, 821，985号中可找到溶栓剂和它 们的施用的描述。
[0132] 缺血事件后注射的溶栓剂可在注射NCS-01细胞群之前、同时或之后施用。
[0133] 根据本领域公知的程序，可与注射所公开的NCS-01细胞组合物组合的用于改善 流向中风半暗带的血流的机械程序的非限制性实例包括血管成形术或植入支架。
[0134] 本发明将参考以下实施例作进一步详细描述。 实施例
[0135] 实施例陈述了根据本发明的用于分离、选择和使用骨髓细胞亚群来治疗神经变性 的方法。应理解这些实施例中描述的方法步骤并非旨在限制。本发明除上文所述以外的进 一步目的和优势从实施例来看将是明显的，所述实施例并非旨在限制本发明的范围。
[0136] 实施例1 :分离NCS-01细胞群
[0137] 1)分离候选骨髓细胞群
[0138] 通过以下生产方法分离异质性骨髓细胞群：
[0139] 鲁从合格商业供货商提供的年龄为50岁或更年轻的经预筛选的健康供体收获未 处理的人骨髓。从未使用任何抗有丝分裂剂如5-氟尿嘧啶预治疗的供体收获骨髓。
[0140] ?然后，以低密度（102_106个细胞/cm2)将经处理过或未经处理的骨髓接种于组 织/细胞培养塑料表面上，并在存在含血清的培养基的情况下培养；
[0141] 鲁在允许细胞附着于塑料的若干天后，通过洗涤除去未附着的细胞；和
[0142] 鲁在含血清的培养基中将附着的细胞群培养至接近汇合；对培养的细胞群连续传 代不超过约七次连续传代，其中，在每次传代时，以低密度接种培养的细胞。
[0143] 为选择用于分离可以治疗神经变性的骨髓细胞群的最佳培养条件，将细胞群最初 在不同培养条件下生长，所述培养条件如接种时的细胞密度、细胞传代次数、培养基组成或 细胞分离方法（参见表1)。
[0144] 在补充有2禮61扯3]\&?(11^1钍(^611)和10%胎牛血清$85，办(：1〇116或618〇)) 的<1-]/^]\1或者补充有211116111丨&]\^?(111￥；[1：1'08611)和10%胎牛血清（?133，办(]1〇116或 GIBC0)的a-MEM(Mediate Ch)的存在下，将来自未处理的骨髓或者在密度分离法或ACK裂 解后的骨髓细胞接种在组织/细胞培养塑料上。在洗涤以除去未附着的细胞之后，允许附 着的细胞增殖至接近汇合。然后将细胞连续传代总计3次、4次、5次或6次传代。
[0145] 然后测试候选骨髓细胞群在体外0GD分析和体内MCA0研究中治疗神经变性的能 力。
[0146] 表1
[0147]
[0148] * 骨髓
[0149] 2)使用体外氧/葡萄糖剥夺（0GD)方案进行初次筛选
[0150] 使用体外氧/葡萄糖剥夺（0GD)实验方案来评估上文概述的生产方法中的不同参 数，如在密度分离法存在或不存在的情况下制备骨髓、接种密度、传代次数、培养基和/或 它们的组合，从而确定用于分离治疗神经变性的候选骨髓细胞群的最佳程序。
[0151] 由于体外0GD模型模拟由缺血性中风引起的神经变性，选择其作为初步筛选。具 体而言，0⑶测试特定候选骨髓细胞亚群是否可以预防培养物中的神经细胞死亡并诱导分 泌神经保护性营养因子，如bFGF和IL-6。
[0152] 在体外氧葡萄糖剥夺（0GD)模型中，大鼠神经元与星形胶质细胞（以1:1的比例） 的初级混合培养物暴露于0GD损伤（8 %的氧气；不含葡萄糖的厄尔平衡盐溶液）90分钟， 并回到生理条件下持续2小时，在此之后，将候选骨髓细胞群加入经0⑶处理的神经元-星 形胶质细胞共培养物中再培养3小时。在0GD后立即使用和在0GD后5小时时使用标准台 盼蓝染色法和MTT (溴化-3- (4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2, 5-二苯基四氮唑）方法评估神 经细胞活力。
