形成或分解聚氨基酸的地衣芽胞杆菌新基因产物以及据此改进的生物技术生产方法

专利名称：：形成或分解聚氨基酸的地衣芽胞杆菌新基因产物以及据此改进的生物技术生产方法形成或分解聚氨基酸的地衣芽胞杆菌新基因产物以及据此改进的生物技术生产方法
技术领域：
：本发明涉及了5种或4种来自地衣芽胞杆菌(Sa"7/w//cAemybrm^)的新基因及其基因产物，以及充分相似的基因和蛋白，其能在体内参与聚氨基酸的形成、修饰和/或降解，并可用于该目的，以及，据此改进的使用微生物的生物技术生产方法，该方法的特点为这些基因的失活或激活。本发明属于生物
技术领域：
，具体来说是通过对能够形成所需适当产物的微生物进行发酵，来制备该适当的产物。这包括了例如低分子量化合物如膳食补剂或药用相关化合物的制备，或由于其多样性而具有广泛的工业应用的蛋白的制备。在第一种情况下，利用或修改相关微生物的代谢性质以制备适当的产物；在第二种情况下，使用能够表达所需蛋白的基因的细胞。因此在两种情况下，大部分都涉及到遗传修饰的生物(GMO)。微生物发酵存在广泛的现有技术，特别是在工业规模上；它的范围从通过发酵罐的技术设计对相关菌株的形成速度和营养利用进行最适化，直到从相关细胞本身和/或发酵培养基中分离有价值的产物。遗传的和微生物的、以及过程工程和生物化学方法都可应用于此。本发明的目的是对该工艺中所用微生物的通常性质进行改良，这些性质损害了实际的发酵步骤，特别是在所用菌株的遗传性质的水平上。对于工业生物技术生产来说，相关的微生物培养在发酵罐中，所述发酵罐的设计适合于它们的代谢性质。在培养过程中，它们对提供的底物进行代谢，然后除了实际产物之外通常还形成大量的其它物质，这些物质一般来说是不需要的，并且/或正如后文中将要解释的那样，可能导致发酵或随后的过程中的困难。一般来说，发酵是非常复杂的过程，其中有大量不同的参数必须被调节或监测。因此，例如，常常涉及需氧过程，意味着在整个发酵过程中必须给所用的微生物供应足够的氧气(控制通气速度)。其它这样的参数的例子是反应器的几何形状、营养基的组成、pH或C02生成速度的持续变化。对于经济学和过程管理本身而言都特别重要的参数是必需的能量输入，例如通过搅拌系统确保反应器中的内容物尽可能完全混合。此外，除了底物的分配之外，还需要保证生物体足够的氧气供应。在完成发酵之后，除了除去作为生产者的生物体之外，一般还必需将所需的有价值的产物从所谓的发酵罐料浆中纯化和/或浓缩。随后的工艺可以包括例如各种层析和/或过滤步骤。因此，除了有价值产物的含量之外，对整个后续工艺的成功也具有决定性的是发酵罐料浆的生物物理性质，特别是其在发酵完成后的即时粘度。其性质也受所选微生物代谢活性的影响，也可能有不希望的效应发生。这包括例如在发酵过程中营养培养基的粘度经常增加。这减弱了混合，从而削弱了反应器内部的物质运输和氧气供应。其它的困难大多数在随后的过程中发生，因为增加的粘度对于例如过滤过程的效率具有相当大的损害。已经知道具体来说，产生粘液的芽胞杆菌属菌种基本上由聚-Y-谷氨酸(PGA)和/或-天冬氨酸组成，意味着聚氨基酸通过相关的Y肽键链接。在对枯草芽孢杆菌(&d〃M犯^7^)的科学研究中，主要有3种基因ywsC、ywtA和ywtB以及由它们衍生的基因产物与聚谷氨酸的产生有关；ywtD基因的产物参与了降解。通用的基因标记符号"ywt"与通常用于同样功能的縮写"cap"和"pgs"具有同样的意义。对此将在下面解释。M.Ashiuchi等的论文""Physiologicalandbiochemicalcharacteristicsofpolygamma-glutamatesynthetasecomplexofBacillussubtilis"(2001)，Eur.J.Biochem.，vo1268，p5321-5328，描述了来自枯草芽孢杆菌的PgsBCA(聚-Y-谷氨酸合成酶复合物BCA)酶复合物，其由3种亚基PgsB、PgsC和PgsA构成。根据该论文，该复合物是一种非典型的酰胺连接酶，可以将谷氨酸的D和L对映体二者都转化为相应的聚合物。根据该论文，其中描述的基因破坏实验将作为证据，表明在枯草芽孢杆菌中，该复合物是唯一一个催化该反应的酶复合物。Y.Umshibata等在论文"CharacterizationoftheBacillussubtilisywsCgene,involvedingamma-polyglutamicacidproduction"(2002),J.Bacteriol.，vol.184，337-343p中证实，其中通过ywsC、ywtA禾口ywtB三种基因的缺失突变，枯草芽孢杆菌中负责PGA生成的三种基因产物由这三种基因编码。它们在该微生物中以这个顺序与随后的基因ywtC—起形成了相连的操纵子。T.Suzuki禾口Y.Tahara论文"CharacterizationoftheBacillussubtilisywtDgene，whoseproductisinvolvedingamma-polyglutamicaciddegradation"(2003)，J.Bacteriol.,vo1185,p2379-2382中，揭示了一个事实，即与PGA代谢相关的另一种基因位于枯草芽孢杆菌基因组ywtC自身操纵子中ywtC基因的下游。该基因编码能够水解PGA的DL-肽链内切酶，因此可以被称为Y-DL-谷氨酰水解酶。此夕卜，M.Ashiuchi禾卩H.Misono的文章"Biochemistryandmoleculargeneticsofpoly-gamma-glutamatesynthesis",Appl.Microbiol.Biotechnol.,2002,vol59，p9-14，还提供了关于这些酶的最近的调查情况。与pgsB、pgsC和pgsA同源并在炭疽芽胞杆菌中编码PGA合成酶复合物的基因在此被称为capB、capC和capA。按照该文章，位于下游的基因在炭疽芽胞杆菌中被称为dep(指"D-PGA分解酶")，在枯草芽孢杆菌中被称为pgdS(指"PGA分解酶)。在本
技术领域：
的目前状态中，这些酶的活性已经被积极使用，主要用于制备聚-Y-谷氨酸作为原料用于例如化妆品中，尽管到目前为止它们的准确DNA序列和氨基酸序列还未知，一特别是对于地衣芽胞杆菌而言。因此，例如，专利申请JP08308590A公开了通过对PGA产生菌本身、即芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌、进行发酵制备PGA;其中也描述了从培养基中分离该原料。根据专利申请WO02/055671Al，枯草芽孢杆菌chunkookjang变禾中(B.subtilisvar.chunkookjang)代表了特别适合用于此目的的微生物。因此，在某些发酵中对于GLA作为发酵产生的有价值产物是有兴趣的。但是，在所有其它发酵中，兴趣在于制备其它有价值的产品；就此而论，聚氨基酸的形成，由于上述的原因，意味着是副反应。控制由此形成而引起的发酵培养基粘度增加的典型方法是增加搅拌速度。但是，这对能量输入有影响。此外，被发酵的微生物因此被暴露在增加的剪切力中，这种力对它们而言代表了相当大的应力效应。最后，即便如此，非常高的粘度也不能克服，因此必需提前终止发酵，即便不然的话，生产还可以继续。作为大量发酵过程的副反应，粘液的形成因此可能由于多种原因而对发酵的总体结果产生负面影响。就不管营养基粘度的增加、而仍能持续发酵过程而言，常规的方法仅可能被表明是不够的，特别是因为它们不代表因果关系的控制。因此，更迫切的问题是在微生物的发酵过程中，尽可能抑制不需要的粘液形成，特别是由聚-Y-氨基酸例如聚-Y谷氨酸产生的粘液。特别希望能够发现代表因果关系的控制的解决方法。该问题的另一个方面是提供相关的基因，用于GLA合成的基因产物的正性利用，并用于其降解和/或修饰。下面参与聚氨基酸的形成或降解的每一个蛋白，都代表了每种情况下对于该问题在原则上具有同等价值的部分解决方法-YwsC(CapB，PgsB)，由核苷酸序列ywsC编码，所述核苷酸序列与SEQIDNO.l中显示的核苷酸序列有至少80%的同一性；-YwsC'(YwsC的截短变体)，由核苷酸序列ywsC'编码，所述核苷酸序列与SEQIDN0.3中显示的核苷酸序列有至少83%的同一性；-YwtA(CapC，PgsC)，由核苷酸序列ywtA编码，所述核苷酸序列与SEQIDN0.5中显示的核苷酸序列有至少82%的同一性；-YwtB(CapA,PgdA)，由核苷酸序列ywtB编码，所述核苷酸序列与SEQIDN0.7中显示的核苷酸序列有至少72。/。的同一性；以及-YwtD(Dep,PgdS)，由核苷酸序列ywtD编码，所述核苷酸序列与SEQIDNO.9中显示的核苷酸序列有至少67%的同一性。从诸如Urushibata等的上述论文中显然可见，参与GLA形成的4种或3种基因在枯草芽孢杆菌中顺续出现在同一个操纵子上。ywtD直接位于其下游。这些组分在体内以复合物的形式一起发挥作用，下游组分作用于由此形成的聚氨基酸，预计所述的这种组织方式也将会在许多其它微生物中被发现，特别是芽孢杆菌属中。因此，除了共同的生物化学功能之外，在遗传水平上也存在产生本发明的统一性的特点。