通过基因治疗自行调控炎性细胞的凋亡的制作方法

专利名称：通过基因治疗自行调控炎性细胞的凋亡的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学与免疫学领域。更具体地，本发明涉及通过将一种诱导炎性细胞凋亡(程序性细胞死亡或非-坏死性细胞死亡)的基因导入所述细胞中，而诱导它们凋亡。
背景技术：
在很多炎性状况中，因炎性细胞的大量聚集和累积而使诸如IL-1β、IL-10、GM-CSF及TNFα等细胞因子过量产生(Brennan F．M．等人，BritishMedical Bulletin，1995，51／2，368-384)。炎性组织中细胞因子的增量调节和／或调节异常可能直接或间接造成慢性炎性疾病的恶化。例如，类风湿性关节炎(RA)的最具特征性病理出现在局部炎性部位(亦即，滑膜关节)。因此，似乎表示RA病患者的滑膜关节中所产生的细胞因子在疾病过程中起着重要作用。在这些细胞因子中，据信IL-1β及TNFα是造成破坏性软骨毁坏及成为RA特征之骨腐蚀的原因(Dayer J．M．等人，J．Exp．Med．，1985，162，1208-1215；Gowen M．等人，Nature，1983，306，378-380)。滑膜关节中过量IL-1β及TNFα的存在已显示会加速啮齿类中由胶原蛋白所诱导的关节炎的发展(Brennan F．M．等人，Clin．Expt．Immunol.，1994，97／1，1-3)。
凋亡是一种供胚胎发育及维持组织内环境稳定的基础生理过程(Raff，M．C．Nature，1992，356，397；Vaux，D．L. 等人，Cell，1994，76，777)。此重要自然过程中的不协调的特征是各种肿瘤、神经变性疾病与自身免疫性疾病的特征(Thompson，C. B．，Science，1995，267，1456)。涉及信号传导级联的生物化学属性相对较复杂且未能完全了解。各种刺激包括特异性受体例如TNFR 1或Fas的活化引发包括数种经编排以导致细胞死亡的信号成分的进化保守性执行机制(Ashkenazi，A．和Dixit，V．M．，Science，1998，181，1305)。
粒酶B为一种丝氨酸蛋白酶，主要发现于细胞毒性T淋巴细胞与自然杀伤细胞的胞质颗粒中。粒酶B在通过细胞毒性细胞介导的杀伤作用诱导靶细胞凋亡性改变中起着重要作用(Huesel J．W．等人，Cell，76，977-987，1994；Shi，L.等人，J．Exp．Med．，176，1521-1529，1992)，部分是通过催化数种凯氏酶(caspase)的裂解与活化而实现(Salvesen，G．S．和Dixit，V．M．，Cell，91，443-446，1997)，也可通过不依赖凯氏酶的途径而实现(Andrade，F．等人，Immunity 8，451-460，1998)。产生的粒酶B的结构属于多肽，该多肽含有通过失活的二肽(Gly-Glu)与活性粒酶B多肽分开的引导肽。与凯氏酶类似，粒酶B特异性地识别底物上的用于裂解的天冬氨酸。
TNFα是一种细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞及淋巴细胞在响应活化反应时合成。管理其表达的传统元件位于近侧或远侧启动子区中(综述于Pauli，U.，真核基因表达的重要综述，1994，4，323-344)。以下概述的是在TNFα启动子活性中起着重要作用的区a)所示的TNFα-应答性元件位于碱基对-100至-125之间。-108至-101bp区含有回文序列TGAGCTCA，其类似于含有PMA-应答性元件的AP-1序列。-125至-85bp区的多拷贝使对报道基因表达的诱导作用达7至11倍(Leitman，D．等人，J．Biol. Chem．266，9343，1991)。
b)所示的PMA-应答性元件出现于-101至-286碱基对之间(Hensel，G.等人，Lymphokine Res．8，347，1989)。
c)所示的抗-CD3抗体所诱导(以及Ca-离子载体所诱导)的应答性元件位于-118至-80碱基对之间。位于此区内的κB3(GGGTTTCTCC)序列对于通过Ca-离子载体TNFα启动子的CsA-敏感性活化作用具有高度重要性。就其自身的启动子来说，有人建议这些元件具有最佳功能(Goldfield，等人，J.Exp．Med．，178，1356，1993)。
d)在U937细胞中，PMA应答性元件位于-95至-36bp之间，而cAMP-应答性元件(CRE)经作图位于位置-107至-99bp之间。此区对PMA无反应(Economou，J．S．等人，J．Exp．Med，170，321，1989)。
e)所有三个κB部位[即κB1(-587至-577)、κB2(-210至-202)与κB3(-98至-87)]皆与病毒-诱导型蛋白质结合，然而这些部位的缺失并不影响病毒诱导性(Goldfield，A．等人，PNAS，87，9769，1990)。而且，κB位点的缺失突变株显示其并非人类TNFα基因受PMA刺激作用的主要标靶(Goldfield，A．等人J．Exp．Med．，174，73，1991)。
f)在鼠类系统中，TNFα启动子构建体-1059、-695及-655bp均为LPS强诱导型。此LPS-诱导性在-451bp构建中，尤其在-301至-241bp之间中大大降低。TNFα启动子的-1059bp片段在巨噬细胞中是沉默的，而经LPS刺激后强烈表达。活化作用的最大落差在-695至-655bp之间，其含有在鼠类TNFα启动子中的κB元件(Shakhov，A．N．等人，J．Exp．Med．，1990，171，35；Drouet，C．等人，J．Immunol.，1991，147，1694)。
已知TNFα基因3′非翻译区(3′UTR)中的元件对转录后调节十分重要。已在鼠类系统中对3′UTR的影响进行了分析，其中与同源启动子结合时，LPS诱导性非常强。使用鼠类TNFα启动子系统时显示，3′UTR有效地抑制三种非-巨噬细胞的细胞系，亦即HeLa、NIH3T3及L929中的CAT活性。序列TTATTTAT在3′UTR中重复出现数次，且推测其参与调节作用(Han，J．，等人，J．Immunology，1991，146，1843-1848；Crawford，F．K．，等人，J．Biol．Chem．，1996，271，22383-22390)。
各种细胞诸如活化的巨噬细胞、活化的T细胞、巨噬细胞样滑膜细胞以及成纤维细胞样滑膜细胞、转化的巨噬细胞样滑膜细胞(亦称为关节翳细胞)均出现在炎性关节中。一种称为关节翳的侵入性构造因滑膜细胞与关节翳细胞的增生而产生。关节翳可能是细胞过度增殖和／或这些细胞的凋亡减少所致。所示的这些细胞的增殖指数相对较低。因此，滑膜细胞过度增生可能是因滑膜内衬层凋亡的异常所致。滑膜中最终阶段凋亡的细胞出现的频率较低。据报导RA滑膜成纤维细胞中p53突变异常，其可能导致对凋亡的抗性。另外，滑膜组织中由位于软骨-关节翳连接处的各种类型的细胞，包括巨噬细胞谱系的细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、活化的T细胞及可能的成纤维细胞样滑膜细胞产生过量的促炎细胞因子，例如TNFα与IL-1β(Chu C．Q．等人，Arthritis ＆ Rheumatism，1991，34，1125-1132；Deleuran B．W．，等人，Arthritis & Rheumatism，1992，35，1170-1178)。这使炎性细胞长期渗入并产生更多促炎细胞因子与因子，其引起滑膜细胞增殖。除了上述炎性作用以外，TNFα在各种促炎病变中扮演着唯一且关键的角色。
TNFα诱导单核细胞中的IL-1β活性。事实上，抗-TNFα中和性抗体已显示出可减少IL-1β的总体生产水平(Portillo，等人，Immunol．，1989，66，170-175；Brennan，F．M．等人，British Medical Bulletin，1995，51／2，368-384)。因此，阻断炎性细胞因子TNFα的作用还有助于减少同样具破坏性的促炎介质IL-1β的产生。而且，已知TNFα是其他炎性-相关基因的转录活化剂。例如，TNFα的存在刺激产生其他细胞因子(例如GM-CSF)以及细胞表面受体，包括HLA II类抗原及粘附分子(Alvaro-Garcia J．M．，等人，J．Exp．Med．，1989，146，865-875)，其能使活化的T细胞与嗜中性粒细胞不断聚集，造成滑膜炎性及过度增生并最终导致软骨与骨骼的破坏增加(Allen J．B．，J．Exp．Med．，1990，171，231)。
