专利名称：：一种用月桂酰氯修饰超氧化物岐化酶的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种用聚烯属烃基氧化物修饰超氧化物岐化酶的制备方法，特别是指使用月桂酰氯对超氧化物岐化酶进行修饰。技术背景自1938年由Mann和Keilin从牛红细胞中分离提取所得，由于该酶为一种淡蓝色的含铜蛋白，故当时命名为血铜蛋白(Erythrocuprein)，但对其生物学功能不了解。直到1969年McCord和Fridovich发现了其生物催化活性，并正式命名为超氧化物歧化酶，自首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD(超氧化物歧化酶)的研究己有六十多年的历史。1969年Mccord等进一步发现了它们的生物活性，有关氧代谢的分子生物学等方面的研究工作，可与DNA双螺旋结构学说的成就相比较。国际上，自70年代起对SOD的研究全面展开，从种类、来源、结构、功效，直到SOD模拟化学，使得对SOD的研究达到高潮。80年代末，国内对SOD的研究也相继开展，并且取得了很大的进步。国内学者对SOD的研究主要集中在应用以及与应用直接相关的基础理论诸多方面，如罗勤慧、唐文霞等采用不同配体及桥连剂合成了大量的模拟SOD化合物。同时，在应用方面SOD己进入化妆品、食品和医药等领域。无可质疑，SOD的研究与应用有不可估量的前景。超氧化物岐化酶由于受到半衰期短、相对分子质量大、不易透过细胞膜、口服时易受胃蛋白酶分解、体内特异性等因素的限制，SOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。对SOD进行化学修饰，既能保留天然酶的活性，又能提高其稳定性，同时在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。
发明内容本发明的目的是提供一种用月桂酰氯修饰超氧化物岐化酶的制备方法，该方法可以在保证超氧化物岐化酶原有生物活性的同时，提高了天然酶的稳定性，同时在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。本发明提供了一种用月桂酰氯修饰超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于用月桂酰氯在碱性条件下取代超氧化物岐化酶上的氨基酸残基，在40-45'C下充分进行酰基化反应；通过3-6级的温度梯度处理和三级的丙酮沉淀提纯处理，最终得到稳定性和纯度都比较高的月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶。本发明中所述的酰基化反应包括如下步骤——超氧化物岐化酶按照重量体积比l:50-500(g/ml)溶于ph8.0-9.1磷酸钾缓冲液中，缓慢滴加月桂酰氯，超氧化物岐化酶溶液与月桂酰氯摩尔比为l:504000(酶/月桂酰氯)；充分搅拌溶解后，滴加0.5mol/L的氢氧化钠溶液，调节超氧化物岐化酶溶液的pH值为9.0，并且维持样品溶液的pH为9.0，在30分钟内不发生变化为止；——将上述溶液放置于4045。C的水浴中搅拌1-1.5个小时，使酰化反应充分进行；过滤除去沉淀，取上清液I。所述的提纯处理方法如下——对上清液I进行3-6级温度梯度处理初级温度为40-45'C，终级温度为2-8'C，每两级间温度梯度差为5-l(TC，上清液每级温度梯度处理都是先由初级温度迅速降至某级温度，保持5-20分钟后再迅速升至初级温度，每级降温后都低速3500-4500转/分钟离心10-30分钟，除去沉淀，得到上清液II;——对上清液II进行三级丙酮沉淀加入1-5倍体积的(TC以下的丙酮溶液，充分搅拌，即产生白色沉淀，低速3500-4500转/分钟离心5-15分钟，弃上清液，将沉淀溶于2-5倍体积的水中，充分溶解后，重复上述操作两次，留取沉淀；——用5-10倍体积的50mmol/LpH=6.2的磷酸钠缓冲液溶解经过三级丙酮沉淀处理所得到的沉淀，即得月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶。所述的超氧化物岐化酶可以来自猪、牛、羊、鸡等家禽及牲畜的血液以及腺体中纯化而得，也可以来自基因工程所得。本发明的原理为真核生物体内，许多蛋白质在翻译合成之后，常与脂类共价连接，月桂酰化主要属于脂化修饰，月桂酰氯与SOD分子表面的氨基作用，则在酶分子表面引入月桂酰氯基团，月桂酰氯有一个很长的疏水尾巴，这些疏水基团的引入，增加了酶表面的疏水性，由于疏水基团遮盖了酶表面对热、酸、碱、有机溶剂及蛋白水解酶敏感的易伸展位点。