其它的部分解决方法由相关的核酸ywsC、ywsC'、ywtA、ywtB和ywtD所代表，以及在此基础上，使用相关的核酸在微生物发酵过程中减少聚氨基酸引起的粘液形成，并用作相应的微生物发酵的方法。按照本发明，在遗传水平上减少粘液的形成中，ywsC、ywsC、ywtA或ywtB中至少一种基因被功能上失活，和/或ywtD的活性提高。此外，可以正性使用这些基因或衍生的基因产物用于聚Y谷氨酸的制备、修饰或降解。本发明原则上可用于所有可发酵的微生物，特别是芽孢杆菌属的微生物，使得这些微生物被用于发酵生产聚氨基酸之外的有价值产品，特别是药物相关的低分子量化合物或蛋白，在遗传水平上防止了聚氨基酸、特别是GLA的形成，或者将其立即再次降解。另一方面，这对培养基的粘度、另外对混合能力、氧气输入和能量消耗都有有利的影响，并且另一方面所需产品的后续加工也得到了相当的促进。此外，大多数使用的原料，例如N源，不被转化成不需要的产物，所以可以预期得到较高的总发酵产量。根据本发明的另一个方面，所述基因现在可用于GLA合成基因产物的正性使用，或用于其降解和/或修饰，特别是使用衍生的蛋白YwsC、YwsC'、YwtA、YwtB和/或YwtD，它们通过生物技术方法产生，并被导入产生它们的细胞中，或在适当的反应混合物中独立地作为催化剂。第一种部分解决方案展示了蛋白YwsC(CapB,PgsB)，它参与聚氨基酸的形成，并由核苷酸序列ywsC编码，所述核苷酸序列与SEQIDNO.l显示的核苷酸序列具有至少80%的同一性。该特异性酶通过分析地衣芽孢杆菌DSM13的基因组获得(参见实施例l)。该蛋白可以通过本申请SEQIDNO.l和2中的核苷酸和氨基酸序列复制(参见实施例l)。与介绍中提到的文献信息相一致，这采取了聚Y谷氨酸合成酶复合物的亚基的形式。在本
技术领域：
中目前已知的并且与其最相似的蛋白，被发现是来自枯草芽孢杆菌的同源YwsC，它已登记在GenBank数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,USA)中，登记号AB046355.1，其核酸水平上的同源同一性为75.4%，氨基酸水平上的同一性为86.1%(参见实施例2)。这些显著的一致不仅表明了同样的生物化学功能，而且表明在权利要求范围内存在大量具有同样功能的相关蛋白，它们同样包含在本申请提出的保护范围内。下面的实施方式将指定给该第一种部分解决方法-任何相应的蛋白YwsC，编码它的核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDNO.1中显示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。这是因为从序列同一性的增加得出的结论是，功能和相互可替代性的同一性在遗传水平上增加。-任何参与聚氨基酸形成的蛋白YwsC(CapB,PgsB)，其氨基酸序列与SEQIDNO.2中显示的氨基酸序列有至少91%的同一性，随着优选性增加，至少有92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。对于本申请来说，"至少X%"的表示形式意味着"X。/。到100%，包括极端值X和100，以及它们之间的所有整数和非整数百分数"。从地衣芽孢杆菌DSM13获得的特异性蛋白在每种情况下都是最优选的，因为它在本申请中被具体描述，并且100%可复制。第二种部分解决方法展示了蛋白YwsC'(作为YwsC截断的变体)，其参与了聚氨基酸的形成，为其编码的核苷酸序列ywsC'，与SEQIDN0.3中显示的核苷酸序列至少有83%的同一性。这种特异性酶通过分析地衣芽孢杆菌DSM13的基因组获得(参见实施例1)。该蛋白通过本申请中SEQIDNO.3和4中显示的核苷酸和氨基酸序列可被重制(参见实施例l)。正如在实施例1中另外解释的那样，图6显示，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的YwsC序列之间的比较表明，地衣芽孢杆菌的YwsC的前16个氨基酸，对于它作为聚Y谷氨酸合成酶复合物的亚基C的功能来说是不重要的。本发明因此也可以用该截短变体来实行。本申请中提到的"5种或4种基因"，意即按照本发明，ywsC和ywsC，被当作两种基因，衍生的蛋白被当作两种蛋白。另一方面，可能可以假定这两种"基因"不是在每种情况下都出现在相关生物体的体内，而是在每种情况下只出现其中一种，因此也可能出现只有一种相应的基因产物YwsC或YwsC'。因此，第一和第二种部分解决方法在某种程度上代表了同样的主题内容的两个方面。但是，因为氨基酸水平上的不同，分开成两种部分解决方法是有道理的。在本
技术领域：
中目前已知的、与其最相似的蛋白再一次被发现是枯草芽孢杆菌同源体YwsC，其已登记在GenBank数据库中，登记号AB046355.1，其核酸水平上的同源同一性为78.5%;氨基酸水平上的同一性为89.6%(参见实施例2)。根据上面的陈述，下面的实施方式被指定为第二种部分解决方法-任何相应的蛋白YwsC'，为其编码的核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDNO.3中显示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。-任何参与聚氨基酸形成的蛋白YwsC'(YwsC的截短变体)，其氨基酸序列与SEQIDNO.4中显示的氨基酸序列至少有94%的同一性，随着优选性增加，至少有95%、96%、97%、98%、99%,并优选100%的同一性。从地衣芽孢杆菌DSM13获得的特异性蛋白在每种情况下是最优选的，因为它在本申请中被具体描述，并且可100%复制。第三种部分解决方法展示了蛋白YwtA(CapC，PgsC)，其参与聚氨基酸的形成为其编码的核苷酸序列ywtA，与SEQIDNO.5中显示的核苷酸序列有至少82%的同一性。这种特异性酶通过分析地衣芽孢杆菌DSM13的基因组获得(参见实施例l)。该蛋白可通过本申请中SEQIDNO.5和6显示的核苷酸和氨基酸序列复制(参见实施例1)。与介绍中提到的文献信息相一致，这采取了聚Y谷氨酸合成酶复合物另一个亚基的形式。在本
技术领域：
中目前已知的、与其最相似的蛋白被发现是枯草芽孢杆菌的同源体YwsA，其己登记在GenBank数据库中，登记号AB046355.1，其核酸水平上的同源同一性为77.8%，氨基酸水平上的同一性为89.9%(参见实施例2)。这些显著的一致不仅表明了同样的生物化学功能，而且表明在权力要求的范围内存在大量具有同样功能的相关蛋白，它们同样包含在本申请提出的保护范围内。下面的实施方式被指定为该第三种部分解决方法-任何相应的蛋白YwtA，为其编码的核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDNO.5中显示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。-任何参与聚氨基酸形成的蛋白YwtA(CapC,PgsC)，其氨基酸序列与SEQIDN0.6中显示的氨基酸序列有至少94。/。的同一性，随着优选性增加，有至少95%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。从地衣芽孢杆菌DSM13获得的特异性蛋白在每种情况下都是最优选的，因为它在本申请中被具体描述，并且可100%复制。第四种部分解决方法展示了蛋白YwtB(CapA，PgsA)，其参与聚氨基酸的形成，为其编码的核苷酸序列ywtB，与SEQIDN0.7中显示的核苷酸序列有至少72%的同一性。这种特异性酶通过分析地衣芽孢杆菌DSM13的基因组获得(参见实施例l)。该蛋白可通过本申请中SEQIDNO.7和8中显示的核苷酸和氨基酸序列复制(参见实施例l)。与介绍中提到的文献信息相一致，这采取了聚Y谷氨酸合成酶复合物第三个亚基的形式。在本
技术领域：
中目前已知的、与其最相似的蛋白被发现是、与枯草芽孢杆菌的同源体YwsA，其已登记在GenBank数据库中，登记号AB046355.1，其核酸水平上的同源同一性为67.1%，氨基酸水平上的同一性为65.8%(参见实施例2)。这些显著的一致不仅表明了同样的生物化学功能，而且表明在权利要求的的范围内存在大量具有同样功能的相关蛋白，它们同样包含在本申请提出的保护范围内。下面的实施方式被指定为该第四种部分解决方法-任何相应的蛋白YwtB，为其编码的核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDNO.7显示的核苷酸序列有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。-任何参与聚氨基酸形成的蛋白YwtB(C叩A,PgsA)，其氨基酸序列与SEQIDNO.8显示的氨基酸序列至有少70%的同一性，并随着优选性增加，有至少75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。从地衣芽孢杆菌DSM13获得的特异性蛋白在每种情况下都是最优选的，因为它在本申请中被具体描述，并且100%可复制。第五种部分解决方法展示了蛋白YwtD(Dep，PgdS)，其参与聚氨基酸的降解，为其编码的核苷酸序列ywtD，与SEQIDN0.9显示的核苷酸序列有至少67%的同一性。这种特异性酶通过分析地衣芽孢杆菌DSM13的基因组获得(参见实施例1)。该蛋白可通过本申请中SEQIDNO.9和IO显示的核苷酸和氨基酸序列重制(参见实施例l)。与介绍中提到的文献信息相一致，这采取了y-DL-谷氨酰水解酶、D-PGA分解酶或PGA分解酶的形式。在本
