gB5 中。
[0093] 在本发明的实施方案中，将 0? 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、3、4、 5、6、7、8、9、10mMNaH2P〇J[]_AGamborgB5 中。
[0094] 在本发明的实施方案中，将大约 0? 001、0. 002、0. 003、0. 004、0. 005、0. 006、0. 007、 0? 008、0. 009、0.OlmM生物素加入GamborgB5 中。
[0095] 在本发明的实施方案中，将大约 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、2、 3、4mMD_泛酸妈加入GamborgB5中。
[0096] 在本发明的实施方案中，加入GamborgB5中的蔗糖浓度为2-4%。在另一实施方 案中，浓度为大约3%
[0097] 根据进一步的实施方案，酪蛋白、酪蛋白水解物或者酪蛋白胨可以包含在细胞生 长培养基中。根据进一步的实施方案，生长激素可以包含在细胞生长培养基中。根据进一 步的实施方案，生长培养基包含激素。根据一些实施方案，果实细胞不用添加激素而生长。
[0098] 根据一些实施方案可以在所述方法的一或多个阶段使用的植物培养基的 例子包括但不限于：Anderson(Anderson,InVitro14:334，1978;Anderson,Act. Hort., 112:13, 1980),CheeandPool(Sci.Hort.32:85, 1987),CLC/Ipomoea(CP) (Cheeetal.,J.Am.Soc.Hort.Sci. 117:663, 1992),Chu(N.sub.6)(Chuet al.,ScientiaSinic. 18:659, 1975 ；Chu,Proc.Symp.PlantTiss.Cult.,Peking 43,1978), DCR (Gupta and Durzan,Plant Cell Rep. 4:177, 1985), DKW/Juglans(Driver and Kuniyuki, HortScience 19:507, 1984 ；McGranahan et al.,in:Bonga and Durzan,eds.,Cell and Tissue Culture in Forestry,MartinusNijhoff,D ordrecht, 1987),De Greef and Jacobs (De Greef and Jacobs,Plant Sc i. Lett.17:55,1979), Eriksson(ER)(Eriksson, Physiol. Plant. 18:976, 1965), Gresshoff and Doy(DBM2) (Gresshoff and Doy,Z Pflanzenphysiol.73:132, 1974),Heller 's (Heller, Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. 11th Ser. 14:1, 1953), Hoagland' s(Ho agland and Arnon, Circular 347,Calif.Agr.Exp. Stat. , Berkeley, 1950), Kao and Michayluk (Kao and Michayluk, Planta 126:105, 1975) , Linsmaier and Skoog(Linsmaier and Skoog,Physiol. Plant. 18:100,1965),Litvay's (LM)(Litvay et al. , Plant Cell Rep. 4:325, 1985), Nitsch and Nitsch(Nitsch and Nitsch, Science 163:85, 1969), Quoirin and Lepoivre(Quoirin et al. , C. R. Res. Sta. Cult.Fruit Mar. , Gembloux 93,1977), Schenk and Hildebrandt(Schenk and Hildebrandt, Can. J. Bo t.50:199,1972), White's(White, The Cultivation of Animal and Plant Cells, Ronald Press, NY, 1963)等。
[0099] 根据一些其它举例的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间持续混合。 根据进一步的实施方案，果实细胞和培养基在第一个步骤期间间歇混合。根据一些实施方 案，第一个步骤期间的温度为20°C-30°C。根据一些实施方案，在第一个步骤期间的温度为 22°C_28°C。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天。根据一些实施方 案，果实细胞在第一个步骤生长多于7天。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长 多于5天但少于2周。根据一些实施方案，果实细胞在第一个步骤生长多于5天以上但少 于12天。
[0100] 根据一些举例的实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括一个进口，在第 一个步骤果实细胞通过其进入，培养基和任何其它物质置于生物反应器中。根据进一步的 实施方案，本发明方法中使用的生物反应器包括排出任何希望的物质的出口。根据一些实 施方案，出口包括玻璃出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气 体出口是人工操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦瓶中的气 压（atmosphere)达到预定压力，贝气体从瓶中释出。根据一些实施方案，预定的压力直至 8PSI〇
[0101] 根据一些举例的实施方案，结束果实细胞生长的第一步之后，将果实细胞接种于 小规模生物反应器中，在此也称作第一生物反应器。对于大规模方法的第二步，根据一些 实施方案，小规模生物反应器是4L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是 3-5L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是3-10L反应器。根据进一步的 实施方案，小规模生物反应器是4-8L反应器。
[0102] 小规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型 聚合物。根据一些实施方案，小规模生物反应器是一次性的。如果小规模生物反应器不是 一次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0103]如上所述，已知当较大数量的果实细胞在生物反应器中生长时，次生代谢物包括 多酚如白藜芦醇的产生与在小规模生产如使用玻璃瓶如Erlenmeyers中相同代谢物相比 显著降低。然而，本文详细描述的大规模方法提供果实细胞，当在生物反应器中生长时其中 的次生代谢物的量不降低。进一步地，某些次生代谢物的产生甚至是扩大的。
[0104] 因此，根据本发明的实施方案，在小规模生物反应器中生长的果实细胞的次生代 谢物的相对量与其在第一步中的相对量相比不显著降低。根据一些实施方案，上述用于第 一步中生长培养基中的成分也可用于第二步。根据一些实施方案，小规模生物反应器中使 用的生长培养基与大规模生产方法的第一步中使用的培养基相同。根据一些实施方案，在 第二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与第一步相同。根据其它的实施方案，在第 二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与在第一步中使用的相对量不同。根据一些实 施方案，在第二步将另外的物质加入生长培养基中。