因而大大地加强了酶的稳定性。我们相信月桂酰氯疏水基团的引入还能掩盖酶分子的抗原决定簇，去除其免疫原性，更重要的是疏水基团的引入对于酶分子对细胞膜和脂双层具有高度的亲和性，因而有效的保护了细胞膜，可做成指示脂类的靶向制剂。本发明的优点用该方法得到的月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶的稳定性和纯度都比较高；在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。本发明具有工艺简单、周期短、收率高，具有较高的社会经济效益。具体实施例方式1、制备过程1.1、超氧化物岐化酶按照重量体积比l:50-500(g/ml)溶于pH8.0-9.1磷酸钾缓冲液中，充分溶解。向酶溶液中缓慢滴加月桂酰氯。其中超氧化物岐化酶溶液与月桂酰氯摩尔比为l:50-4000(酶/月桂酰氯)。充分搅拌反应后，滴加0.5mol/L的氢氧化钠溶液。维持酶溶液的pH值在9.0。直至酶溶液的pH维持在9.0，30分钟内不发生变化为止，再停止滴加氢氧化钠。1.2、将上述溶液放置于40-45。C的水浴中搅拌l-1.5个小时。使酰化反应充分进行，过滤除去沉淀，取上清液。1.3、温度梯度处理对上清液进行3-6级温度梯度处理，初级温度为40-45°C，终级温度为2-8°C，每两级间温度梯度差为5-l(TC，上清液每级温度梯度处理都是先由初级温度迅速降至某级温度,保持5-20分钟后再迅速升至初级温度，每级降温后都低速3500-4500转/分钟离心10-30分钟，除去沉淀；1.4、对上清液进行三级丙酮沉淀加入1-5倍体积的0'C以下的丙酮溶液，充分搅拌，即产生白色沉淀，低速3500-4500转/分钟离心5-15分钟，弃上清液，将沉淀溶于2-5倍体积的水中，充分溶解后，重复上述操作两次，留取沉淀。1.5、用5-10倍体积的50mmol/LpH-6.2的磷酸钠缓冲液溶解步骤1.4的沉淀。即得月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶溶液。2、分析测定2.1、活性测定活性测定采用经典邻苯三酚自氧化法，蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法(Bradford法)。2.2、残余氨基酸测定采用TNBS滴定法。2.3、体内半衰期测定依据文献方法，选用雄性豚鼠(体重250-280g)8只，随机分为2组LA-SOD(月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶)试验组和SOD对照组，每组4只。剂量均为0.6mg。颈静脉注射，注射后每隔5min、15min、60min、2h、5h、10h、20h各采血0.4ml，测定血清中酶活性。2.4、分子量及纯度测定凝胶浓度12.5%，电极缓冲液为含0.1Q/。SDS，Tris-甘氨酸缓冲液，考马斯亮蓝R250染色。2.5、免疫原性测定用被动皮肤过敏反应(PCA)法.动物致敏取LA一SOD和SOD各20g，用弗氏完全佐剂乳化，分别取O.2ml乳化液注入小鼠腹膜内，第14天和第28天重复一次。其间每隔7天经眶静脉采血，用PCA法鉴定血清中抗体.分别取O.Iml稀释的血清于大鼠真皮内注射，然后再注射含有0.5mgLA-SOD或SOD和20mg伊文思蓝的溶液，4h后，由皮肤过敏反应形成的圆环状蓝斑进行测定。2.6、热及水溶液状态下的稳定性试验将LA-SOD样品分别在4(TC，50°c.6crc和70t:下保温，定时取出样品，迅速降至室温，测订酶活性.确定修饰酶的活力保持情况。2.7、抗蛋白水解酶能力将同一浓度的LA-SOD和SOD分别加入10。/。胃蛋自酶溶液.于37'C保温，在lh，2h，3h分别取样测其活性。3、LA-SOD检测结果如下3.1、活性测定产品LA-SOD比活力为7500U/mgpro，收率为卯％3.2、残余氨基酸测定产品LA-SOD的残余氨基17n/。，氨基修饰率为83%3.3、体内半衰期测定在血液中SOD的半衰期为5.2分钟，LA-SOD的半衰期为15.5小时。可见修饰后的SOD的半衰期有了极大的提高。3.4、分子量及纯度测定SOD为双亚基蛋白，分子量为32000，LA-SOD的分子量为35000左右，其分子量的大小与氨基修饰率有关系，成正比。并且样品的纯度已经达到电泳纯。3.5、免疫原性测定月桂酰氯疏水基团的引入掩盖了酶分子的抗原决定簇，去除其免疫原性，结果见表l:表l:免疫原性测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表l可以看出，用月桂酰氯修饰后的超氧化物岐化酶，减少以至于消除了酶的免疫原性，体内注射将大大降低抗体产生的几率。