对炎性疾病的传统疗法通常直接针对症状性发炎。此类疗法仅能暂时缓解而不能显著延迟疾病进程。相反地，针对TNFα及炎性过程中诱导的其它因子的疗法似乎更有希望。例如，在胶原蛋白诱导的关节炎动物模式中，抗-TNFα抗体及可溶性TNFα受体-IgG嵌合体有效地减少四肢肿胀、关节累及以及软骨和骨骼的破坏(Williams R. O．等人，Proc．Natl．Acad．Sci．，1992，89，9784-9788)。使用人源化抗-TNFα抗体和TNFα受体-IgG嵌合体分子进行的人体试验产生显著成果(Elliott M．J.，等人，Arthritis andRheumatism，1993，36，1681-1690；Elliott M．J.，等人，Lancet，343，1105-1110)。虽然以这些TNFα的拮抗剂进行的治疗似乎相当具耐受性，但其亦导致针对该重组蛋白之抗体的产生。因此，这些疗法可能不适合长期治疗，且无法使疾病得到真正减轻。
WO 97／07828公开了通过基因疗法治疗细胞累积或慢性炎性疾病之患者的方法，所述疾病为缺陷型凋亡-调节基因，更具体是p53所致。该治疗用连接至启动子的野生型基因恢复该缺陷，所述启动子驱动所述凋亡-调节基因的表达。
为实际改变疾病的进程，须用TNFα-特异性疗法连续靶定TNFα。此类连续治疗方案不能用这些生物试剂实施，且长期给药十分困难。
另一种治疗观点中，可用手术(Herold N．和Schroder H. A．，ActaOrthop．Scand.，1995，66，252-254；Ogilvie-Harris D．J．和Weisleder L．，Arthroscopy，1995，11，91-95)、化学药物(Cruz-Esteban C．和Wilke W．S．，Bailliere，s Clinical Rheumatol．，1995，9，787-801)或放射性诱导的滑膜切除术(Cruz-Esteban C．和Wilke W．S．，Bailliere’s Clinical Rheumatol．，1995，9，787-801)，将已发炎的滑膜去除。关节内视镜手术勉强得到良好结果。非-手术型滑膜切除术是使用各种化学试剂，例如锇酸、烷基化试剂如氮芥子气和硫替哌、氨甲蝶呤而进行。不幸地，非-手术型滑膜切除术(包括化学药物及放射性诱导的)在程序上颇复杂，仅提供短期缓解，并显示仅使滑膜增生部分减小。而且，大多数非-手术型替代方法均是可能的致畸物。而且，先天性炎性应答是随化学或手术介入所造成的组织伤害而产生的。最后，应注意这些途径具有通常与常规药物治疗以及侵袭性手术过程相关的危险与副作用，包括住院与复原的高额费用及不便。
因此，仍需要对一般炎性疾病，特别是RA进行治疗的有效治疗方法。
发明概述本发明提供与TNFα产生细胞的新的凋亡诱导型破坏相关的方法及组合物。因此，本发明的一个目的在于提供独特的嵌合核酸分子，该核酸分子具有至少一个连接至TNFα启动子上的TNFα启动子增强子区(包含核酸SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12或其保守性取代或等位基因变体)，所述TNFα启动子进一步连接至编码粒酶B蛋白的核酸序列或其保守性取代或等位基因变体上，后者进一步连接到3′UTR核酸序列上。
本发明的另一目的在于提供TNFp-AIG及类似嵌合核酸构建体、它们的制备方法、它们的应用方法及包含它们的制剂。
本发明的另一目的在于提供通过对需要此类治疗的患者施用药物有效量的含有本文所述嵌合核酸分子的组合物，以治疗炎性疾病的方法。
本发明的又一目的在于提供诱导用TNFp-AIG嵌合核酸分子转染之细胞凋亡的方法、体外选择群体中不产生TNFα的体细胞变体的方法、鉴定决定着生产不产生TNFα之细胞群的显性／失活基因的方法，及鉴定决定着调节TNFα的产物的方法。
本领域技术人员将可基于下列本发明之详述，而容易地明了这些及其他目的。
附图简述

图1是本发明TNFp-AIG嵌合核酸的示意图。其中的凋亡诱导基因(AIG)为粒酶B。
图2是表示用本发明的TNFp-AIG嵌合核酸进行基因疗法结果的示意图。
图3是以萤光素酶基因(Luc)表达作为报道系统鉴定TNFα启动子的诱导型顺式元件时所用的缺失构建体的概述。
图4(a)显示用于评估萤光素酶基因表达而进行的代表性实验结果，所述萤光素酶基因表达是由瞬时转染的Jurkat细胞中的TNFα启动子的缺失构建体所驱动的。柱状图代表作为活化剂PMA之诱导性量度的刺激指数。Jurkat细胞在用PMA刺激后产生TNFα。
图4(b)显示用于评估萤光素酶基因表达而进行的代表性实验结果，所述萤光素酶基因表达是由瞬时转染的THP-1细胞中的TNFα启动子的缺失构建体所驱动的。柱状图代表作为活化剂LPS之诱导性量度的刺激指数。THP-1细胞在LPS刺激后产生TNFα。
图5是用TNFα启动子与粒酶B的所选天然元件制备TNFpGB的流程图。
图6(a与b)提供为观察嵌合TNFp-粒酶B(TNFpGB)的表达而进行的代表性实验结果概述。TNFpGB构建体的各种克隆的表达在瞬时转染的Jurkat细胞中进行(图6a)。粒酶B的表达通过用抗粒酶B抗体进行Western印迹分析而评估。表示转染细胞中粒酶B的条带以箭头表示。TNFpGB嵌合核酸的表达对凋亡的诱导作用通过对Jurkat细胞的瞬时转染进行评估(图6b)。通过细胞死亡ELISA评估凋亡。在这两项实验中，具有稀疏点的柱状图代表未刺激的对照组，其中用所示的嵌合核酸对细胞进行转染，而转染的细胞未用PMA刺激。实心柱状图代表在对照组转染(用-1005Luc3′UTR转染)或表达粒酶B的嵌合核酸中，用PMA刺激后对凋亡的诱导作用。
图7(a与b)是本发明TNFp-AIG嵌合核酸的示意图，其包含多拷贝的依次驱动AIG表达之TNFα启动子的诱导型顺式元件(图7a)。TNFp-AIG嵌合核酸的示意图，其包含多拷贝的驱动AIG表达的TNFα启动子的诱导型顺式元件，其下游为TNFα基因的3′非翻译区(TNF3′UTR)(图7b)。TNFα基因的3′UTR与调节TNF α基因的诱导型表达有关(Han，J．，等人，J．Immunology，1991，146，1843-1848；Crawford，E. K．等人，J．Biol．Chem．，1997，272，21120-21137，及图9)。
图8(a与b)是制备TNFα超启动子-粒酶B嵌合构建体的流程图。
图9显示两组实验结果，这些结果显示TNF3′UTR对萤光素酶报道基因的诱导型表达的调节作用。瞬时转染在成纤维细胞系中完成。有点的柱状图代表T在缺乏TNF3′UTR时NFpLuc的诱导性，实心图代表在存在TNF3′UTR时TNFpLuc的诱导性。在Jurkat细胞中得到类似的结果。
图10图示在TNFα产生细胞群中筛选不产生TNFα的体细胞变体，并鉴定决定着抑制TNFα产生的显性失活(DN)抑制基因。
图11(a)是TNF α启动子的已鉴定的增强子区(ER)ER1(SEQ ID NO4)、ER2(SEQ ID NO5)、ER3(SEQ ID NO11)与ER4(SEQ ID NO12)及两个拷贝的上述ER在天然-120TNFα启动子上游的插入的示意图。
图11(b)显示为评估天然-120 TNFα启动子所驱动的萤光素酶基因的表达而进行的实验结果，两拷贝的增强子区ER1、ER2、ER3与ER4连接至其5′端。萤光素酶基因的构建体驱动的表达在瞬时转染的Jurkat细胞中进行。柱状图代表作为活化剂PMA之诱导性量度的刺激指数。在用PMA刺激后，Jurkat细胞产生TNFα。
图11(c)显示为评估天然-120 TNFα启动子所驱动的萤光素酶基因的表达而进行的实验结果，两拷贝的增强子区ER1、ER2、ER3与ER4连接至其5′端。萤光素酶基因的构建体驱动的表达在瞬时转染的THP-1细胞中进行。柱状图代表作为活化剂LPS之诱导性量度的刺激指数。在用LPS刺激后，THP-1细胞产生TNFα。
图12是嵌合核酸-706TNFpGB3′UTR序列的示意图，其中启动子片段序列以小写字母表示，接头片段序列以大写斜体字母表示，粒酶B片段序列以大写字母表示，而TNFα3′UTR片段序列以加下划线的小写字母表示。
图13是嵌合核酸-1005TNFpGB3′UTR序列的示意图，其中启动子片段序列以小写字母表示，接头片段序列以大写斜体字母表示，粒酶B片段序列以大写字母表示，而TNFα3′UTR片段序列以加下划线的小写字母表示。
发明详述本发明通过提供用于治疗组合物中的新嵌合核酸分子及该组合物的应用方法而解决本领域中所存在的缺点。将所述组合物用于选择性诱导TNFα产生细胞的凋亡，引起这些细胞的毁坏。
本文所用的缩写3′UTR意指3′非翻译区。