技术领域：
中目前已知的、与其最相似的蛋白被发现是枯草芽孢杆菌的同源体YwtD，其已登记在GenBank数据库中，登记号AB080748,其在核酸水平上的同源同一性为62.3%，氨基酸水平上的同一性为57.3%(参见实施例2)。这些显著的一致不仅表明了同样的生物化学功能，而且表明在权利要求的范围内存在大量具有同样功能的相关蛋白，它们同样包含在本申请提出的保护范围内。下面的实施方式被指定为该第五种部分解决方法-任何相应的蛋白YwtD，为其编码的核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDNO.9显示的核苷酸序列有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。-任何参与聚氨基酸降解的蛋白YwtD(Dep,PgdS)，其氨基酸序列与SEQIDNO.IO显示的氨基酸序列有至少62%的同一性，随着优选性增加，至少有65%、70°/。、75%、80%、90°/。、95%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。从地衣芽孢杆菌DSM13获得的特异性蛋白在每种情况下都是最优选的，因为它在本申请中被具体描述，并且100%可复制。这些情况中每种都给出优选，在本发明前述蛋白的每种情况下，所述蛋白参与聚氨基酸的形成或降解，并由微生物天然产生，该微生物优选为细菌，特别优选为革兰氏阳性细菌，其中优选芽孢杆菌属之一，其中特别优选为地衣芽孢杆菌种之一，其中更为特别优选是地衣芽孢杆菌DSM13。这是因为，根据面临的问题，改善微生物的发酵是有利益的，因为这些具体的革兰氏阳性细菌中的细菌是经常使用的，特别是那些能够分泌产生有价值的产物和蛋白的细菌例如芽孢杆菌。此外，就此有丰富的临床经验。另外，如前所述，可能可以检测到地衣芽孢杆菌序列表中指出的蛋白，特别是地衣芽孢杆菌DSM13。预计相关生物体的关系度增加，将涉及核苷酸和氨基酸序列的同一性程度增加，并且可交换性因此增加。按照到目前为止的陈述，下列每种情况中的相关核酸将被指定为本发明所陈述的部分解决方法的进一步表示--核酸ywsC(capB,pgsB)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的形成，其核苷酸序列与SEQIDNO.1显示的核苷酸序列有至少80%的同一性；-相应的核酸ywsC，其核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDNO.1显示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性；-核酸ywsC'(截短的ywsC变体)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的形成，其核苷酸序列与SEQIDNO.3显示的核苷酸序列有至少83%的同一性;-相应的核酸ywsC'，其核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDNO.3显示的核苷酸序列有至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性；-核酸ywtA(capC，pgsC)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的形成，其核苷酸序列与SEQIDN0.5显示的核苷酸序列显有至少82%的同一性；-相应的核酸ywtA，其核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDN0.5显示的核苷酸序列有至少85%、卯％、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100°/。的同一性；-核酸ywtB(capA，pgsA),其编码的基因产物参与聚氨基酸的形成，其核苷酸序列与SEQIDNO.7显示的核苷酸序列有至少72%的同一性；-相应的核酸ywtB，其核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDNO.7显示的核苷酸序列有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性；-核酸ywtD(dep，pgdS)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的降解，其核苷酸序列与SEQIDNO.9显示的核苷酸序列有至少67%的同一性；以及-相应的核酸ywtD，其核苷酸序列随着优选性增加，与SEQIDN0.9显示的核苷酸序列有至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100°/。的同一性。在此提供的核酸可被现有的分子生物学方法用于失活或增强相关蛋白的活性。因此，通过例如适当的缺失载体(参见下文)，失活变得可能；活性的增强可以通过过量表达来进行，这可以在表达载体(参见下文)的帮助下实现。因此，提出的问题可以使用这些核酸，通过ywsC、ywsC'、ywtA禾卩/或ywtB的失活和/或增强ywtD基因的活性来解决。在每种情况下显示的同源性范围内的相应基因，可以从所需的生物体中获得，例如在序列l、3、5、7或9的基础上制备的探针的帮助下。这些完整的基因也可以用作产生PCR引物的模型，通过它们可以从相应的总DNA制备物中容易地制备相关的基因；这些基因随后提供了前述的蛋白。在此成功率通常随着相关菌株与被用来构建探针或PCR引物的菌株的接近度而增加，在本情况下是地衣芽孢杆菌。这些情况中每种都给出优选，在本发明核酸的每种情况下，所述核酸天然存在于微生物中，该微生物优选为细菌，特别优选革兰氏阳性细菌，其中优选芽孢杆菌属之一，其中特别优选地衣芽孢杆菌种之一，其中非常特别优选地衣芽孢杆菌DSM13。这是因为，如上所述，利用这些基因用于这些微生物的发酵是特别有利益的。另一方面，本发明还关系到通过本文描述的基因和/或蛋白，调节聚氨基酸代谢的可能性，特别是Y-谷氨酸至少对它们的合成、修饰和/或降解进行部分调节。其成功率一般来说，特别是在适当的转基因宿主细胞中，随着相关基因与天然细胞的基因之间同一性的程度而增加。此外，有可能原则上易于从所有天然生物体中分离出基因和蛋白的可选实施方式。本发明的另一个实施方式展示了编码本发明上述蛋白的所有核酸。因此，在使用同义密码子编码相应的氨基酸中存在差异，特别是在关系遥远的物种之间，由此蛋白生物合成元件也通过例如适当装载的tRNAs的可用数量与此相适应。将所述基因之一转入到相关性较低的物种中，如果该基因根据密码子进行了适当的最适化，可以特别成功地用于例如缺失突变或相关蛋白的合成。因此，有可能在DNA水平上引入增加的百分差异，而在氨基酸水平上没有影响。因此，这样的核酸也代表了本发明的实施。本发明还涉及含有本发明前面指出的的核酸区域的载体。这是因为为了操作与本发明相关的核酸，例如特别是制备本发明的蛋白产物，它们将适当连接到载体中。这样的载体和相关的工作方法在现有技术中有详细的描述。有大量和各种各样的载体可以商购，用于克隆和表达。它们包括例如从细菌质粒、噬菌体或病毒衍生的载体，或主要是合成的载体。它们也可以按照它们能将自身构建进入载体的细胞类型的性质区分，例如革兰氏阴性菌载体、革兰氏阳性菌载体、酵母载体或高等真核生物载体。它们为例如分子生物学和生物化学研究以及相关基因或相关蛋白的表达，形成了适当的起点。正如与此相关的现有技术所显见，它们事实上是不可或缺的，-特别是在制备用于缺失或增强表达的结构体时。其中优选的载体是含有两种或多种本发明上述核酸的载体。这是因为从另一方面来说，相关的基因可以被同时储存，或可以在同样的启动子控制下表达。根据另一项申请，同时包含两种或多种本发明基因的完整拷贝的载体，可以用于保持同时失去了多种这些基因的缺失突变体的存活(挽救)。之后的定向取出该载体导致这些多种基因被同时关闭。在另一个实施方式中，本发明的载体是克隆载体。这是因为克隆载体除了所需基因的储存、生物学扩增或选择之外，还适合于其分子生物学特征。同时，它们代表了权利要求的核酸的可转运和可储存的形式，也是与细胞无关的分子生物学技术的起点，例如PCR或体外突变方法。本发明的载体优选为表达载体。这是因为这样的表达载体是在生物学生产系统中供应相应的核酸并生产相关的蛋白的基础。本发明该主题内容的优选实施方式是由表达所必需的遗传元件构成的表达载体，例如原来位于该基因前方的天然启动子，或来自不同生物体的启动子。这些元件可以被安排成例如所谓的表达盒的形式。