[0153] 细胞培养
[0154] 根据供货商的方案（CAMBREX，MD)将大鼠神经元与星形胶质细胞的初级混合培养 物维持在培养物中。解冻后立即将细胞（4xl04个细胞/孔）接种在涂覆有聚赖氨酸的96 孔板中，并在含有2mM的L-谷氨酸盐、2%的B27(GIBC0, CA)和50U/ml的盘尼西林与链霉 素的神经基础培养基（GIBC0，CA)中，在含有5%0)2的潮湿气氛中在37°C下生长7-10天。 然后分别使用MAP2和GFAP免疫染色法评估神经元细胞群和星形胶质细胞群的纯度，发现 尚于99 %。
[0155] 氧-葡萄糖剥夺（0GD)和与候选骨髓细胞群共培养
[0156] 使培养的细胞暴露于如前所述但略加修改的0GD损伤模型（Malagelada等， Stroke (2004) 35 (10) : 2396-2401)。简单来说，将培养基用不含葡萄糖的厄尔平衡盐溶液 (BSS)替代，该不含葡萄糖的厄尔平衡盐溶液具有以下组成的NaCl、5. 4mM的KC1、 0? 8mM 的 MgS04、ImM 的 NaH2P04、26. 2mM 的 NaHC03、0.0 lmM 的甘氨酸、1. 8mM 的 0&(：12且 pH 调 节至7. 4。将培养的细胞置于加湿室中以使用92%队与8% 02的连续流平衡15分钟。在 平衡完成之后，密封所述室并将其在37°C培养箱中放置90分钟。在这一时间段之后，通过 将葡萄糖加入培养基中来终止0GD，并将培养物返回至标准的95% 02和5% C02培养箱。然 后在标准培养基中且在正常含氧量条件下允许进行2小时"再灌注"，在此之后，将候选骨 髓（BM)细胞群加入经0GD处理的混合神经元-神经胶质细胞培养物中约3小时。然后通 过洗涤从混合培养物分离上清液和骨髓细胞群。之后，在细胞上进行细胞活力和免疫细胞 化学试验，并如下所述使用可商购ELISA分析来测量分泌的营养因子的量。
[0157] 细胞活力分析
[0158] 在两个时间点评估细胞活力：在0GD后立即进彳丁，和在0GD后5小时时进彳丁（艮口， 再灌注2小时加上使用选择的骨髓细胞群处理3小时）。对于0⑶后活力分析，使含有源自 骨髓的细胞的上清液与附着的混合神经细胞培养物分离。进行台盼蓝染色法，并在每个孔 (每个处理条件n = 5)中的三个随机选择区域（0. 2mm2)中计算平均活细胞数，以显示每个 处理条件的细胞活力。此外，对从上清液中作为沉淀收获的源自骨髓的细胞亚群进行台盼 蓝染色。
[0159] ELISA 分析
[0160] 推测源自骨髓的细胞所分泌的营养因子如bFGF和IL-6以及可能的神经营养因子 参与治疗由0GD培养条件模拟的神经变性。因此，测量分泌到培养基中的这些分子的量提 供了借此评估可以体内治疗神经变性的候选骨髓细胞群的标准。收集来自标准培养条件下 或暴露于0GD的神经细胞与候选骨髓细胞群的共培养物的上清液，并根据制造商说明书使 用可商购ELISA试剂盒分析其中营养因子分泌的存在。
[0161] 图1A和1B示出根据上文表1中描述的参数处理的源自骨髓的细胞群的0⑶分析 结果。