缩写“AIG”意指凋亡诱导基因。AIG包括粒酶B。
缩写“CsA”意指环孢菌素A，一种具有免疫抑制特性的生物活性真菌代谢产物。
缩写“DN”意指对其他基因或基因产物的表达或功能具有负面作用的显性失活基因产物。
缩写“ER”意指增强子区，其中ER1具有SEQ ID NO4，ER2具有SEQ ID NO5，ER3具有SEQ ID NO11，而ER4具有SEQ ID NO12。
缩写“GB”意指粒酶B。
缩写“PMA”意指肉豆蔻酰佛波醇乙酸酯。
缩写“RA”意指类风湿性关节炎。
缩写“TNFα”意指肿瘤坏死因子α。
术语“TNF启动子”、“TNFα启动子”与“TNFp”在本文中可交替使用。除非反指，这些术语意指对应于连接到一或多个上游增强子元件的天然TNFα最小启动子序列的完整核苷酸序列，所述增强子元件为天然存在、天然的或在实验室中经遗传工程改造的。
氨基酸“取代作用”定义为具有一对一的氨基酸取代。当取代氨基酸具有相似结构和／或化学性质时，它们的本质是保守的。保守取代的实例为用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用丝氨酸取代苏氨酸。
“保守性变体”意指多肽中氨基酸的取代。
“等位基因变体”意指由于保守或非-保守性取代作用，产生不同形式的相同基因，而导致核酸及蛋白质水平上的变异。
“报道者”分子为用于标记核酸或氨基酸序列的化学成分。它们包括，但不限于，放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂。报导者分子与特定核酸序列或氨基酸序列相联，确立其存在，并能定量之。
“报道基因”为编码功能性蛋白质如萤光素酶的核酸及其片段，所述功能性蛋白质可用于分析异源启动子的活性。
多核苷酸或核酸的“功能性片段”包含具有较少核苷酸、可用作足以引发基因转录或编码多肽的功能性亚单位的遗传物质的核苷酸序列的全部或任何部分。
本发明是基于证据某些炎性疾病中炎性细胞的凋亡具有治疗意义。本发明具体涉及通过基因疗法自行调控凋亡。广而言之，在实施本发明时，将包含与最小启动子的至少一个功能性拷贝连接的至少一个启动子增强子的嵌合核酸(所述启动子是在炎性细胞中或在发炎部位的细胞中活化的基因或基因组合)连接至凋亡-诱导基因(AIG)的至少一个拷贝上，以使该AIG的表达受该启动子驱动，从而靶向炎性细胞。在炎性作用中活化的诱导型基因的启动子包括TNF α启动子的核酸序列及其保守性取代或等位基因变体。本发明的嵌合核酸包含增强子、启动子、及以直接、远端、或近端(及其组合形式)连接的AIG元件。如上所述及以下将更详述的，在某些实施方案中，用多拷贝的增强子、启动子、和或AIG以获得最大功效。
为了更全面地了解本发明，进行以下详细说明，其中仅为了说明的目的，将重点放在包含至少一TNFα启动子增强子的嵌合核酸分子上，所述启动子增强子连接至最小TNFα启动子的至少一个功能性拷贝上且进一步连接至AIG的至少一个拷贝上。虽然随后的实施例亦使用这些类型的结构，本领域技术人员应了解，本文所述的基本构建体可替换以提供其它利用本发明产物、过程、方法及组合物的实施方案，在这些实施方案中用到含有在发炎过程中活化的诱导型基因如上文所列的类型的、呈现类似功能的其它启动子，其可用于靶向感染部位中的细胞。
凋亡-诱导基因(本文中有时称为AIG)是由TNFα启动子(TNFp)或在炎性过程中活化的其它诱导型基因所驱动。在一实施方案中，选择性诱导能产生TNFα的那些细胞凋亡。采用常规基因疗法技术，可方便地体内导入TNFp-AIG或其它嵌合核酸。有利地，在嵌合核酸为TNFp-AIG的实施方案中，其仅在产生炎性细胞因子TNFα的细胞中表达。此外，因为TNFp-AIG嵌合核酸含有TNFα启动子元件，其亦可结合多个可诱导的、TNFp-选择性转录因子。这种结合作用导致TNFα的内源性产生减少。本发明特别涉及TNFp-AIG及类似的基因构建体、含有嵌合核酸的细胞、在用嵌合核酸转染的细胞中诱导凋亡的方法、含有嵌合核酸的药物组合物、在产生TNFα的细胞群及其它类似群体中筛选出不产生TNFα的体细胞变体的体外筛选方法、鉴定决定着抑制TNFα产生的显性失活／显性抑制基因的方法、以及使用该嵌合核酸进行治疗的方法。
为清楚说明以下所例举的本发明TNFp-AIG嵌合核酸，对下列序列进行说明SEQ ID NO1为对应于全长、参照人类TNFα启动子序列的公开的核苷酸序列(Takashiba S.，等人，Gene，1993，131，307-308)。本文所用的核苷酸号意指该序列的编号。
SEQ ID NO2为用于本发明的基因的天然TNFα启动子序列(自转录起始点(TSS)的-1077位核苷酸)。SEQ ID NO1与SEQ ID NO2的TNFp序列有些许差异。TNFα启动子的核苷酸序列上的这类差异已被报导过(Takashiba S．，等人，Gene，1993，131，307-308)。
SEQ ID NO3为天然最小TNFα启动子序列(核苷酸-120至-TSS)，其包括至少一个增强子元件(k3部位)；参见Pauli，U．，真核细胞基因表达的重要综述，1994，4，323-344；Rhoades K．L.，等人，J．Biol. Chem．，1992，267，22102-22107；以及Takashiba S．，等人，Gene，131，307-308)。
SEQ ID NO4为包含核苷酸-1005至-905的TNFα启动子的增强子区1(ER1)。
SEQ ID NO5为包含核苷酸-706至-517的TNFα启动子的增强子区2(ER2)。
SEQ ID NO6为在-120pGL3构建体中位于-120最小TNFα启动子上游的经遗传工程加工的附加多克隆位点(MCS)。
SEQ ID NO7为TNFα基因的3′非翻译区(3′UTR)(Medwin，G．E．，等人，Nucleic Acid Research，1985，13，6361-6373)。
SEQ ID NO8为全长的粒酶B。
SEQ ID NO9为截短的粒酶B，缺乏编码引导肽及失活二肽的核苷酸。
SEQ ID NO10为全长的粒酶B，含有编码引导肽的核苷酸，但缺乏编码失活二肽的核苷酸。
SEQ ID NO11为包含核苷酸-234至-120的TNFα启动子的增强子区3(ER3)。
SEQ ID NO12为包含核苷酸-234至-65的TNF·α启动子的增强子区4(ER4)。
SEQ ID NO13为嵌合核酸-706TNFpGB3′UTR。
SEQ ID NO14为嵌合核酸-1005TNFpGB3′UTR。
用于制备本发明嵌合核酸构建体的TNFα启动子的元件选自能诱导受该TNFα启动子驱动的治疗基因表达的元件。这些启动子元件在本文中指TNFα启动子的“诱导型顺式元件”、“顺式诱导型元件”或“增强子元件”。
增强子元件可与最小启动子序列物理连接，或通过可以具有或不具有单一限制性位点的接头序列与该最小启动子序列分开。因此，如上所述，增强子元件可直接、远端、或近端、或以它们的任意组合形式连接至本发明的嵌合核酸上。这些元件通常在启动子的上游构建。TNFα增强子元件的实例示于SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO11及SEQ ID NO12中；可使用其功能性片段或变体和组合。本发明的某些优选基因构建体包括具有多拷贝数(亦即，二或更多拷贝数)的增强子元件的基因。某些实施方案具有约2至25，更窄2至10，甚至更窄2至5个拷贝。
术语“TNF启动子”、“TNF α启动子”与“TNFp启动子”于本文中可交替使用。除非反指，这些术语意指对应于连接至一或多个上游增强子元件(其为天然存在即天然的、或在实验室中经遗传工程改造的)的天然TNFα最小启动子序列的完整核苷酸序列。实例包括，但不限于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2与SEQ ID NO3、及这些中任一的功能性片段、变体与混合物。本文所述这些TNFα序列及其它序列的很多功能性片段及变体，与它们的天然相对物及遗传工程改造的相对物有至少约80％、有时超过90％的序列同源性，但这些已为本领域技术人员已知且定义在本文所引述的参考文献中。
本发明提供新的治疗方法，其包括将包含由TNF α启动子(TNFp)所驱动的凋亡-诱导基因(AIG)的嵌合核酸导入哺乳动物细胞中的步骤。本发明嵌合核酸的实例示于SEQ ID NO13与14中；也可使用它们的功能性片段或变体。不想受理论的限制，作为受TNFp控制的结果，AIG仅在产生炎性细胞因子TNFα的那些细胞中表达。因此，任何表达TNFα的细胞将会自行毁坏，而不表达TNFα的细胞将不受到影响。有利地，此方法可靶向任何产生TNFα的细胞，如活化的巨噬细胞、活化的T细胞、巨噬细胞样、成纤维细胞样滑膜细胞以及存在于RA关节中的初级细胞。事实上，所靶向的产生TNFα的细胞可以是通常携带(或不携带)或表达(或不表达)天然、未改变形式的凋亡基因的细胞。因此，使用本发明的嵌合核酸及方法，TNFα的细胞来源可以以强选择性方式被破坏。
