘤癌基因(BC038256)，白介素7受体(NM_008372)，趋化因子(C-C)受体1(BC011092)，和neurophilline(MGD|MGI106206)组成的组。
4.一种分化调节剂，其调节成熟天然杀伤细胞的分化，包含一种或多种基因作为有效成分，所述一种或多种基因选自由SERPINA3G(XM_127137)，GABA-A受体亚基6(X51986)，LAPTm5(U51239)，G-蛋白信号调节剂(BC049968)，诱杀剂刺激因子GPI固定的mRNA(L41366)，Y盒蛋白3(AK019465)，骨桥蛋白前体(J04806)，淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白-结合家族(AK021331)，T细胞受体β亚基类似物(U63547)，免疫相关核苷酸1(BC005577)，更高阶段转录因子1(NM_009480)，溴感受蛋白MOR267-7(NM_146714)，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(M12056)，破骨细胞癌抑制剂(AB013898)，血小板活性受体同源物(BC024054)，天然杀伤细胞蛋白2-A1(AF016008)，未鉴定的蛋白MGC36662(BC023851)，脑信号蛋白6A前体同源物(AK004390)，神经丝同源物多肽(BC025872)，马鞭草苷同源物肌动蛋白结合蛋白2A(BC026634)，溶质传递性家族6(BC015245)，暂时嘌呤受体P2Y10同源物(AK020001)，T细胞受体γ链(X03802)，多A聚合酶α(NM_011112)，OPA-相关蛋白OIP5类似物(AK017825)和mytogen激活的蛋白激酶1类似物(BC006708)组成的组。
5.权利要求1到权利要求4的任一个提出的分化调节剂，其中所述分化调节剂用于癌症的治疗。
6.在权利要求5中提出的分化调节剂，其中所述癌症选自由乳腺癌，黑素瘤和肺癌组成的组。
7.一种筛选基因的方法，所述基因调节从干细胞到天然杀伤细胞的分化，所述方法包括下列步骤1)在从细胞中分离总RNA后合成cDNA；2)在消化步骤1的cDNA后，分离标志物；3)连接在步骤2中分离的每个标志物，并接着分析其核苷酸序；和4)通过使用SAGE(基因表达的连续分析)分析程序，基于上面分析的核苷酸序列，量化基因的表达。
全文摘要
本发明涉及细胞分化调节剂，其包含一种基因作为有效成分，所述基因调节干细胞分化成天然杀伤细胞，更精确地，涉及包含调节干细胞分化成未成熟天然杀伤细胞的基因作为有效成分的细胞分化调节剂和通过使用SAGE筛选基因的方法。本发明的基因是一种新基因，其被证实不像调节干细胞分化成天然杀伤细胞的任何其它已知基因。尽管如此，所述基因可以容易地通过SAGE筛选，并且可以将包含所述基因作为有效成分的天然杀伤细胞分化调节剂有效地用作抗癌剂。
文档编号A61K38/00GK1910283SQ200580002771
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月20日 优先权日2004年1月20日
发明者崔仁杓, 姜馨植, 尹锡兰, 金银美 申请人:韩国生命工学研究院