对于一个或所有调控元件来说，另一个可选的可能性也由相应的宿主细胞提供。特别优选与其它性质相关的表达载体，例如与选定的表达系统、特别是宿主细胞相匹配的最适拷贝数(参见下文)。在以复制子形式存在的载体的基础上形成完整的基因产物的可能性，对于上述的挽救和特定基因的关闭来说是特别重要的。相反，使用表达载体最有可能增加本发明的蛋白生成，因此增加了相关的活性。细胞在经过遗传修饰后，含有上面指定的本发明的核酸中的一种，从而形成了本发明的分离的主题内容。这是因为这些细胞含有合成本发明的蛋白的遗传信息。这些细胞是指已经通过现有的方法提供了本发明的核酸的特定细胞、或从这样的细胞衍生的细胞。为此目的而适当选择的宿主细胞是可以被相对简单地培养和/或提供高产物产率的细胞。在人类胚胎干细胞可能不受专利保护的国家中，原则上必需将本发明的这些人类胚胎干细胞从授予的保护中排除。本发明的细胞使得例如相应基因的扩增成为可能，也使这些基因的突变或转录和翻译，并最终通过生物技术生产相关的蛋白成为可能。这种遗传信息既可以作为分离的遗传元件存在于染色体外，即在细菌的情况下意味着位于质粒中，也可以整合在染色体中。合适的系统的选择取决于一些问题，例如基因或生物体的本质和储存时间、或者突变或选择的本质。除了在特定YwtD中过量表达的细胞之外，这包括了特别是那些通过反式载体含有ywsC、ywsC'、ywtA和ywtB基因之一、因此可以用于相应的缺失的细胞(参见下文)。这解释了优选实施方案，其中所述核酸在这种细胞中是载体、特别是前面描述的载体的一部分。其中细菌是优选的宿主细胞。这是因为细菌有繁殖时间短和对培养条件要求低的特点。因此可能建立起成本效益方法。此外，在细菌的发酵技术方面有丰富的经验。由于各种各样的因素，革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌可能适合于特定的生产，这些因素应该个别通过实验确定，例如营养源、产物形成率、需要的时间等。优选的实施方案包含了革兰氏阴性细菌，特别是大肠杆菌(Escherichiacoli)、克雷伯氏杆菌(Klebsiella)、假单胞菌(Pseudomonas)或黄单胞菌(Xanthomonas)属的细菌，特别是大肠杆菌K12(E.coIiK12)、大肠杆菌B(E.coliB)或植生克雷伯氏杆菌(Klebsiellaplanticola)的菌株，最特别的是大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌RV308、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM109、大肠杆菌XL-1或植生克雷伯氏杆菌(Rf)菌株的衍生株。这是因为对于革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌来说，大量蛋白被分泌到周质空间中。这对于特定的应用来说可能是有利的。专利申请WO01/81597Al也公开了使用革兰氏阴性细菌将表达的蛋白排出的方法。上面提到的优选的革兰氏阴性细菌通常易得，即可以商购或通过公共菌种保藏机构获得，并可以被最适化以用于与其它成分联合的特定制备条件，例如同样可以大量获得的载体。替代而优选性并不减少的实施方式包含了革兰氏阳性细菌，特别是芽孢杆菌、葡萄球菌或棒状杆菌属的细菌，更特别是缓慢芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、球形芽孢杆菌(B.globigii)或嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)或谷氨酸棒状禾干菌(Corynebacteri腿glutamicum)菌株，其中非常特别优选的是地衣芽孢杆菌DSM13衍生株c这是因为革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌有基本的区别，在于能够立即将分泌的蛋白释放到细胞周围的营养培养基中，如果需要的话可以从营养培养基中直接纯化本发明的表达的蛋白。此外，它们与大多数工业重要的酶源生物相关或一致，并且它们本身大多数产生类似的酶，因此它们具有类似的密码子用法，并且它们的蛋白合成元件天然就是适当构建的。地衣芽孢杆菌DSM13的衍生株是极为优选的，因为一方面它们在本
技术领域：
同样被广泛地用作生物技术生产菌株，另一方面本申请中本发明的基因和蛋白就是来自地衣芽孢杆菌DSM13，因此在这样的菌株中实施本发明应该最有可能成功。本发明的另一个实施方式由制备一种或多种上述基因产物YwsC,YwsC',YwtA，YwtB和YwtD的方法构成。这包括任何用于制备本发明上述蛋白的方法，例如化学合成方法。但是就此而言，所有上述在各个方面已经讨论过的、在本
技术领域：
内已经建立的分子生物学、微生物学和生物技术制备方法都是优选的。其目的主要是获得本发明的蛋白，以便可以将它们进行适当的应用，例如用于聚y谷氨酸的合成、修饰或降解。就此而论优选的方法是使用了本发明前面指明的核酸的方法，优选为使用了本发明前面指明的载体的方法，特别优选的是使用了本发明前面指明的细胞的方法。这是因为所述核酸、特别是序列表SEQIDNO.1、3、5、7和9中标识的核酸，使得相应的优选遗传信息适用于微生物可利用的方式，即遗传生产方法。更加优选的是提供可以被宿主细胞特别成功地利用的载体，或这些细胞本身。相关的生产方法为熟练的工作人员所熟悉。本发明的实施方式可以以相关的核酸序列为基础，并且是无细胞表达系统，其中蛋白的生物合成在体外复制。所有提到的元件也可以结合到新方法上，以制备本发明的蛋白。而且对于本发明的每种蛋白可以想象出大量可能的方法步骤的组合，以至于对于每个特定的个体情况来说，最适的方法需要通过实验确定。对于使用密码子的宿主菌株而言，核酸序列适合一种或多种密码子时，这种类型的发明方法更为优选。这是因为，根据前面的陈述，将所述基因之一转移到相关性较小的菌种中时，如果对有关的密码子用法进行了适当的最适化，可以被特别成功地使用。本发明的另一种表示方法是使用本发明前述核酸ywsC、本发明前述核酸ywsC'、本发明前述核酸ywtA、本发明前述核酸ywtB或相应的核酸，所述核酸编码本发明上述蛋白之一，或者其各部分在各种情况下用于微生物内各自相关基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB的功能失活。。在本申请中，功能性失活意味着任何形式的修饰或突变，通过这些修饰或突变，相关的蛋白作为参与聚氨基酸形成的酶或作为该酶亚基的功能被抑制。其所包括的实施方式形成了事实上完整但无活性的蛋白，而该蛋白失活的部分存在于细胞中，有赖于相关的基因不再翻译或者甚至完全缺失的可能性。因此在本实施方案中这些因子或基因的具体"使用"，在于它们在相关的细胞中不再以它们天然的方式精确地发挥作用。这是按照本发明的主题内容在遗传水平上通过关闭相关的基因来实现的。失活基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB的替代实施方式是使用本发明前述核酸ywtD或相应的核酸，所述核酸编码本发明前述蛋白之一，用于增加微生物内相关基因ywtD的活性。这是因为，如介绍所述，该酶在体内的功能是降解GLA。因此增加该活性导致了培养基中聚氨基酸浓度的降低，根据本发明，这对相关微生物的工业发酵具有积极效应。这种活性的增加有利地发生在遗传水平上。这样的方法其本身是己知的。例如，可以通过将该基因转入到表达载体中来进行这样的载体可以通过转化导入到用于发酵的细胞中，并在某些条件下被适当地激活，以便除了内源形成的YwtD外，衍生的蛋白也可以发挥作用。在优选实施方式中，两种用法是在微生物发酵过程中发生功能性失活或活性的增加，优选将聚氨基酸引起的粘液减少到50%、特别优选少于20%、非常特别优选少于5%，所有中间的整数或百分数再一次被理解为适当的优选分级。为了确定这些值，将未处理的菌株和处理的菌株的细胞在其它条件相同的情况下进行发酵，在发酵过程中适当地测定相应培养基的粘度。因为菌株的其它条件相同，粘度的差别是由聚氨基酸的不同含量造成的。根据本发明，粘度的减小是需要的。通过从两个发酵中取样并用已知的方法测定含有聚氨基酸的粘液的量，可以获得比较值，以百分数表示。随着优选性增加，从本发明的过渡到静止生长期的样品中测定的值少于对照发酵的相应值的50%、40°/。、30%、20%、10%、5%，非常特别优选少于1%。这是因为本发明的问题是改进用于生物技术生产的微生物发酵。因此，这值得或者、特别是当多个基因受到影响时、通常需要在实验室规模上执行相关的分子生物学构建，并在适当的情况下，在仅仅代表中间阶段的宿主细胞上执行构建，例如在大肠杆菌中构建缺失载体。但是按照本发明，需要对基因ywsC，ywsC'，ywtA或ywtB进行失活，以显示出希望获得的效果，特别是在发酵过程中。ywtD基因活性的增加可以通过例如可诱导的启动子来控制，该启动子举例而言是相关的转入基因。因此，该基因的活性可以通过在发酵过程中合适的时间加入诱导剂来有计划地开启。另外，该基因也可以与对应激信号作出反应的启动子偶联，例如氧气含量太低，这也可以在被粘液阻塞的发酵罐中当混合不够时发生。