使用本发明TNFp-AIG嵌合核酸的另一项优点为，TNFp结合了多个内源性TNFp所需的转录因子，从而导致内源性TNFα的产生减少。在一实施例中，TNFp过量存在于治疗所靶向的细胞中。这可通过将多拷贝转染基因导入该细胞中而完成。可供选择地，本发明的TNFp-AIG嵌合核酸可含有TNFα启动子的多拷贝的诱导型顺式元件。如上所述，在本发明TNFp-AIG嵌合核酸的某些实施方案中存在TNFp的多拷贝“诱导型增强子元件”。通过包括TNFp构建体的多拷贝诱导型顺式元件，转染细胞产生TNFα所需的转录因子可被外源导入的序列结合。这一优选嵌合TNFp-AIG构建体的特征在于，其与仅含有与TNFp连接的单一增强子元件的本发明嵌合核酸相比，在竞争TNFp-特异性转录因子方面的效率增加。以此方式构建的“诱导型超级启动子”能够(1)更有效竞争TNF α特异性诱导型转录因子及(2)通过多个增强子元件以扩增的方式驱动凋亡-诱导基因的表达。
在类风湿性关节炎患者中，滑膜切除术(亦即去除滑膜组织)已显示具有临床意义。与传统及外科手术滑膜切除程序不同，本文所述的细胞-靶向治疗方法仅能靶向产生TNFα的细胞。因此，有利地的是，TNFp-AIG嵌合基因的导入与表达及后续诱导凋亡并不诱导炎性反应。因此，本发明的方法相对较具选择性，并导致最少组织损伤及缓解炎症。
本文所述的产物及方法亦可用于治疗其它炎性病症。此类炎性病症包括但不限于多发性硬化、急性热病性多神经炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、牛皮癣、移植物排斥宿主疾病、红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、牛皮癣性关节炎、结节病、过敏性肺炎、关节强硬性脊椎炎及相关的脊椎关节炎、Reiter’s综合征及全身性硬化。因此，本发明包含治疗炎性疾病患者的方法，其是将药物有效量的含有本发明嵌合核酸的药物组合物施与需要该治疗的患者。通过在患者的炎性细胞或炎性部位的细胞中导入至少一种本发明的嵌合核酸而诱导这类细胞凋亡。这通常通过制备含有至少一种本发明的嵌合核酸并通常含有一种药物可接受载体的药物组合物，并用本领域技术人员已知的标准方法将该组合物施与患者而完成。可使用局部、静脉内、腹膜内及类似方法直接将药物组合物递送至炎性部位。下面将讨论其它方法。
除了治疗外，本发明的嵌合核酸可用于各种有效的筛选及选择方法中。在一个这样的方法中，可通过将TNFp-AIG嵌合核酸导入产生TNFα的细胞群中，而在产生TNFα的细胞群中体外选择出不产生TNFα的体细胞变体。产生TNFα的细胞将进行凋亡程序。不产生TNFα的细胞将存活。对那些具有存活表型的细胞变体的选择是鉴定不产生TNFα的细胞的容易途径。这类筛选方法可用于测定反式调节TNFα启动子活性并因此减少TNFα产生的基因的表达。这些基因的特征为在其它系统中为显性失活(DN)／显性抑制基因(Behrends S．，等人，J．Biol. Chem．，1995，270，21109-21113；Zhang S．，等人，J．Biol．Chem．，1995，270，23934-23936；Watowich S．S．，等人，Mol．Cell Biol. 1994，14／6，3535-3549)。
在另一体外方法中，本发明的TNFp-AIG嵌合核酸可用于鉴定决定着不产生TNF之细胞群的产生的显性失活基因。根据此方法，将本发明的TNFp-AIG嵌合核酸导入产生TNFα的细胞中。除存在显性失活基因之外，那些细胞应在活化后应进行凋亡程序。因此，可推论出，存活的变体具有能够减量调节TNFα产生的显性失活基因。显性失活基因可通过产生cDNA文库并转染细胞系(例如，Jurkat与THP-1)而容易鉴定。这些细胞为诱导型TNFp-AIG嵌合核酸或TNFp-萤光素酶基因的稳定转染体。在体外活化后，筛选TNFp-AIG转染的细胞的存活表型；存活表型为DN基因功效的表征。在经TNFp-荧光素酶基因转染的细胞中，萤光素酶活性减少为DN基因功效的表征。用此方法鉴定的显性失活基因本身可用作进一步的治疗剂。这些基因将是为减少TNFα产生而进行的基因疗法的候选者。
用于基因转移的方法分为两大类1．直接方法用适宜载体作为治疗基因的载体，将治疗基因原位转导至靶细胞如滑膜细胞中。将该含有治疗基因的载体直接注射入受感染区(例如关节炎的关节)中。
2．间接方法将治疗基因来自体内地转染至靶细胞如滑膜细胞中。在这一方法中，从关节中取出滑膜，分离滑膜细胞并在体外培养。将体外培养的细胞用治疗基因转染，并将经遗传修饰的滑膜细胞重新移植入滑膜中。
为进行体内转移，评估了数种载体的基因递送功效(Nita，等人，Arthritis&Rheumatism，1996，39／5，820-828)。在基因疗法所用载体中，到目前为止开发最好的是衍生自逆转录病毒的载体。它们能将遗传物质插入宿主基因组中，并产生稳定的转染子。但是，这些载体无法感染非分裂细胞，因为它们是被插入宿主基因组中，无法排除发生插入突变的可能性。相比之下，衍生自腺病毒的载体感染分裂的及非分裂的细胞，并以附加体的形式递送DNA。基于腺病毒的载体的缺点在于，这些载体在感染细胞中持续产生病毒蛋白，而使它们可能具有抗原性。第三种类型的基于病毒的载体衍生自单纯疱疹病毒(HSV)，其也能感染分裂及非分裂的细胞。
在非-病毒性载体系统中，业已评估阳离子脂质体及裸露的质粒DNA。脂质体处于最先进的发展阶段，尽管某些特定细胞例如肌肉与皮肤吸收、保留并表达裸露的质粒DNA。
亦可能使用颗粒-介导的基因-递送系统(Rakhmilevich，等人，PNAS，1996，93，6291)，且其为有希望的途径。
下列“体内”基因递送程序可用于递送本发明的嵌合核酸(1)Nita等人，Arthritis and Rheumatism，1996，39，820-823兔子体内实验将各载体经关节内注射方式注入一膝关节中。就病毒性载体而言，每膝盖注射108至109个悬浮于0．5毫升平衡盐溶液中的颗粒。
每膝盖注射于1毫升平衡盐溶液中的脂质体-DNA复合物(与20微克DNA／毫升复合的200纳摩尔DC-Chol)。(2)分子医学方法基因治疗方法，Paul Robbins编著，1997，Barr等人，第205-212页。
基于腺病毒的载体向肝细胞递送大鼠肝细胞1×1011PFU存在于每100克体重动物中。
在狗(12-17千克)中，门静脉灌注约1．5×1011PFU／千克，使宿主的每份双倍体拷贝中存在1个腺病毒基因组拷贝。
在兔子(2-4千克)中，用1．5×1013个病毒颗粒(约1．5×1011PFU)100％转导肝细胞；用4×1012个病毒颗粒转导50-75％。Yang N-S，等人，281-296金粒子-介导的基因递送哺乳动物皮肤组织的转染-0．1、0．5、1．0及2．5微克DNA／毫克粒子的转染作用与转基因表达水平线性相关。Nabel，等人，297-305人体中的脂质体-介导的基因递送方案1将15 nmol DC-Chol／Dope脂质体与1μg·DNA混合成0．7ml。将0．2ml上述混合物注射入患者的黑素瘤结节中。就导管递送而言，是将0．6ml溶液递送入动脉中。
方案2将15 nmol DMRIE／Dope脂质体与5μgDNA混合成1．0ml。
对于直接肿瘤内注射，DNA浓度范围是介于与4．5nM DMRIE／Dope复合的3μg至与450nMDMRIE／Dope复合的300μg之间。(3)Roessler，等人，369-374至滑膜的基因转移使用剂量范围为109-1012个含有治疗基因的腺病毒颗粒／关节。然而，任何具体的实验系列的最适剂量需要根据经验决定，并取决于所用重组腺病毒基因组骨架以及所表达的转基因的特性。
就间接方法而言，已有多种成熟方法，包括利用基于阳离子脂质或阳离子聚合物的转染法及电穿透法。
可根据本领域技术人员的具体需要改变上述任何技术。这些改变是普通技术人员水平范围内毋需过度实验就能完成的。这些明显的变化包括在本发明的范围内。
实施例为了更完全了解本发明，提出下列实施例。这些实施例是为举例说明本发明的一些优选实施方案，决非以任何方式构成对本发明范围的限定。