[0105] 根据一些实施方案，小规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第一步）、 空气、培养基及任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，小规模生 物反应器包括一个出口，由此排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体 出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。 根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力， 则气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定压力是8PSI。
[0106] 根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第二步是持续混合的。根据进一步的实 施方案，果实细胞和培养基在第二步是间歇混合的。根据一些实施方案，第二步的温度是 20-30摄氏度。根据一些实施方案，果实细胞在第二步生长多于一周但少于两周。在本发明 的一些实施方案中果实细胞在接种于下一个生物反应器中之前生长9-16天。
[0107] 对于大规模方法的第三步，将收获的果实细胞置于大规模生物反应器中。根据一 些实施方案，大规模生物反应器是30-50L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反 应器是40-60L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反应器是30-70L反应器。根 据进一步的实施方案，大规模生物反应器是20-100L反应器。
[0108] 大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型 聚合物。根据一些实施方案，大的生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不是一 次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0109] 与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在大规模生物反应器中生长 的果实细胞的次生代谢物与其在该方法的任何先前步骤中的相对量相比不显著降低。根据 一些实施方案，上述任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可以用于第三步。根据一 些实施方案，大规模生物反应器中使用的生长培养基与该方法的任何先前步骤中使用的培 养基相同。根据一些实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相对量与该方法任 何先前步骤中的量相同。根据其它的实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相 对量与该方法任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在第三步将另外的 物质加入生长培养基中。
[0110] 根据一些实施方案，大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第二步）、 培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，大规模生 物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体出 口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。根 据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力，则 气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定的压力为直至8PSI。
[0111] 根据一些举例的实施方案，果实细胞和培养基在第三步持续混合。根据进一步 的实施方案，果实细胞和培养基在第三步间歇混合。根据一些实施方案，第三步的温度是 20-30°C。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约2-3周。根据一些实施方案，果 实细胞在第三步生长大约3-5周。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约12-30 天。
[0112] 第三步果实细胞生长结束后，通常通过任何适当方式将果实细胞从中等规模生物 反应器接种。对于大规模生产方法的第四步，将收获的果实细胞置于更大规模生物反应器 中。根据一些实施方案，更大规模生物反应器是1000L反应器。根据进一步的实施方案，更 大规模生物反应器是200-500L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是 500-1000L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是1000-1500L反应器。 根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是500-1100L反应器。
[0113] 更大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类 型聚合物。根据一些实施方案，大规模生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不 是一次性的，根据一些实施方案，在两次使用之间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0114] 与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在更大规模生物反应器中生 长的果实细胞的次生代谢物的量与其在该方法的先前步骤中的相对量相比不显著降低。根 据一些实施方案，上述在任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可用于该方法的第四 步。根据一些实施方案，在更大规模生物反应器中使用的生长培养基与在任何先前步骤中 使用的培养基相同。根据一些实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不同成分的相对 量与先前任何步骤中的量相同。根据其它的实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不 同成分的相对量与在任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在该方法的 第四步将其它物质加入生长培养基中。
[0115] 根据一些实施方案，更大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第三或 第二步）、培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案， 更大规模生物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括 一个气体出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工 操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预 定压力，则气体从生物反应器中释出。
[0116] 根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第四步持续混合。根据进一步的实施方 案，果实细胞和培养基在第四步间歇混合。根据一些实施方案，第四步的温度是20-30°C。 根据一些实施方案，果实细胞在第三步或第四步生长直至达到细胞生物量为10% -70%。
[0117] 根据一些实施方案，在果实细胞在更大规模生物反应器中生长之后终止该大规模 生产方法。根据这种实施方案，果实细胞在更大规模生物反应器中生长直至达到细胞生物 量为10% -70%。细胞生物量达到10% -70 %后，通过任何合适方式从该大规模生物反应 器中收获果实细胞并进一步加工。根据一些实施方案，将果实细胞通过干燥、冻干、冷冻干 燥和