在另一个优选实施方式中，本发明的应用是这样，随着优选性的增加，ywsC，ywsC'，ywtA和ywtB基因中的2种、3禾中或4种被失活，优选与ywtD基因介导的活性增加相结合。此时可以回顾，在相关生物体体内，可能基因ywsC和ywsC'并不同时存在，而是在每种情况下只存在其中一种。在这些情况下可能所述基因最多有3种被失活，因此在这种情况下，这代表了最优选的实施方式。在失活的分子生物形式被选来用于失活这些基因之一的情况下，该实施方式作为防护措施是不完整的，并且细胞仍有相应的残留活性。这特别适用于枯草芽孢杆菌之外的宿主细胞，根据Ashiuchi等的论文(参见上文)，已经证实这些基因在每种情况下只存在一个拷贝。将缺失方法与增强ywtD介导的活性的方法相结合特别有价值，从而将两个原理上作用不同的系统结合在一起。在用于使一种或多种ywsC，ywsC'，ywtA和ywtB基因功能性失活的一个实施方式中，使用了编码失活的蛋白并具有点突变的核酸。这种类型的核酸可以通过已知的点突变方法产生。这样的方法在例如相关的手册中有描述，例如Fritsch,Sambrook禾口Maniatis。"Molecularcloning:alaboratorymanual"，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NewYork，1989。此外，现在有大量商品化的构建试剂盒可以使用，例如Stratagene公司(LaJolla,USA)的QuickChange试剂盒。其原理是合成具有单个交换的寡聚核苷酸(误配引物)，然后与单链形式的基因杂交；随后的DNA聚合产生了相应的点突变。为了达到这个目的，可能使用这些基因相应的种属特异性序列。由于高度的同源性，本发明中在SEQIDNO.1、3、5和7提供的序列的基础上执行该反应是可能的和特别有利的。这些序列也可以用来为相关的种属设计适合的误配引物，特别是在图6至IO和图1至5的比对中，以鉴定出来的保守区域为基础。在这种应用的一个实施方式中，每种情况下使用具有缺失突变或插入突变的核酸进行功能性失活，优选包括蛋白编码区的边界序列，每种情况下包含至少70-150个核酸位置。这些方法本身对于专业工作人员来说也是熟知的。因此可能通过使用限制性内切酶在适当的转化载体上切除相关基因的一部分，防止宿主细胞中一种或多种因子YwsC、YwsC'、YwtA和YwtB的形成，然后将载体转入所需的宿主，在此通过那时仍有可能的同源重组将活性基因用无活性拷贝替代。在插入突变的实施方式中，可能只需要断裂导入完整的基因，或另一个基因，例如选择性标记，而非部分基因。因此可能以已知的方式进行突变事件的表现型检查。为了保证在每种情况下在导入到细胞中的缺陷基因与内源性存在于例如染色体上的完整基因拷贝之间，每种情况下所必需的这种重组事件，需要根据本领域的现有知识，即每种情况下在不一致的序列部分的两边序列中，有至少70到150个连续的核酸位置是一致的，位于它们中间的部分并不重要。因此，优选的实施方案仅包含两个侧翼区，至少有一个具有这样的大小。在这种应用的替代实施方式中，使用的核酸共含有两个核酸片段，它们在每种情况下包含至少70个到150个核酸位置，并且至少部分侧翼，优选整个侧翼，是蛋白的编码区。关于这一点，可以通过已知的方法确定侧翼区从已知的序列开始，例如在外向方向的PCR引物的帮助下，并以基因组DNA制备物为模板(锚定PCR)。这是因为片段并非必须是蛋白编码的，以便通过同源重组使两个基因拷贝的交换成为可能。根据本发明，可以在SEQIDNO.1、3、5和7的基础上为此设计所需的引物，也为其它品种的革兰氏阳性细菌，其中特别是芽孢杆菌属的菌种。作为这种实验方法的一种替代方式，可能要从相关菌种取得这样的基因，其至少有部分不编码多数这类基因，相关菌种来自例如B.subtilisdatabaseentries、例如SubdListdatabaseoftheInstitutePasteur,Paris,France(http:〃genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)。另一个优选实施方案包含了描述的本发明的应用之一，其中表达载体被用于所述的ywtD基因介导的活性增加，优选的载体含有该基因和调控该基因的核酸片段。正如前面已经陈述的那样，该基因以及衍生的蛋白的活性的增加可以因此从外部人为调控，或通过在发酵培养基中占优势的条件进行自动的调适，以达到减少聚氨基酸浓度的要求。此处的应用对于本发明描述的编码ywtD的核酸是特别有利的，非常特别有利的是使用SEQIDNO.9中的核酸。本发明也可以以遗传修饰的微生物的形式执行，对此上面的陈述可相应应用。它们是非常普通的微生物，其中基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB中的至少一种被功能性失活，或者ywtD具有增加的活性。它们优选是这样的微生物，其中随着优选性的增加，基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB中的2种、3种或4种被失活，并优选伴随着ywtD基因介导的活性的增加。优选的微生物是细菌的形式。其中按照本文的描述，优选的微生物是革兰氏阴性细菌，特别是大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、假单胞菌或黄单胞菌属的细菌，特别是大肠杆菌K12、大肠杆菌B或植生克雷伯氏杆菌的菌株，最特别的是大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌RV308、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM109、大肠杆菌XL-1或植生克雷伯氏杆菌(Rf)菌株的衍生株。按照到目前为止的陈述，优选性并不少的微生物是革兰氏阳性细菌，特别是芽孢杆菌、葡萄球菌或棒状杆菌属的细菌，更特别是缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌或嗜碱芽孢杆菌、肉葡萄球菌或谷氨酸棒状杆菌菌株，其中非常特别优选的是地衣芽孢杆菌DSM13。按照本申请所基于的问题，目的主要是改进工业发酵方法。因此，本发明尤其在相应的本发明的发酵方法中执行。这些方法是非常普遍的发酵本发明上述微生物的方法。按照此前的陈述，相应优选以此为特征的方法。这些特别包括了基因ywsC、ywsC'、ywtA或ywtB中的一种或多种被功能性失活，或者ywtD的活性被增加的实施方式，特别是这两种方法的组合。为此，特别优选的来源是本发明上述的核酸，特别是SEQIDNO.1、3、5、7或9显示的核酸。这也相应应用于所选的适合于相应的发酵的菌种。根据前面的陈述，其中优选性增加的是与地衣芽孢杆菌DSM13相关程度增加的菌种，因为这样就增加了所述核酸应用的成功前景。在本发明的发酵方法中，优选的是用于制备有价值的产物的方法，特别是用于制备低分子量化合物或蛋白的方法。这是因为这是工业发酵最重要的应用领域。在优选的方法中低分子量化合物是天然产物、膳食补剂或药物相关化合物。通过这种方式生产了例如氨基酸或维生素，它们被特别用作膳食补剂。药物相关化合物可以是药物的前体或中间体，或甚至是后来的药物本身。在所有这些情况下，也采用了术语生物转化，据此，微生物的代谢性质被用来替换整个或至少个别步骤的复杂化学合成。同样优选的相应方法是，通过这种方式生产的蛋白是酶，特别是a-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂酶、氧化还原酶、过氧化物酶、漆酶、氧化酶和半纤维素酶中的一种。通过这样的方法制备的工业酶被用于例如食品工业中。因此，a-淀粉酶被用于例如防止面包变味或澄清果汁。蛋白酶被用于蛋白的分解。所有这些酶已经被描述用在去污剂或清洁剂组合物中，这原是被革兰氏阳性细菌天然制备的枯草杆菌蛋白酶所特别占据的显著位置。它们被用于特别是纺织和皮革工业中，用于天然原材料的加工处理。对于所有这些酶来说另一种可能性是用在生物转化中作为化学反应的催化剂。这些酶多数源自芽孢杆菌菌株，因此可以在革兰氏阳性细菌中特别成功地生产，特别是芽孢杆菌属的细菌，在许多情况下也包括地衣芽孢杆菌DSM13。特别是基于这些微生物系统的生产方法可以在本发明的帮助下被改进，因为SEQIDNO.l、3、5、7和9特别指明的序列正是明确从该菌种中衍生出来的。最后，可以在本申请中使用的因子也可以被正性使用，意即在它们的天然功能的意义上，意味着与聚Y谷氨酸的定向制备、修饰或降解相关。因此形成的一个实施方式是通过微生物方法制备、修饰或降解聚Y谷氨酸，其中本发明上述的核酸ywsC、ywsC'、ywtA、ywtB禾口/或ywtD之一或编码本发明上述蛋白的相应核酸之一被用来转基因，优选形成本发明上述的相应蛋白。其中优选的方法使用的微生物来自芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。因此正如在例如专利申请JP08308590A或WO02/055671Al中描述的那样，通过微生物、特别是在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中生产GLA是可能的。