3.6、热及水溶液状态下的稳定性试验月桂酰氯的引入，增加了酶表面的疏水性，掩盖了酶表面的热敏感伸展位点，因此提高了酶溶液对于热的稳定性结果见表2、表3:表2:LC-SOD热及水溶液状态下的稳定性结果温<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3:SOD热及水溶液状态下的稳定性结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.7、抗蛋白水解酶能力蛋白水解酶多做用于蛋白中的敏感肽键，月桂酰氯的引入后，形成了空间位阻，阻挡了蛋白水解酶靠近到裂解的位点，因此提高了LA-SOD对于蛋白水解酶的稳定性，结果见表4:表4:抗蛋白水解酶能力结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4、修饰条件的选择分别选择活性、残余氨基酸、分子量、收率这四个重点项目进行方法学上的检测，用以确定最佳的修饰条件。4.1、酶浓度的选择分别选择30mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、lmg/ml六个浓度的酶溶液按照上述制备步骤进行制备，相关数据简表5:表5:酶浓度选择的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4.2、超氧化物岐化酶与月桂酰氯比例的选择-分别选择超氧化物岐化酶溶液与月桂酰氯摩尔比(酶/月桂酰氯)1:20、h100、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000七个不同的添加比例按照上述制备步骤进行制备，相关数据见表6:表6:超氧化物岐化酶与月桂酰氯比例的选择结果活性残余氨基酸分子量收率u/mgpro(%)道尔顿(%)1:20822623%3290088%1:100832555%3312089%1:1000747867%3385087%1:2000723673%3426083%1:3000734079%347卯68%1:4000714085%3530052%1:5000673089%358卯35%4.3、水浴反应时间的选择分别选择45min、60min、75min、卯min、105min、五个不同的水浴反应时间按照上述制备步骤进行制备，相关数据见表7:表7:水浴反应时间的选择结果活性残余氨基酸分子量收率u/mgpro(o/o)道尔顿(%)45min782367%3298092%60min756080%34720卯％12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例11、称取超氧化物岐化酶30g溶于3000ml的pH8.5磷酸钾缓冲液中，充分溶解；向酶溶液中缓慢滴加月桂酰氯120ml，缓慢滴加，充分搅拌反应后，滴加0.5mol/L的氢氧化钠溶液；维持酶溶液的pH值为9.0，直至酶溶液的pH维持在9.0，30分钟内不发生变化为止，再停止滴加氢氧化钠。2、将上述溶液放置于4(TC的水浴中搅拌60分钟。使酰化反应充分进行，过滤除去沉淀，取上清液。3、温度梯度处理对上清液进行3-6级温度梯度处理，初级温度为40-45°C，终级温度为2-8nC，每两级间温度梯度差为5-l(TC,上清液每级温度梯度处理都是先由初级温度迅速降至某级温度，保持5-20分钟后再迅速升至初级温度，每级降温后都低速4000转/分钟离心20分钟，除去沉淀。4、对上清液进行三级丙酮沉淀加入3倍体积的(TC以下的丙酮溶液，充分搅拌，即产生白色沉淀，低速4000转/分钟离心5-15分钟，弃上清液，将沉淀溶于2-5倍体积的水中，充分溶解后，重复上述操作两次，留取沉淀约25g左右。5、用150ml的50mmol/LpH-6.2的磷酸钠缓冲液溶解沉淀，即得月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶溶液，冻干后得到冻干粉约18g。检验结果1、活性测定比活力为9400U/mgpro，收率为86%;2、残余氨基酸测定残余氨基21%，氨基修饰率为79%;3、分子量及纯度测定分子量为33卯0左右，样品的纯度已经达到电泳纯。实施例21、称取超氧化物岐化酶50g溶于7000ml的pH8.7磷酸钾缓冲液中，充分溶解；向酶溶液中缓慢滴加月桂酰氯50ml，缓慢滴加，充分搅拌反应后，滴加0.5mol/L的氢氧化钠溶液；调节酶溶液的pH值为9.0，直至酶溶液的pH维持在9.0，30分钟内不发生变化为止，再停止滴加氢氧化钠。