用包含TNFα启动子的各种缺失构建体的引物经聚合酶链式反应(PCR)扩增TNFα启动子区(图3)。将由其它研究者于各种其它细胞系统中所鉴定得的区用作参考(Rhoades，等人，J．Biol．Chem．，1992，267，22102-22107；Leitman，等人，Mol．Cell Biol．，1992，12，1352-1356；Pauli U．，真核细胞基因表达的重要综述，1994，4，323-344)。然后将经PCR-扩增的基因克隆于市售无启动子的载体中的报道基因(例如萤光素酶)的上游。测试这些构建体于各种细胞系，例如Jurkat(T类淋巴母细胞)、U973(骨髓单核细胞)、THP-1(单核细胞)、成纤维细胞及体外培养的人类滑膜细胞中的其组成型与诱导型表达。对报道基因诱导型表达决定区的鉴定，主要是根据使用两种产生TNFα的细胞系，亦即Jurkat(用PMA刺激后)与THP-1(用LPS刺激后)所获得的结果(图4a与b)。将这些细胞通过成熟的方法及市售试剂例如DEAE葡聚糖与Superfect进行瞬时转染。然后将决定着该报道基因的诱导型表达的TNFα的启动子顺式元件用于构建TNFp-粒酶B嵌合核酸。TNFp-粒酶B嵌合核酸的构建将从维持于含IL-2培养基中的PHA／抗-CD3-活化并人外周血淋巴细胞获得的寡-dT-引导的cDNA作为模板来扩增粒酶B编码区。使用对应于密码子1-7、及21-27的有义引物扩增全长粒酶B(SEQ ID NO8)或截短形式的粒酶B(SEQ ID NO9)。在两次扩增中所用的反义引物相同，以得到对应于直至终止密码子，亦即248位残基的产物。二肽-缺失型粒酶B构建体(SEQ IDNO10)用全长粒酶B(SEQ ID NO8)作为模板而制备。使用对应于密码子19和20(失活二肽)的六个核苷酸两侧(但不包括它们)上的侧翼15个核苷酸作为致突变的有义或反义引物产生缺失。构建体用QuickChange诱变试剂盒(Stratagene)制得。通过置换TNFα启动子的-706缺失构建体和-1005缺失构建体中的萤光素酶，将编码二肽-缺失型粒酶B的核酸片段亚克隆至TNFα启动子的下游(图5)。将TNF α基因的完整3′非翻译区(SEQ ID NO7)经PCP-扩增，并插入到受TNFα启动子的-706和-1005缺失片段所驱动、编码二肽-缺失的粒酶B基因的核酸片段的下游。嵌合核酸的完整序列示于SEQID NO13及14中。TNFα超级启动子-粒酶B嵌合核酸的构建将TNF α启动子中含有决定着上述报道基因诱导型表达的元件的两处宽范围优选区，亦即ER1(-1005至-905)(SEQ ID NO4)、ER2(-706至-517)(SEQ ID NO5)(图4a与4b)经PCR-扩增，并连接至最小天然启动子(-120经过TSS，SEQ ID NO3)的上游，呈单拷贝或多拷贝的形式。TNFα启动子的另两区ER3(-234至-120)(SEQ ID NO11)及ER4(-234至-65)(SEQ IDNO12)也已鉴定为可利用下述方案而应用于嵌合构建体中的增强子区。超级启动子包含上述含诱导型启动子元件的区域的多个(2-10)盒(图7)。这可通过用已在各引物5′端插入的限制位点而合成的引物对目的区域进行PCR-扩增而获得。这些独特的限制位点在所扩增目的基因产物的侧翼。优选地，将经PCR扩增的AIG克隆于该TNFα超级启动子的下游，以取代所述天然TNFα启动子的原始构建体中的萤光素酶报道基因(图5)。
用于构建TNF α超级启动子，及代表用于有效定向插入的独特限制位点(这些限制位点不存在于TNFα启动子与粒酶B的所选元件中)的接头序列的流程概述如下并描绘于图8中流程1步骤1TNFα最小启动子序列(-120至TSS)插入pGL3基本(无启动子)萤光素酶载体(Promega)中用于构建嵌合核酸TNFp-AIG的pGL3基本载体元件如下所示＿ KpnI．SacI．MluI．NheI．SmaI．XhoI.BglII.HindIII．[萤光素酶]．XbaI＿使用含有XhoI与BglII．HindIII位点的引物经PCR扩增最小启动子，以使XhoI位于扩增产物的5′端，而BglII.HindIII位点3′端。使用这些相同限制位点，将此片段插入pGL3基本载体的多接头中。此构建体称为“构建体Al”，且为如下＿KpnI．SacI．MluI．NheISmaIXhoI．(-120至TSS BglII)．HindIII．[萤光素酶]．XbaI＿步骤2用含有数个限制位点的引物将增强子片段(ER1、ER2、ER3或ER4)经PCR扩增。所得片段在5′端有限制位点KpnI.AatII．BssHII，在3′端有NsiI．SpeI．MluI，如下5′KpnI.AatII.BssHII．(ER1、ER2、ER3或ER4).NsiI．SpeI．MluI 3′。将该片段使用KpnI与MluI限制位点插入步骤1中所产生的“构建体Al”中。此构建体称为“构建体Bl”，如下＿KpnI．AatII．BssHII．(ER1、ER2、ER3、或ER4)．NsiI．SPeI．MluI．NheI．SmaI．XhoI．(-120至TSS BglII).HindIII．[萤光素酶]．XbaI__步骤3用含有限制位点AatII与BssHII的引物将TNFα增强子片段(ER1、ER2、ER3或ER4)进行扩增，以产生如下的PCR产物5′AatII．(ER1、ER2、ER3、或ER4)．BssHII3′。使用这些相同限制位点将此片段克隆入“构建体Bl”中。此构建体称为“构建体Cl”，如下＿KpnI．AatII．(ER1或ER2)．BssHII．(ER1、ER2、ER3或ER4)．NsiI．SpeI．MluI．NheI．SmaI．XhoI．(-120至TSS BglII)．HindIII．[萤光素酶]．XbaI__步骤4使用含有限制位点NsiI与SpeI的引物，将TNF·α增强子片段(ER1、ER2、ER3、或ER4)进行扩增，以产生如下的PCR产物5′NsiI．(ER1、ER2、ER3、或ER4)．SpeI3′。使用这些相同限制位点将此片段克隆入“构建体Cl”中。此构建体称为“构建体Dl”，如下＿KpnI．AatII．(ER1、ER2、ER3或ER4)．BssHII．(ER1、ER2、ER3或ER4)．NsiI.(ER1、ER2、ER3、或ER4)．SpeI．MluI．NheI．SmaI．XhoI．(-120至TSS BglII)．HindIII．[萤光素酶]．XbaI＿步骤5使用含有BglII与XbaI限制位点的引物，将粒酶B编码区进行PCR扩增，产生如下的片段5′EcoRI．BglII．[粒酶B]．XbaI3′。使用BglII与XbaI将此片段插入“构建体Dl”中。所得构建体称为“构建体El”，如下＿KpnI．AatII．(ER1、ER2、ER3或ER4)．BssHII．(ER1、ER2、ER3或ER4)．NsiI.(ER1、ER2、ER3或ER4)．SpeI.MluI．NheI．SmaI．XhoI．(-120至TSSBglII)．(粒酶B)．EcoRI XbaI＿可供选择地，流程图2如下流程2步骤1如流程图1一样产生“构建体A1”，如下KpnI．SacI．MluI．NheI．SmaI．XhoI．(-120至TSS BglII)．HindIII．[萤光素酶]．XbaI步骤2附加多克隆位点(SEQ ID NO6)的插入。使用市售来源合成两种提供＿NheI．SacII．EcorV.AflII．AatII.AvrII．SpeI．PvuII．XhoI的互补寡核苷酸(5′磷酸化的)。使这些寡核苷酸退火，然后克隆入“构建体A1”的NheI与XhoI位点中。所得构建体称为“构建体B2”，如下＿KpnI.SacI．MluI．NheI．SacII．EcorV．AflII．AatII．AvrII．SpeI．PvuII．XhoI．(-120至TSS BglII).HindIII．[萤光素酶]．XbaI＿步骤3将TNFα增强子片段(ER1、ER2、ER3或ER4)用5′端有限制位点SpeI．PvuII且3′端有XhoI的引物进行扩增，以产生如下的PCR产物5′SpeI．PvuII．(ER1、ER2、ER3或ER4)．XhoI 3′。使用SpeI与XhoI限制位点将此片段克隆入“构建体B2”中。此构建体称为“构建体C2”，如下KpnI．SacI．MluI．NheI．SacII．EcorV．AflII．AatII．AvrII．SpeI．PvuII．(ER1、ER2、ER3或ER4)．XhoI．(-120至TSS BglII)HindIII．[萤光素酶]．XbaI＿步骤4将TNFα增强子片段(ER1、ER2、ER3或ER4)用5′端有限制位点AvrII．SpeI且3′端有PvuII的引物进行扩增，以产生如下的PCR产物5′AvrII．SpeI．(ER1、ER2、ER3或ER4)．PvuII 3′。将此片段使用AvrII与PvuII限制位点克隆入“构建体C2”中。此构建体称为“构建体D2”，如下KpnI．SacI．MluI．NheI．SacII．EcorV．AflII．AatII．AvrII．SpeI．(ER1、ER2、ER3、或ER4)．PvuII．(ER1、ER2、ER3或ER4)．XhoI．(-120至TSSBglII)．HindIII．[萤光素酶]．XbaI＿因此，应用此方案，通过在所选增强子区域的PCR扩增中使用位于前一个位点上游的另一个限制位点，可以一次一个地加入至少7个拷贝的增强子区(ER1、ER2、ER3或ER4，各别地或以组合形式)。一旦加入所希望拷贝数的增强子区后，如流程图1的步骤5中所述，将AIG插入该超级启动子的下游。