本申请提供的DNA序列可以被用于例如在适合的细胞中增加相应的基因的活性，因此增加产量。作为其替代方法，制备、修饰或降解聚Y谷氨酸的无细胞方法现在也是可能的，其中包含了参与聚氨基酸形成的上述的本发明基因产物YwsC、YwsC'、YwtA、YwtB和/或YwtD，优选使用本发明上述的相应核酸。因此，这些因子可以在例如生物反应器中进行反应。这样的酶反应器的设计在现有技术中是已知的。这种类型的相应方法中特别优选的是使用2种、优选3种、特别优选4种不同的所述基因产物或核酸。正如介绍所描述，这是因为因子YwsC、YwtA和YwtB特别经常形成紧密结合的复合物，因此必须谈到共同活性。同时的或随后的YwtD活性可以用于例如影响形成的聚氨基酸的生物物理性质，以及例如改造以用于化妆用品中。下面的实施例对本发明进行了进一步的说明。实施例所有的分子生物学工作步骤都按照例如在Fritsch、Sambrook和Maniatis的"Molecularcloning:alaboratorymanual"(ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NewYork,1989)或类似的相关著作中指示的标准方法进行。酶、构建试剂盒以及仪器按照相应的制造商的说明书来使用。实施例1从地衣芽孢杆菌DSM13中鉴定基因ywsC、ywsC'、ywtA、ywtB和ywtD通过标准方法从地衣芽孢杆菌DSM13菌株中制备基因组DNA，任何人都可以从DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MascheroderWeglb，38124Braunschweig(http:〃www.dsmz.de)获得该菌株，将基因组DNA机械分离，并在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳分离。为了对较小的片段进行鸟枪法克隆，将大小在2至2.5kb的片段从琼脂糖凝胶上洗脱下来，脱磷酸，并作为平末端片段连接到载体pTZ19R-Cm的SmaI限制性酶切位点中。该载体是从Fermentas(St.Leon-Rot)获得的质粒pTZ19R的衍生物，被赋予了氯霉素抗性。这样就获得了较小片段的基因文库。在第二次鸟枪法克隆中，通过酶SauIIIaI部分消化获得的基因组片段被连接到Stratagene公司(LaJolla，USA)的SuperCos1载体系统("CosmidVectorKit")中，从而产生了涵盖主要是较大片段的基因文库。从用相关基因文库转化获得的大肠杆菌DH5oc中分离相关的重组质粒并进行序列测定(D.Hannahan(1983):"StudyontransformationonEscherichiacoli";J.Mol.Microbiol.,vol巡，p557-580)。在这种情况下使用染料终止方法(染料终止剂化学)，通过自动测序仪MegaBACE1000/4000(AmershamBioscience,Piscataway,USA)禾卩ABIPrism377(AppliedBiosystems,FosterCity，USA)进行。通过这种方法，获得了本申请的序列表中指示的序列SEQIDNO.1、3、5、7和9，在这些序列的基础上得到了基因ywsC、ywsC'(ywsC的截短变体)、ywtA、ywtB和ywtD。从它们推演出的氨基酸序列分别显示在SEQIDNO.2、4、6、8和10中的相应序列中。截短变体ywsC'(或YwsC')对应于基因或蛋白ywsC(或YwsC)，因为在图6中显示，枯草芽孢杆菌中同源蛋白的氨基酸序列的比较显示出的多肽，在N端短了16个氨基酸，而其它部分具有相当高的同源性，并因此具有类似的活性。可复制性现在这些基因和基因产物可以通过现有的方法人工合成，而不需要在这些序列的基础上以定向的方式复制所描述的序列。作为其另一个可选择的方案，从芽孢杆菌菌株、特别是可从DSMZ获得的地衣芽孢杆菌菌株DSM13通过PCR分离相关的基因是可能的，通过PCR，使用序列表中显示的相应的边界序列合成引物是可能的。如果使用其它的菌株，获得在每种情况下与其同源的基因，PCR的成功率将随着选择的菌株与地衣芽孢杆菌DSM13的关系的接近程度而增加，因为这可能与引物结合区域中序列同一性的增加是相关联的。实施例2序列同源性在确定了实施例1中的DNA和氨基酸序列后，通过在数据库GenBank(NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI，NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD，USA;http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)禾口SubtilistoftheInstitutePasteru,Paris,France(http:〃genolist.pasteur.fr/Subtilist/genome.cgi)中进行搜索，可以确定到目前为止公开的在每种情况下最相似的同源序列。被确定的DNA和氨基酸序列通过图1到10中显示的比对进行相互比较；所用的计算机程序是VectorNTISuite第七版，从Informaxlnc.(Bethesda,USA)获得。在这种情况下，使用该程序的标准参数，意味着对于DNA序列的比较来说K-元组大小是2，最佳对角线数量为4，窗口大小为4，间隙罚分是5，间隙断开罚分是15，间隙扩展罚分是6.66。对于氨基酸序列的比较来说，使用下面的标准参数K-元组大小是1，最佳对角线数量为5，窗口大小为5，间隙罚分是3，间隙断开罚分是IO，间隙扩展罚分是O.l。这些序列比较的结果汇编在下面的表1中，登记号表示在NCBI数据库中的登记号。表1:与实施例1中发现的基因和蛋白最相似的基因和蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>显然，发现的基因和从其获得的基因产物是新的基因和蛋白，与迄今为止公开的现有技术中的基因和蛋白有显著的不同。实施例3地衣芽孢杆菌中ywsC、ywsC，、ywtA和ywtB基因中的一种或多种功能性失活制备缺失载体的原理这些基因中的每个可以通过例如所谓的缺失载体来进行功能性失活。该方法被描述在例如J.Vehmaanpera等(1991)的论文"GeneticmanipulationofBacillusamyliquefaciens";J.Biotechnol"voll9，p221-240。适合于此的载体是pE194，其特征被描述在T丄Gryczan等(1982)的论文"ReplicationandincompatibilitypropertiesofplasmidpE194in5ac"/ww6"7/，，J.Bacteriol.,vol152,p722-735。该缺失载体的优点是它具有温度依赖性的复制起点。pE194在被转化的细胞中能够在33。C下复制，所以最初在该温度下筛选成功的转化。然后将含有载体的细胞在42。C下培养。缺失载体在该温度下不再复制，并施加选择压力使质粒通过以前选择的同源区域整合到染色体中。然后通过第二个同源区域发生的第二次同源重组，导致将载体与完整的基因拷贝一起从染色体上切除，从而在体内删除了位于染色体上的基因。第二次重组的另一种可能性是整合的逆反应，意味着载体重组出染色体，因此染色体上的基因将完整保留。因此必须通过现有的方法对基因缺失进行检测，例如在用适当的酶对染色体DNA进行限制性消化后进行southern杂交检测，或在PCR技术的帮助下在被扩增的区域的大小的基础上进行检测。因此必需选择被删除基因的两个同源区域，在每种情况下每个区域包含70个碱基对，例如位于被选定基因的5'区域和3'区域。它们被克隆到载体中，方式是它们位于失活蛋白的编码部分的两侧，或直接相连，不含中间区域。这样就获得了缺失载体。本文涉及的ywsC、ywsC，、ywtA和ywtB基因的删除本发明的缺失载体是通过对这4种或3种基因的5'和3'区域进行PCR扩增来构建的。序列表中显示的序列SEQIDNO.1、3、5和7可用于设计适合的引物，它们来源于地衣芽孢杆菌，但是由于预期的同源性，应该也适合于其它菌株，特别是芽孢杆菌属的菌株。两个扩增的区域经过适当的中间克隆，直接连接到用于这种操作的载体上，例如在适合于大肠杆菌的克隆步骤的pUC18载体上。下一步是亚克隆到被选择用来缺失的载体pE194中，并将其转化到枯草芽孢杆菌DB104中，这可以通过例如原生质体转化的方法，参考Chang&Cohen(1979;"HighFrenquencyTransformationof5ac/〃wssw6"7z'sProtoplastsbyPlasmidDNA";ilfo/ec.Ge".Gew".(1979)，V0II68,plll-115)。所有的工作步骤必须在33。C下进行，以确保载体的复制。接下来，经过了中间克隆的载体通过通过原生质体转化方法，转化到所需的宿主菌株，在本情况下是地衣芽孢杆菌中。