10 6个细胞 /cm2的密度接种。在优选方面中，骨髓细胞以约10 5_约106个细胞/cm2的密度接种。
[0095] 如本文中所用，"神经变性"是指任何导致包括神经细胞死亡的神经细胞的结构或 功能逐渐丧失的病理状态。因此，神经变性是神经失调引起的病理状态。
[0096] 在一个实施方式中，短语"神经细胞（neural cell) "包括神经细胞（nerve cell) (即，神经元，例如单极、双极或多极神经元）和它们的前体以及神经胶质细胞（例如，大胶 质细胞，如，少突胶质细胞、雪旺细胞和星形胶质细胞或小胶质细胞）和它们的前体。
[0097] 在一个实施方式中，"有效量"是指引起与神经变性相关的症状和/或病理状态的 临床上明显改善（包括减缓、停止或逆转神经变性、减少神经功能缺损或改善神经反应）所 需要的最佳细胞数量。在一些实施方式中，有效量的NCS-01细胞群是指减少由中风后急性 神经变性的突然发作引起的梗塞体积所需要的最佳细胞数量。本领域技术人员可使用常规 实验测定用于特定生物体的NCS-01细胞群的适当的有效量。
[0098] 如本文中所用，"治疗神经变性"是指通过NCS-01细胞群治疗神经变性，导致与神 经变性相关的症状和/或病理状态的临床上明显改善，包括减缓、停止或逆转神经变性、减 少神经功能缺损或改善神经反应。
[0099] 如本文中所用，"溶栓剂"是指在称为溶栓的程序中医学上用于溶解血块的药 物。溶栓药物的非限制性实例包括组织纤溶酶原组织活化剂tPA、阿替普酶（Activase)、 瑞替普酶（Retavase)、替奈普酶（TNKase)、阿尼普酶（Eminase)、链激酶（Kabikinase、 Streptase)和尿激酶（Abbokinase) 〇
[0100] 下文描述了用于从未处理的全骨髓中分离并表征异质性骨髓细胞亚群的程序，其 能最佳治疗包括治疗由缺血引起的神经变性的神经变性。
[0101] 分离有效治疗由缺血引起的神经变性的候选骨髓细胞群
[0102] 从未使用抗有丝分裂剂或抗代谢剂，如5-氟尿嘧啶（5-FU)，预治疗的哺乳动物获 取未处理的全骨髓。
[0103] 然后将该未处理的骨髓直接铺板在组织/细胞培养塑料上并在含血清的培养基 中连续传代以进行扩增。在每次传代时，细胞以极低的细胞密度接种，即约750个细胞/cm 2 或更少，并在附加传代之前培养至接近汇合。通过洗涤除去未附着的细胞。由于骨髓不通 过密度分离法处理，初始全骨髓细胞群包括造血细胞与非造血细胞以及成核骨髓细胞与非 成核骨髓细胞二者。
[0104] 然后优选地分别在第3代传代和第5代传代时建立主细胞库（master cell bank， MCB)和工作细胞库（working cell bank，WCB)，并冷藏保存。在需要时，以极低的密度接种 WCB细胞，例如约750个细胞/cm2或更少，并在使用标准程序收获并冷藏保存之前在含血清 的培养基中进行扩增。
[0105] 用于评估骨髓细胞群减轻神经变性的能力的两步骤选择方案
[0106] "候选"骨髓细胞群可随后使用两步骤程序进行筛选，选择用于治疗神经变性的最 佳骨髓细胞群。
[0107] 在第一步骤中，在体外氧葡萄糖剥夺分析中测试候选骨髓细胞群，在该分析中在 模拟神经变性的实验条件下共培养候选骨髓细胞群与神经细胞。然后筛选显示体外减轻神 经变性的细胞群的体内治疗神经变性的能力。
[0108] 在第二步骤中，在由缺血引起的神经变性的大鼠MCAO模型中评估选择的候选骨 髓细胞群。然后选择显示出最高的体内减轻神经变性的活性的候选异质性骨髓细胞群。
[0109] 通过该两步骤筛选程序选择的异质性骨髓细胞群被称为NCS-01细胞群或 NCS-01。
[0110] 鉴定用于分离具有神经变性减轻活性的骨髓细胞群的最佳细胞培养条件
[0111] 该两步骤筛选程序也可用于鉴定最佳实验条件，如用于培养能够治疗神经变性的 骨髓细胞群的接种时的细胞密度、细胞传代次数、培养基组成或细胞分离方法。
[0112] 因此，使用该两步骤程序，每次传代时的最佳再接种细胞浓度为约750个细胞/cm 2 或更少。最佳培养基是含血清的培养基。从初次铺板未处理的全骨髓开始，NCS-01细胞群 可传代不超过约7次、或约6次、或约5次、或约4次、或约3次或约2次。从初次铺板未处 理的全骨髓开始，延长的传代，即超过7次传代，减少或消除NCS-01在0⑶体外分析和在 MCA0大鼠模型中治疗神经变性的能力。
[0113] 0⑶分析和神经变性MCA0大鼠模型现在下文中详细描述。
[0114] 体外筛选能够治疗神经变性的骨髓细胞群
[0115] 首先在模拟由缺血引起的神经变性的氧-葡萄糖剥夺（0GD)培养条件之后在神经 元-星形胶质细胞共培养物中筛选具有预防神经变性的能力的候选骨髓细胞群。
[0116] 首先使大鼠或人的神经元和星形胶质细胞的初级混合培养物暴露于氧葡萄糖剥 夺（0GD)培养条件（例如，8%的氧气，不含葡萄糖的培养基）约0. 5小时至3小时以诱导神 经变性。然后中断细胞培养物的氧葡萄糖剥夺，将经0GD诱导的神经细胞在生理条件下培 养2小时，然后在候选骨髓细胞群存在的情况下再共培养3小时。然后在0GD之后0小时 和5小时，通过测量在候选骨髓细胞群存在或不存在的情况下的宿主细胞活力来评估神经 变性。宿主细胞（神经元和星形胶质细胞）活力可使用例如台盼蓝染色法和/或MTT (溴 化-3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯基四氮唑）分析来评估。