通过瞬时转染上述细胞系来检测该嵌合TNFp-粒酶B基因的诱导型表达。通过检测转染细胞的凋亡，使用市售抗体在Western印迹法中评估AIG所表达的蛋白质，及使用市售、已有文献证实的特异性合成四肽底物评估蛋白酶活性，来测量TNFp-粒酶B核酸的表达。报道基因受TNFp驱动之表达的调节作用TNFα基因的3′非翻译区在TNFα生物合成的调节中起着重要作用。其参与正常、非活化状态的TNFα基因的翻译表达。重要地，这些元件使TNFα-产生细胞受外界刺激而治化时可发生去-抑制作用(Han，J．，等人，J．Immunology，1991，146，1843-1848；Crawford，F.K．，等人，J．Biol．Chem．，1996，271，22383-22390)。
制得遗传构建体，其中完整3′非翻译区(SEQ ID NO13)已插入受TNFα启动子的缺失片段，亦即-120、-706及-1005驱动的萤光素酶基因的下游。这些构建体的瞬时表达结果概述于图9中。使用该方案，还可将3′UTR插入TNFpGB嵌合构建体的粒酶B的下游(图6(a)、6(b)、12及13)。
实施例2检验方案体外方法萤光素酶试验使用市售试剂(Promega)测定萤光素酶活性。粒酶B基因表达a)使用抗-粒酶B抗体使转染细胞裂解产物的Westem印迹显色。
b)转染细胞的凋亡粒酶B所引起的转染细胞的凋亡通过以碘化丙锭染色细胞核(Krishan，A．，J．Cell Biol.，66，1994，188-193)，及通过市售细胞死亡ELISA试剂盒(Boehringer Mannheim)来测定。动物模型IL-1β-所诱导关节炎的兔子模式(Pettipher E．R．et al，Proc．Natl. Acad．Sci.，1986，83，8749-8753)将IL-1β注入新西兰白兔膝关节中。关节内注入IL-1β引起白细胞向关节腔中的剂量依赖性浸润，并引起蛋白聚糖从关节软骨中流失。
抗原-所诱导的关节炎将抗原(卵白蛋白)经关节内注射入膝盖关节中引起白细胞累积与软骨退化，这与人类的类风湿性关节炎非常类似。在注射后产生的关节肿胀持续14天。
严重联合免疫缺陷(scid)小鼠-人类滑膜细胞模型(Houri J．M．，等人Current Opinions in Rheumatol．，1995，7，201-205；Sack U．，等人，J．Autoimmunity，1995，9，51-58；Geiler T．，等人Arthritis & Rheumatism，1994，37，1664-1671)这些为最近开发的关节炎模型，其中是将取自RA患者的新鲜滑膜组织与正常人类软骨一起经皮下移植入scid小鼠的肾小囊下(Geiler T．，等人，Arthritis ＆ Rheumatism，1994，37，1664-1671)，或植入膝关节中(Sack U．，等人，J．Autoimmunity，1995，9，51-58)。移植物生长过程伴有关节炎样的特征，包括高细胞密度关节翳组织的形成、骨与软骨糜烂、多核巨细胞的形成、及滑膜成纤维细胞对软骨的浸入。
间接方法滑膜细胞体外经治疗基因转染，并再移植回兔子体内。通过注射IL-1β而在这些兔子中诱导关节炎，并评估活化后治疗基因的表达。该嵌合核酸经活化所诱导的表达诱导所移植入的细胞凋亡。
直接方法关节内注射该嵌合核酸。可使用上述任一种基因递送方法，包括裸露的质粒DNA，阳离子脂质体-介导的递送。应用基于病毒载体的递送时，是将嵌合核酸克隆于适宜载体中。然后，通过缺失这些载体中存在的真核启动子而对该载体进行修饰。然后可向关节内注射已插入适当载体中的治疗基因来评估治疗及预防功效。
实施例3不产生TNFα的体细胞变体的筛选用TNFp-AIG嵌合核酸稳定地体外转染细胞(THP-1，Jurkat细胞)。在数轮诱导表达TNFp-AIG基因的细胞凋亡的刺激后，收集尚存活的细胞。从这些细胞构建用于功能性克隆的cDNA文库(Legerski R和Peterson C．，Nature，1992，359，70-73；Jaattela M．，等人，Oncogene，1995，10，2297-2305)。
实施例4显性失活(DN)基因的鉴定及表征将稳定地用TNFp-AIG转染的THP-1与Jurkat细胞经重复数轮的刺激以活化TNFp-AIG表达。不表达负面调节基因的细胞将进行凋亡程序，而表达显性失活基因的细胞存活。在这些存活细胞中，DN基因产物反式作用于TNFα启动子，从而抑制其对转录AIG的活化作用，最终产生存活表型。使用得自这些细胞的聚腺苷酰化mRNA构建cDNA文库。通过对其它基因进行上述功能性克隆鉴定拯救TNFp-AIG转染的THP-1或Jurkat细胞免于凋亡的DN基因(Legerski R．和Peterson C．，Nature，1992，359，70-73；JaattelaM.，等人，Oncogene，1995，10，2297-2305)。
以上叙述是为告知本领域技术人员如何实施本发明，而并非对本领域技术人员通过阅读本说明书能显而易见地完成的所有明显修饰和变化进行详细描述。然而，这些明显的修饰与变化将包括在本发明经下列权利要求定义的本发明的范围中。除非上下文具体指出相反之处，这些权利要求将包括能有效于符合所欲达到之目的的以任何顺序的所要求保护的组成及步骤。
本文所引述的文献均以全文引入本文作为参考文献。
序列表〈110〉Tatake，Revati J．Marlin，Steven DBarton，Randall W〈120〉通过基因治疗自行调控炎性细胞的凋亡〈130〉9／137〈140〉〈141〉〈150〉60／076，316〈151〉1998-02-27〈160〉14〈170〉PatentIn Ver．2．0〈210〉1〈211〉1178〈212〉DNA〈213〉人类〈220〉〈223〉人类TNFα启动子〈400〉1ggggaagcaa aggagaagct gagaagatga aggaaaagtc agggtctgga ggggcggggg 60tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc tgaggaatgg gttacaggag 120acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat gtccagggct atggaagtcg 180agtatcgggg accccccctt aacgaagaca gggccatgta gagggcccca gggagtgaaa 240gagcctccag gacctccagg tatggaatac aggggacgtt taagaagata tggccacaca 300ctggggccct gagaagtgag agcttcatga aaaaaatcag ggaccccaga gttccttgga 360agccaagact gaaaccagca ttatgagtct ccgggtcaga atgaaagaag aaggcctgcc 420ccagtggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg ggctgtccca ggcttgtccc 480tgctaccccc acccagcctt tcctgaggcc tcaagctgcc accaagcccc cagctccttc 540tccccgcaga cccaaacaca ggcctcagga ctcaacacag cttttccctc caaccccgtt 600ttctctccct caaggactca gctttctgaa gcccctccca gttctagttc tatctttttc 660ctgcatcctg tctggaagtt agaaggaaac 