通过这种方法获得并通过常规方法(通过质粒的抗性标记进行筛选；通过质粒制备和插入片段的PCR检查)被鉴定为阳性的转化子，然后在42。C下培养，通过加入红霉素造成对质粒存在的选择压力。缺失质粒不能在该温度下复制，只有其中的载体整合到了染色体上的细胞能够存活，这种整合最可能发生在同源的或一致的区域中。然后可以通过在无红霉素选择压力下于33°C培养来诱导缺失载体的切除，染色体编码的基因被完全从染色体上删除。删除的成功度检查是用适当的酶对染色体DNA进行限制性消化后进行southern杂交、或通过PCR技术的帮助。这种相关基因被删除的转化子也可以通过形成GLA的能力的受限甚或完全失去来鉴别。附图描述图1:地衣芽孢杆菌DSM13的ywsC基因(SEQIDNO.1)(B丄ywsC)与枯草芽孢杆菌的同源基因ywsC(B.s.ywsC)的比对。图2:地衣芽孢杆菌DSM13的ywsC，基因(SEQIDNO.3)(B丄ywsC')与枯草芽孢杆菌的同源基因ywsC(B.s.ywsC)的比对。图3:地衣芽孢杆菌DSM13的ywtA基因(SEQIDNO.5)(B丄ywtA)与枯草芽孢杆菌的同源基因ywtA(B.s.ywtA)的比对。图4:地衣芽孢杆菌DSM13的ywtB基因(SEQIDNO.7)(B丄ywtB)与枯草芽孢杆菌的同源基因ywtB(B.s.ywtB)的比对。图5:地衣芽孢杆菌DSM13的ywtD基因(SEQIDNO.9)(B丄ywtD)与枯草芽孢杆菌的同源基因ywtD(B.s.ywtD)的比对。图6:地衣芽孢杆菌DSM13的YwsC蛋白(SEQIDNO.2)(B丄YwsC)与枯草芽孢杆菌的同源蛋白YwsC(B.s.YwsC)的比对。图7:地衣芽孢杆菌DSM13的YwsC'蛋白(SEQIDNO.4)(B丄YwsC')与枯草芽孢杆菌的同源蛋白YwsC(B.s.YwsC)的比对。图8:地衣芽孢杆菌DSM13的YwtA蛋白(SEQIDNO.6)(B丄YwtA)与枯草芽孢杆菌的同源蛋白YwtA(B.s.YwtA)的比对。图9:地衣芽孢杆菌DSM13的YwtB蛋白(SEQIDNO.8)(B丄YwtB)与枯草芽孢杆菌的同源蛋白YwtB(B.s.YwtB)的比对。图10:地衣芽孢杆菌DSM13的YwtD蛋白(SEQIDNO.10)(B丄YwtD)与枯草芽孢杆菌的同源蛋白YwtD(B.s.YwtD)的比对。权利要求1.一种蛋白YwsC(CapB，PgsB)，其参与聚氨基酸的形成，并且为其编码的核苷酸序列ywsC与SEQIDNO.1中表示的核苷酸序列显示出至少80％的同一性。2.根据权利要求1所述的蛋白YwsC，为其编码的核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.1中表示的核苷酸序列显示出至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。3.—种蛋白YwsC(CapB，PgsB)，其参与聚氨基酸的形成，其氨基酸序列与SEQIDNO.2中表示的氨基酸序列显示出至少91%的同一性，随着优选性的增加，显示出至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。4.一种蛋白YwsC，(YwsC的截短变体)，其参与聚氨基酸的形成，并且为其编码的核苷酸序列ywsC'与SEQIDNO.3中表示的核苷酸序列显示出至少83%的同一性。5.根据权利要求4所述的蛋白YwsC'，为其编码的核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.3中表示的核苷酸序列显示出至少85%、90%、92°/。、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。6.—种蛋白YwsC'(YwsC的截短变体)，其参与聚氨基酸的形成，并且其氨基酸序列与SEQIDNO.4中表示的氨基酸序列显示出至少94%的同一性，随着优选性的增加，显示出至少95%、96。/。、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。7.—种蛋白YwtA(CapC,PgsC)，其参与聚氨基酸的形成，并且为其编码的核苷酸序列ywtA与SEQIDNO.5中表示的核苷酸序列显示出至少82%的同一性。8.根据权利要求7所述的蛋白YwtA，其中为其编码的核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.5中表示的核苷酸序列显示出至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。9.一种蛋白YwtA(CapC，PgsC)，其参与聚氨基酸的形成，并且其氨基酸序列与SEQIDNO.6中表示的氨基酸序列显示出至少94%的同—性，随着优选性的增加，显示出至少95%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。10.—种蛋白YwtB(CapA，PgsA)，其参与聚氨基酸的形成，并且为其编码的核苷酸序列yWtB与SEQIDNO.7中表示的核苷酸序列显示出至少72%的同一性。11，根据权利要求IO所述的蛋白YwtB，其中为其编码的核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.7中表示的核苷酸序列显示出至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。12.—种蛋白YwtB(CapA,PgsA)，其参与聚氨基酸的形成，并且其氨基酸序列与SEQIDNO.8中表示的氨基酸序列显示出至少70%的同一性，随着优选性的增加，显示出至少75%、80%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。13.—种蛋白YwtD(Dep，PgdS)，其参与聚氨基酸的降解，并且为其编码的核苷酸序列ywtD与SEQIDNO.9中表示的核苷酸序列显示出至少67%的同一性。14.根据权利要求13所述的蛋白YwtD，其中为其编码的核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDN0.9中表示的核苷酸序列显示出至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。15.—种蛋白YwtD(Dep，PgdS),其参与聚氨基酸的降解，并且其氨基酸序列与SEQIDNO.10中表示的氨基酸序列显示出至少62%的同一性，随着优选性的增加，显示出至少65%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。16.根据权利要求1至3、4至6、7至9、10至12、或13至15中一项或多项所述的参与聚氨基酸形成或降解的蛋白，其由微生物天然产生，该微生物优选为细菌，特别优选为革兰氏阳性细菌，并且其中优选为芽孢杆菌属的细菌，其中特别优选的是地衣芽孢杆菌(B.Ucheniformis)，以及其中非常特别优选的是地衣芽孢杆菌DSM13。17.—种核酸ywsC(capB，pgsB)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的形成，并且其核苷酸序列与SEQIDNO.1中表示的核苷酸序列显示出至少80%的同一性。18.根据权利要求17所述的核酸ywsC，其核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.1中表示的核苷酸序列显示出至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100%的同一性。19.一种核酸ywsC，(ywsC的截短变体)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的形成，并且其核苷酸序列与SEQIDNO.3中表示的核苷酸序列显示出至少83%的同一性。20.根据权利要求19所述的核酸ywsC'，其核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.3中表示的核苷酸序列显示出至少85%、90%、92%、94%、96°/。、97°/。、98°/。、99%，并特别优选100%的同一性。21.—种核酸ywtA(capC,pgsC)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的形成，并且其核苷酸序列与SEQIDNO.5中表示的核苷酸序列显示出至少82%的同一性。22.根据权利要求21所述的核酸ywtA，其核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.5中表示的核苷酸序列显示出至少85%、90%、92°/。、94%、96%、97%、98%、99°/。，并特别优选100%的同一性。23.—种核酸ywtB(capA，pgsA)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的形成，并且其核苷酸序列与SEQIDNO.7中表示的核苷酸序列显示出至少72%的同一性。