[0162] 基于图1A和1B所述结果，选择a MEM+10% FBS作为最佳细胞培养基，并发现未处 理的骨髓优于通过密度分离法（如Ficoll-Paque或Percoll)或ACK裂解液处理的骨髓。 发现未处理的骨髓细胞在a MEM+10 % FBS的培养基中的最佳传代次数是不超过7次传代。
[0163] 3)使用体内大脑中动脉阻塞大鼠模型进行候选骨髓细胞群的第二次筛选和选择
[0164] 基于在体外0GD模型中的初步筛选所获得的结果，通过比较使用候选骨髓细胞群 处理的MCA0大鼠与仅接受盐水溶液处理的MCA0大鼠的神经功能缺损和梗塞体积，评估每 种候选骨髓细胞群治疗神经变性的生物活性。
[0165] 大脑中动脉阻塞（MCA0)手术
[0166] 使用异氟醚（在氧气中含1. 5%~2. 5% )麻醉动物。将头皮剃毛，并使用酒精和 氯己定手术擦拭液擦拭。然后将动物置于立体定位装置中。从眼部稍微后方处开始，制造 长约2. 5cm的中线矢状切口，使用手术铲的圆端使颅骨区域暴露。以前囱作为参考点，从以 下坐标（AP :+2. 0, ML :±2. 0)获得基线（即，中风手术前）激光多普勒记录。将从下颂到 胸骨柄处的颈腹侧（ventral neck)上的皮肤剃毛，并使用酒精和氯己定手术擦拭液擦拭。 然后将动物移至手术显微镜下方。在右侧颈动脉上方制造皮肤切口。分离颈外动脉，并在 尽可能远处的地方将其结扎。烧灼枕动脉。有时可能也需要烧灼从颈外动脉延伸出的另一 条或两条分支。在颈外动脉近端处设置第二个结扎，然后在结扎之间切断颈外动脉。结扎 翼颚动脉。在此之后，在颈总动脉周围临时缝合以提供张力并限制血流。使用结扎拉回颈 外动脉的近端，有效地拉直颈动脉分叉。使用微型剪刀对在颈外动脉的端部（stump)制造 切口，将具有预制末端的4-0尼龙线插入颈内动脉并向上递入直到感到阻力为止（约15-17 毫米）。这有效地阻断大脑中动脉（MCA)。在颈外动脉的近端周围利用结扎将线固定在适当 的位置。分离对侧的颈总动脉，并使用临时结扎将其固定。使用缝合钉闭合皮肤切口。然 后将动物固定于立体定位装置，以进行激光多普勒记录来显示成功的MCA阻塞。5分钟后， 除去对侧颈总动脉的结扎。中断异氟醚，并将动物置于电热毯上的恢复笼中。60分钟后，再 次使用异氟醚麻醉动物，打开切口以在暂时性模型中进行测试。除去引起阻塞的线，并将靠 近颈动脉分叉的颈外动脉端部结扎。使用缝合钉闭合皮肤切口。再次将动物固定于立体定 位装置，以进行激光多普勒记录来显示成功的再灌注。最后，将动物置于电热毯上的恢复笼 中。
[0167] 神经功能测试
[0168] 对每只大鼠进行公知的改良Bederson神经测试，其涉及获得以下各项来自每只 大鼠的评分：
[0169] 鲁对侧后肢回缩，其在将动物后肢朝侧向移动2-3cm后，测量动物将后肢复位的 能力，评级从〇 (立刻复位）到3 (没有复位）；
[0170] 鲁横木行走能力，评级从容易横穿2. 4cm宽、80cm长的横木的大鼠的0级到不能在 横木上停留10秒的大鼠的3级；和
[0171] 鲁双边前爪抓握，其测量在2mm直径钢杆上保持的能力，评级从具有正常前爪抓 握行为的大鼠的〇级至不能使用前爪抓握的大鼠的3级。
[0172] 在每个评估日，在约15分钟的时间段内评估所有三项测试的评分。计算三项测试 的平均评分以提供范围从〇(正常神经功能）到最大为3 (严重神经功能缺损）的综合神经 功能缺损评分。因此，分数越高，神经功能缺损越大。
[0173] 基于初步研究，评分高于约2. 5则代表动物具有中风的神经功能缺损特征。
[0174] 组织学
[0175]