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agaagtgaga gcttcatgaa aaaaatcagg 360gaccccagag ttccttggaa gccaagactg aaaccagcat tatgagtctc cgggtcagaa 420tgaaagaaga aggcctgccc cagtggggtc tgtgaattcc cgggggtgat ttcactcccc 480ggggctgtcc caggcttgtc cctgctaccc ccacccagcc tttcctgagg cctcaagcct 540gccaccaagc ccccagctcc ttctccccgc agggacccaa acacaggcct caggactcaa 600cacagctttt ccctccaacc ccgttttctc tccctcaagg actcagcttt ctgaagcccc 660tcccagttct agttctatct ttttcctgca tcctgtctgg aagttagaag gaaacagacc 720acagacctgg tccccaaaag aaatggaggc aataggtttt gaggggcatg gggacggggt 780tcagcctcca gggtcctaca cacaaatcag tcagtggccc agaagacccc cctcggaatc 840ggagcaggga ggatggggag tgtgaggggt atccttgatg cttgtgtgtc cccaactttc 900 〈210〉3〈211〉139〈212〉DNA〈213〉人类〈220〉〈223〉天然最小TNFα启动子〈400〉3 〈210〉4〈211〉123〈212〉DNA〈213〉人类〈220〉〈223〉TNFα启动子增强子1区(ER1)〈400〉4 〈210〉5〈211〉190〈212〉DNA〈213〉人类〈220〉〈223〉TNFα启动子增强子2区(ER2)〈400〉5tccttggaag ccaagactga aaccagcatt atgagtctcc gggtcagaat gaaagaagaa 60ggcctgcccc agtggggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg gggctgtccc 120aggcttgtcc ctgctacccc cacccagcct ttcctgaggc ctcaagcctg ccaccaagcc 180cccagctcct190〈210〉6〈211〉223〈212〉DNA〈213〉人类〈220〉〈223〉位于-120pGL3构建体中最小TNFα启动子上游的经遗传工程改造的多克隆位点〈400〉6ggtaccgagc tcttacgcgt gctagccgcg gatatcttaa gacgtcctag gactagtcag 60ctgctcgagc cgcttcctcc agatgagctc atgggtttct ccaccaagga agttttccgc 120tggttgaatg attctttccc cgccctcctc tcgccccagg gacatataaa ggcagttgtt 180ggcacaccca gccagcagac gctccctcag cagatctaag ctt 223&#60210&#627〈211〉787〈212〉DNA〈213〉人类〈220〉〈223〉TNFα非翻译区〈400〉7tctagaggag gacgaacatc caaccttccc aaacgcctcc cctgccccaa tccctttatt 60accccctcct tcagacaccc tcaacctctt ctggctcaaa aagagaattg ggggcttagg 120gtcggaaccc aagcttagaa ctttaagcaa caagaccacc acttcgaaac ctgggattca 180ggaatgtgtg gcctgcacag tgaagtgctg gcaaccacta agaattcaaa ctggggcctc 240cagaactcac tggggcctac agctttgatc cctgacatct ggaatctgga gaccagggag 300cctttggttc tggccagaat gctgcaggac ttgagaagac ctcacctaga aattgacaca 360agtggacctt aggccttcct ctctccagat gtttccagac ttccttgaga cacggagccc 420agccctcccc atggagccag ctccctctat ttatgtttgc acttgtgatt 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gcaggaagat cgaaagtgcg aatctgactt acgccattat 540tacgacagta ccattgagtt gtgcgtgggg gacccagaga ttaaaaagac ttcctttaag 600ggggactctg gaggccctct tgtgtgtaac aaggtggccc agggcattgt ctcctatgga 660cgaaacaatg gcatgcctcc acgagcctgc accaaagtct caagctttgt acactggata 720aagaaaacca tgaaacgcta ctaactacag gaagcaaact aagcccccgc tgtaatgaaa 780caccttctct ggagccaagt ccagatttac actgggagag gtgccagcaa ctgaataaa 839〈210〉9〈211〉782〈212〉DNA〈213〉人类〈220〉〈223〉截短的粒酶B(缺乏引导肽和失活二肽)〈400〉9atgatcatcg ggggacatga ggccaagccc cactcccgcc cctacatggc ttatcttatg 60atctgggatc agaagtctct gaagaggtgc ggtggcttcc tgatacaaga cgacttcgtg 120ctgacagctg ctcactgttg gggaagctcc ataaatgtca ccttgggggc ccacaatatc 180aaggaacagg agccgaccca gcagtttatc cctgtgaaaa gagccatccc ccatccagcc 240tataatccta agaacttctc caatgacatc atgctactgc agctggagag aaaggccaag 300cggaccagag ctgtgcagcc cctcaggcta cctagcaaca aggcccaggt gaagccaggg 360cagacatgca gtgtggccgg ctgggggcag acggcccccc tgggaaaaca ctcacacaca 420ctacaagagg tgaagatgac agtgcaggaa gatcgaaagt gcgaatctga 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tgccccagtg gggtctgtga attcccgggg gtgatttcac tccccggggc 120tgtcccaggc ttgtccctgc tacccccacc cagcctttcc tgaggctcaa gcctgccacc 180aagcccccag ctccttctcc ccgcagggac ccaaacacag gcctcaggac tcaacacagc 240ttttccctcc aaccccgttt tctctccctc aaggactcag ctttctgaag cccctcccag 300ttctagttct atctttttcc tgcatcctgt ctggaagtta gaaggaaaca gaccacagac 360ctggtcccca aaagaaatgg aggcaatagg ttttgagggg catggggacg gggttcagcc 420tccagggtcc tacacacaaa tcagtcagtg gcccagaaga cccccctcgg aatcggagca 480gggaggatgg ggagtgtgag gggtatcctt gatgcttgtg tgtccccaac tttccaaatc 