24.根据权利要求23所述的核酸ywtB，其核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.7中表示的核苷酸序列显示出至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%,并特别优选100%的同一性。25.—种核酸ywtD(dep，pgdS)，其编码的基因产物参与聚氨基酸的降解，并且其核苷酸序列与SEQIDNO.9中表示的核苷酸序列显示出至少67%的同一性。26.根据权利要求25所述的核酸ywtD，其核苷酸序列随着优选性的增加，与SEQIDNO.9中表示的核苷酸序列显示出至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%，并特别优选100°/。的同一性。27.根据权利要求17和/或18、19和/或20、21禾口/或22、23和/或24、或者25和/或26中任一项所述的核酸，其天然存在于微生物中，该微生物优选为细菌，特别优选为革兰氏阳性细菌，并且其中优选为芽孢杆菌属的细菌，其中特别优选的是地衣芽孢杆菌，以及其中非常特别优选的是地衣芽孢杆菌DSM13。28.—种核酸，其编码权利要求1至16中任一项所述的蛋白。29.—种载体，其含有权利要求17至28所述的核酸之一。30.根据权利要求29所述的载体，其含有两种或更多种权利要求17至28所述的核酸。31.根据权利要求29或30所述的克隆载体。32.根据权利要求29或30所述的表达载体。33.—种细胞，其在遗传修饰后含有权利要求17至28所述的核酸之一。34.根据权利要求33所述的细胞，其中所述核酸是载体的一部分，特别是权利要求29至32中任一项所述的载体的一部分。35.根据权利要求33或34所述的细胞，该细胞是细菌。36.根据权利要求35所述的细胞，该细胞是革兰氏阴性细菌，特别是大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、假单胞菌或黄单胞菌属的细菌之一，特别是大肠杆菌K12、大肠杆菌B或植生克雷伯氏杆菌(Klebsiellaplanticola)菌株，非常特别的是大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌RV308、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM109、大肠杆菌XL-1或植生克雷伯氏杆菌(Rf)菌株的衍生株。37.根据权利要求35所述的细胞，该细胞是革兰氏阳性细菌，特别是芽孢杆菌、葡萄球菌或棒状杆菌属之一，非常特别是缓慢芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.myloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、球形芽孢杆菌(B.globigii)或嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株，其中非常特别优选的又是地衣芽孢杆菌DSM13的衍生株。38.—种方法，用于制备根据权利要求1至16所述的基因产物YwsC、YwsC，、YwtA、YwtB和YwtD中的一种或多种。39.根据权利要求38所述的方法，其中使用权利要求17至28中任一项所述的核酸，优选使用权利要求29至32中任一项所述的载体，特别优选使用权利要求33至37中任一项所述的细胞。40.根据权利要求38或39所述的方法，其中核苷酸序列的一个、或者优选多个密码子被改变以适应宿主菌株的密码子用法。41.根据权利要求17禾n/或18所述的核酸ywsC的用途，根据权利要求19和/或20所述的核酸ywsC'的用途，根据权利要求21和/或22所述的核酸ywtA的用途，根据权利要求23和/或24所述的核酸ywtB的用途，或根据权利要求28所述的相应核酸的用途，或每种情况下其部分核酸的用途，用于对微生物中的相关基因进行功能性失活，这些基因在每种情况下分别为ywsC、ywsC'、ywtA和ywtB。42.根据权利要求25和/或26所述的核酸ywtD的用途，或根据权利要求28所述的的相应核酸的用途，用于增强微生物中相关基因ywtD的活性。43.根据权利要求41或42所述的用途，其中功能性失活或活性增加发生在微生物的发酵过程中，优选将聚氨基酸引起的粘液减少到50%，特别优选减少到少于20%，非常特别优选减少到少于5%。44.根据权利要求41至43中任一项所述的用途，其中随着优选性的增加，ywsC、ywsC，、ywtA和ywtB基因中的2种、3种或4种被失活，优选与ywtD基因介导的活性的增强组合。45.根据权利要求41至44中任一项所述的用途，其中在每种情况下，编码无活性蛋白并具有点突变的核酸用于功能性失活。46.根据权利要求41至45中任一项所述的用途，其中在每种情况下被用于功能性失活的核酸具有缺失突变或插入突变，优选包含边界序列，该序列在每种情况下包含蛋白编码区域的至少70到150个核酸位置。47.根据权利要求41至46中任一项所述的用途，其中表达载体用于ywtD基因介导的活性的增强，优选的表达载体包含该基因以及调控该基因的核酸片段。48.—种微生物，其中基因ywsC、ywsC，、ywtA或ywtB中的至少一种被功能性失活，或ywtD具有增强的活性。49.根据权利要求48所述的微生物，其中随着优选性的增加，ywsC、ywsC，、ywtA或ywtB基因中的2种、3种或4种被失活，优选与ywtD基因介导的活性的增强组合。50.根据权利要求48或49所述的微生物，其为是细菌。51.根据权利要求50所述的微生物，其为革兰氏阴性细菌，特别是大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、假单胞菌或黄单胞菌属之一，特别是大肠杆菌K12、大肠杆菌B或植生克雷伯氏杆菌菌株，非常特别的是大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌RV308、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM109、大肠杆菌XL-1或植生克雷伯氏杆菌(Rf)菌株的衍生株。52.根据权利要求50所述的微生物，其为革兰氏阳性细菌，特别是芽孢杆菌、葡萄球菌或棒状杆菌属之一，非常特别是缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌或嗜碱芽孢杆菌、肉葡萄球菌或谷氨酸棒状杆菌菌株，其中非常特别优选的又是地衣芽孢杆菌DSM13。53.—种方法，用于对权利要求48到52中任一项所述的微生物进行发酵。54.根据权利要求53所述的方法，该方法用于制备有价值产物，特别是低分子量化合物或蛋白。55.根据权利要求54所述的方法，其中的低分子量化合物是天然产物、膳食补剂或药物相关化合物。56.根据权利要求54所述的方法，其中的蛋白是酶，特别是oc-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂酶、氧化还原酶、过氧化物酶、漆酶、氧化酶和半纤维素酶中的一种。57.—种制备、修饰或降解聚Y谷氨酸的微生物方法，其中根据权利要求17和/或18、19禾口/或20、21和/或22、23禾口/或24、或者25和/或26中任一项所述的核酸之一，或根据权利要求28所述的相应核酸，被用于转基因，优选形成根据权利要求1至16中一项或多项所述的相应蛋白。58.根据权利要求57所述的方法，其中使用芽孢杆菌属的微生物，特别是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。59.—种制备、修饰或降解聚Y谷氨酸的无细胞方法，其中包含根据权利要求1至3、4至6、7至9、10至12、或者13至15中任一项所述的参与聚氨基酸形成的基因产物，优选使用根据权利要求17至28中任一项所述的相应核酸。60.根据权利要求57到59中任一项所述的方法，其中使用了2种、优选3种、特别优选4种不同的所述基因产物和核酸。全文摘要本发明涉及5种或4种来自地衣芽胞杆菌的新基因及其基因产物，以及充分相似的基因和蛋白，其在体内参与聚氨基酸的形成。所讨论的基因是ywsC、ywsC’、ywtA、ywtB和ywtD或其编码的蛋白。基因ywsC、ywsC’、ywrA和ywtB能通过微生物来改进生物技术生产方法，其中它们被功能性失活；相反，基因ywtD，其编码的肽降解聚γ谷氨酸，能通过增加表达的方式有助于生物技术生产方法的改进。所述基因能确实、优选用于导致聚γ谷氨酸的修饰或降解。文档编号C12N5/10GK101384615SQ200580020969公开日2009年3月11日申请日期2005年6月11日优先权日2004年6月26日发明者克里斯蒂娜·赫茨伯格,卡尔-海茵茨·毛雷尔,安克·亨纳,斯特凡·埃弗斯,格哈德·戈特沙尔克,比吉特·法伊特,海科·利泽冈,科尼利厄斯·贝斯勒,约尔格·费舍,阿尔明·埃伦赖希申请人:汉高两合股份公司