2、将上述溶液放置于4(TC的水浴中搅拌70分钟，使酰化反应充分进行，过滤除去沉淀，取上清液。3、温度梯度处理对上清液进行3-6级温度梯度处理，初级温度为40-45°C，终级温度为2-8°C,每两级间温度梯度差为5-l(TC，上清液每级温度梯度处理都是先由初级温度迅速降至某级温度，保持5-20分钟后再迅速升至初级温度，每级降温后都低速4000转/分钟离心20分钟，除去沉淀。4、对上清液进行三级丙酮沉淀加入3倍体积的0。C以下的丙酮溶液，充分搅拌，即产生白色沉淀，低速4000转/分钟离心5-15分钟，弃上清液，将沉淀溶于2-5倍体积的水中，充分溶解后，重复上述操作两次，留取沉淀约50g左右。5、用350ml的50腿ol/LpH=6.2的磷酸钠缓冲液溶解沉淀。即得月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶溶液，冻干后得到冻干粉约40g。检验结果1、活性测定比活力为7290U/mgpro，收率为89%2、残余氨基酸测定残余氨基19%，氨基修饰率为81%3、分子量及纯度测定分子量为34900左右，样品的纯度已经达到电泳纯。权利要求1、一种用月桂酰氯修饰超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于用月桂酰氯在碱性条件下取代超氧化物岐化酶上的氨基酸残基，在40-45℃下充分进行酰基化反应；通过3-6级的温度梯度处理和三级的丙酮沉淀提纯处理，最终得到稳定性和纯度都比较高的月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶。2、按照权利要求1所述的用月桂酰氯修饰超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于所述的酰基化反应包括如下步骤——超氧化物岐化酶按照重量体积比l:50-500(g/ml)溶于ph8.0-9.1磷酸钾缓冲液中，缓慢滴加月桂酰氯，超氧化物岐化酶溶液与月桂酰氯摩尔比为l:50-4000(酶/月桂酰氯)；充分搅拌溶解后，滴加0.5mol/L的氢氧化钠溶液，调节超氧化物岐化酶溶液的pH值为9.0，并且维持样品溶液的pH为9.0，在30分钟内不发生变化为止；——将上述溶液放置于40-45°0的水浴中搅拌1-1.5个小时，使酰化反应充分进行；过滤除去沉淀，取上清液I。3、按照权利要求l所述的用月桂酰氯修饰超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于所述的提纯处理方法如下——对上清液I进行3-6级温度梯度处理初级温度为40-45""C，终级温度为2-8'C，每两级间温度梯度差为5-l(TC，上清液每级温度梯度处理都是先由初级温度迅速降至某级温度，保持5-20分钟后再迅速升至初级温度，每级降温后都低速3500-4500转/分钟离心10-30分钟，除去沉淀，得到上清液II;——对上清液II进行三级丙酮沉淀:加入l-5倍体积的0-C以下的丙酮溶液，充分搅拌，即产生白色沉淀，低速3500-4500转/分钟离心5-15分钟，弃上清液，将沉淀溶于2-5倍体积的水中，充分溶解后，重复上述操作两次，留取沉淀；——用5-10倍体积的50mmol/LpH=6.2的磷酸钠缓冲液溶解经过三级丙酮沉淀处理所得到的沉淀，即得月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶。4、按照权利要求1所述的用月桂酰氯修饰超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于所述的超氧化物岐化酶可以来自猪、牛、羊、鸡等家禽及牲畜的血液以及腺体中纯化而得，也可以来自基因工程所得。全文摘要一种用月桂酰氯修饰超氧化物岐化酶的制备方法，其特征在于用月桂酰氯在碱性条件下取代超氧化物岐化酶上的氨基酸残基，在40-45℃下充分进行酰基化反应；通过3-6级的温度梯度处理和三级的丙酮沉淀提纯处理，最终得到稳定性和纯度都比较高的月桂酰氯修饰的超氧化物岐化酶。用该方法得到的超氧化物岐化酶的稳定性和纯度都比较高；在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。本发明具有工艺简单、周期短、收率高，具有较高的社会经济效益。文档编号C12N9/08GK101323845SQ20071001168公开日2008年12月17日申请日期2007年6月14日优先权日2007年6月14日发明者李东旭,李金明申请人:铁岭均坤生物工程有限公司