[0117] 在候选骨髓细胞群存在的情况下的细胞活力比对照（不添加候选骨髓细胞群）的 细胞活力增加约5%、或约10%、或约15%、或约20%或约25%或更高，表明候选骨髓细胞 群可以保护并挽救神经元/星形胶质细胞共培养物免受由氧和葡萄糖剥夺引起的神经变 性。
[0118] 此外，也可以使用可商购ELISA试剂盒来分析在候选骨髓细胞群存在或不存在的 情况下下经受0GD条件的神经元/星形胶质细胞培养物的培养基的营养因子例如bFGF和 /或IL-6的诱导分泌。
[0119] 在某些实施方式中，根据候选骨髓细胞群响应氧葡萄糖剥夺（而不是在氧葡萄糖 剥夺不存在的情况下）而诱导神经元-星形胶质细胞共培养物的培养基中的分泌的bFGF 和/或IL-6的量增加的能力来选择候选骨髓细胞群。
[0120] 在其他实施方式中，根据候选骨髓细胞群响应氧葡萄糖剥夺（而不是在氧葡萄糖 剥夺不存在的情况下）而诱导神经元_星形胶质细胞共培养物的培养基中分泌的bFGF和 /或IL-6的量增加至少两倍或更多的能力来选择候选骨髓细胞群。
[0121] 然后，选择降低0GD诱导的细胞死亡发生率并诱导分泌的营养因子（如bFGF和/ 或IL-6)的量增加的候选骨髓细胞群，以用于在体内MCAO大鼠模型中进行筛选（参见下 文）。
[0122] 例如，如果候选骨髓细胞群使0⑶诱导的细胞死亡发生率降低超过约25%并使分 泌的营养因子的量增加至少10%或更多，可选择该候选骨髓细胞群以进行进一步筛选。
[0123] 体内筛选能够治疗神经变性的候选骨髓细胞群
[0124] 测试上述0⑶分析筛选步骤中选择的候选骨髓细胞群的体内治疗神经变 性的能力。例如，可测试候选骨髓细胞群在包括神经变性疾病的转基因模型的神 经变性实验动物模型中治疗神经变性的能力（参见，例如，Harvey等，Transgenic animal models of neurodegeneration based on human genetic studies， J Neural Transm. (2011) 118 (1):27-45 ；Traneikova 等，Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. (2011)?100:419-82 ； Chan 等，Generation of transgenic monkeys with human inherited genetic disease Methods (2009)49(1):78-84 ;Rockenstein 等，Transgenic animal models of neurodegenerative diseases and their application to treatment development Adv Drug Deliv Rev. (2007)59(11): 1093-102)。
[0125] 在一个实施方式中，神经变性实验动物模型可以是中风/脑缺血动物模型 (Graham等人综述，Comp Med.2004 54(5):486-96)，如MCA0大鼠模型，其中围绕脑动脉的 手术植入的结扎线的收缩通过限制流向大脑的血流来模拟缺血性中风的效果并引起缺血 和后续的神经变性。
[0126] 在暂时性MCA0模型中，通过恒定速率输注至暂时性MCA0大鼠的血流中来施用 0GD分析中选择的候选骨髓细胞群。本领域技术人员可以测定范围可以例如从7. 5x 104至 3. 75x 107个细胞的适合剂量。细胞可注射至例如颈静脉（IV)或颈动脉（ICA)中。对照由 施用等体积冷藏保存培养基或盐水溶液组成。然后，候选骨髓群中的细胞迀移至由暂时性 MCA0引起的梗塞的位点。
[0127] 然后，在梗塞形成后的不同时间使用改良Bederson神经测试法（modified Bederson Neurologic Test)评估0GD选择的骨髓细胞群存在或不存在的情况下的神经功 能。随后，处死大鼠，并通过苏木精与曙红（H&E)或尼氏染色法（Nissl staining)对来自 经处理和未经处理的MCA0大鼠的脑组织切片进行染色，测量梗塞体积和宿主细胞存活。然 后在MCA0后最多28天，根据骨髓细胞群与对照动物相比改善神经功能、增加宿主细胞存活 和减少梗塞体积的能力来选择骨髓细胞群。
[0128] 用于治疗由缺血性中风引起的神经变性的组合疗法
[0129] 使通过大脑中动脉的血流停止延长的时间段，模拟血块造成的永久性动脉阻塞。 在允许再灌注的恢复之前使通过脑动脉的血流停止有限的时间段的暂时性阻塞，旨在模拟 疗法如溶栓或机械性血块去除，其在由缺血性中风引起的动脉阻塞之后立即恢复使血液流 向中风半暗带。
[0130] 在许多方面，对暂时性MCA0大鼠施用NCS-01细胞群模拟溶栓或机械性血块去除 (包括血管成形术或手术植入支架）导致的阻塞动脉再灌注。
[0131] 当神经变性由缺血性中风引起时，NCS-01细胞群可与溶栓疗法结合来治疗由缺血 引起的神经变性。在例如美国专利第5, 945, 432号和第6