540cccgcccccg cgatggagaa gaaaccgaga cagaaggtgc agggcccact accgcttcct 600ccagatgagc tcatgggttt ctccaccaag gaagttttcc gctggttgaa tgattctttc 660cccgccctcc tctcgcccca gggacatata aaggcagttg ttggcacacc cagccagcag 720acgctccctc agcagatcta tgcaaccaat cctgcttctg ctggccttcc tcctgctgcc 780cagggcagat gcaatcatcg ggggacatga ggccaagccc cactcccgcc cctacatggc 840ttatcttatg atctgggatc agaagtctct gaagaggtgc ggtggcttcc tgatacaaga 900cgacttcgtg ctgacagctg ctcactgttg gggaagctcc ataaatgtca ccttgggggc 960ccacaatatc aaagaacagg agccgaccca gcagtttatc cctgtgaaaa gacccatccc 1020ccatccagcc tataatccta agaacttctc caacgacatc atgctactgc agctggagag 1080aaaggccaag cggaccagag ctgtgcagcc cctcaggcta cctagcaaca aggcccaggt 1140gaagccaggg cagacatgca gtgtggccgg ctgggggcag acggcccccc tgggaaaaca 1200ctcacacaca ctacaagagg tgaagatgac agtgcaggaa gatcgaaagt gcgaatctga 1260cttacgccat tattacgaca gtaccattga gttgtgcgtg ggggacccag agattaaaaa 1320gacttccttt aagggggact ctggaggccc tcttgtgtgt aacaaggtgg cccagggcat 1380tgtctcctat ggacgaaaca atggcatgcc tccacgagcc tgcaccaaag tctcaagctt 1440tgtacactgg ataaagaaaa ccatgaaacg ctactaagaa ttctctagag gaggacgaac 1500atccaacctt cccaaacgcc tcccctgccc caatcccttt attaccccct ccttcagaca 1560ccctcaacct cttctggctc aaaaagagaa ttgggggctt agggtcggaa cccaagctta 1620gaactttaag caacaagacc accacttcga aacctgggat tcaggaatgt gtggcctgca 1680cagtgaagtg ctggcaacca ctaagaattc aaactggggc ctccagaact cactggggcc 1740tacagctttg atccctgaca tctggaatct ggagaccagg gagcctttgg ttctggccag 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权利要求
1．一种嵌合核酸分子，其包含至少一个连接至TNFα启动子上的TNFα启动子增强子区，该增强子区包含核酸SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12或其保守性取代或等位基因变体；该TNFα启动子进一步连接至编码粒酶B蛋白的核酸序列或其保守性取代或等位基因变体上，所述核酸序列又进一步连接至3′UTR核酸序列上。
2．权利要求1的嵌合核酸分子，其中存在二至五个TNFα启动子增强子区，且其中任一增强子区包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO12或其组合。
3．权利要求2的嵌合核酸分子，其中该TNFα启动子包含核酸SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3或其保守性取代或等位基因变体。
4．权利要求1的嵌合核酸分子，其中该核酸分子序列是选自SEQ IDNO13、SEQ ID NO14及其保守性取代或等位基因变体。
5．权利要求1的嵌合核酸分子，其中该3′UTR是连接于粒酶B核酸序列的下游。
6．一种药物组合物，其包含权利要求1的嵌合核酸分子。
7．一种治疗炎性病症的方法，其包括将治疗有效量的权利要求6的药物组合物给药于需要这类治疗的患者。
8．权利要求7的方法，其中该炎性病症是选自类风湿性关节炎、多发性硬化、急性热病性多神经炎、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、牛皮癣、移植物排斥宿主病、红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、牛皮癣性关节炎、结节病、过敏性肺炎、关节强硬性脊椎炎、Reiter’s综合征及全身性硬化。
9．权利要求8的方法，其中所述炎性病症是类风湿性关节炎。
10．一种构建嵌合核酸分子的方法，该嵌合核酸分子含有至少一个TNFα启动子的增强子，该增强子连接至最小TNFα启动子的功能性拷贝上，该功能性拷贝进一步连接至功能性凋亡-诱导核酸分子的至少一个拷贝上，该功能性凋亡-诱导核酸分子的拷贝进一步连接至TNFα-3′UTR核酸序列上，其中所述凋亡-诱导核酸的表达受TNFα启动子所驱动，该方法包含(a)用包含TNFα启动子缺失构建体的引物经聚合酶链式反应扩增含TNFα启动子的核酸分子；(b)将步骤(a)中得到的经PCR扩增的核酸克隆至报道核酸序列的上游，以产生一种构建体；(c)在至少一种产生TNFα的细胞系中检测步骤(b)中所得的构建体的组成型表达和诱导型表达；(d)在该细胞系中筛选决定着报道基因的诱导型表达的TNFα启动子；(e)对增强报道基因表达的TNFα启动子区进行PCR-扩增，以获得增强子，并将至少一拷贝增强子连接于该启动子上游；(f)通过用凋亡-诱导核酸缺失构建体置换该报道基因，而将至少一拷贝凋亡-诱导核酸分子插入TNFα启动子的下游；及(g)对TNF α-3′UTR进行PCR扩增，并将其连接于凋亡-诱导核酸分子的下游，以获得所述嵌合核酸分子。
11．权利要求10的方法，其中将二或多拷贝的增强子插入所述启动子的上游。
12．权利要求10的方法，其中报道核酸序列为萤光素酶。
13．权利要求10的方法，其中所述增强子包含选自SEQ ID NO4、SEQID NO5、SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的序列。
14．权利要求13的方法，其中所述凋亡-诱导核酸为粒酶B或其保守性取代或等位基因变体。
15．权利要求10的方法，其产生选自SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、及其保守性取代或等位基因变体的嵌合核酸分子。
16．权利要求10的方法，其中用于检验构建体的细胞是选自T类淋巴母细胞、骨髓单核细胞、单核细胞、成纤维细胞、经培养的人滑膜细胞及存在于RA中的初级细胞。
17．一种用于筛选显性失活基因的方法，其包含用包含权利要求1之嵌合核酸分子的序列转染不产生TNFα的细胞群；刺激所插入的序列的表达；及筛选具有显性失活基因的存活细胞。
18．权利要求17的方法，其中所述序列包含权利要求2的嵌合核酸分子。
全文摘要
本发明涉及嵌合核酸,及涉及通过将该嵌合核酸导入活化的炎性细胞或处于炎性部位的细胞中,以治疗诱导这些细胞的凋亡。该嵌合核酸具有至少一个TNFα启动子的增强子,该增强子连接至TNFα启动子的功能性拷贝上且进一步连接至凋亡—诱导基因的至少一个拷贝上,而该凋亡—诱导基因又进一步连接至3′UTR上。该凋亡—诱导基因是粒酶B。本发明还涉及制备并使用自我调控凋亡的嵌合核酸的方法,及用于治疗炎性疾病的含有这类核酸的药物组合物。
文档编号A61K48/00GK1292032SQ99803317
公开日2001年4月18日 申请日期1999年1月12日 优先权日1998年2月27日
发明者雷瓦蒂·J·塔泰克, 史蒂文·D·马林, 兰德尔·W·巴顿 申请人:贝林格尔·英格海姆药物公司