0.0范围内。藻液pH随着细胞光合作用消耗二氧 化碳而逐渐升高，当pH传感器检测到藻液pH达到10.0，pH控制器接通二氧化碳气体通道，二 氧化碳气体经过管道流入安置在池底的微孔管状气体分散器，管状气体分散器的管壁上布 满微孔，微孔的孔径小于100微米，C0 2通过管壁上的微孔形成细小的气泡进入藻液，C02气泡 在藻液中上升的过程中逐渐被藻液吸收，藻液pH随之下降。当藻液pH下降到9.0，pH控制器 切断二氧化碳气体通道，停止通入二氧化碳。通过以上过程的不断循环，藻液的pH被维持 9.0~10.0范围内，同时，向培养液中补C02,为微藻光合作用提供所需的碳源。
[0096] 外源C02利用率的测定:准确称量装有⑶2钢瓶的重量，根据培养前后⑶2钢瓶重量 变化计算出消耗C〇2的质量(Mc〇2，kg);根据微藻生物质干重的增加量(Mbi_ ss，kg)，按照微藻 生物质干重的碳元素含量50% (Grobbelaar J U，2004.Algal nutrition-mineral nutrition. In: Richmond A.(Eds):Handbook of microalgal culture :biotechnology and applied phycology,97-115)，计算油球藻Graesiella spJBG-l对外源CO2的利用率 Rc〇2 ：
[0097]
[0098] 式中Mbiomass代表培养前后生物质的增加量，MCCI2代表培养过程中C〇2的消耗量。
[0099] 生物质干重测定:培养过程中，每天从培养池中取藻液，0.45μπι孔径滤膜过滤法测 定藻液的生物质干重Cbi OTass(g I/1)，同时测量并记录藻液的深度H(m)，根据生物质干重 Cbi_ss、藻液深度Η和培养池面积A(m2)计算生物质总量B(g):
[0100] B = 1000XCbi〇massXAXH
[0101] 刚接种后测定的生物质总量就是培养初始的微藻生物质总量(B1)，培养结束前测 定的生物质总量就是本次培养最终的微藻生物质总量(B2)。
[0102] 生物质采收:培养结束后关闭搅拌机，藻液在培养池中静置12小时，藻细胞自然沉 降到池底，之后通过培养池排水口自然排出上清液，得到浓缩藻浆。与原藻液相比，浓缩藻 浆的生物质浓缩了50倍以上，生物质干重达到70g Γ1以上，体积缩小为原来的1/50以下;浓 缩藻浆再经过离心机脱水，藻泥的生物质干重达到25%以上，最高达到35% (图4)。藻泥生 物质干重越大，含水量就越小，越有利于微藻生物柴油加工过程中微藻油脂的提取。
[0103] 生物质产率、油脂含量和产率分析计算：
[0104]根据培养初始的微藻生物质总量Bl(g I/1)，培养最终的微藻生物质总量B2(g L I，培养池面积A(m2)和培养时间T(d)，计算生物质产率Pbi_ss(g n^cf1):
[0105] Pbi〇mass=(B2-Bl)/(AXT)
[0106] 采用正己烷/乙酸乙酯法(温小斌等.2012,中国油脂37(11) :80-85)测定干藻粉的 总脂含量：（1)称量干燥藻粉约50mg左右（重量计为m)，加入约10mg石英砂研磨破壁后转移 入5mL带盖离心管；（2)加入4mL乙酸乙酯/正己烷的混合溶剂（1/1，V/V)，超声波15min，50°C 提取30分钟，期间多次振荡混匀，10000r/min离心5分钟，收集上清液至50ml离心管中，重复 提取一到两次，合并上清；（3)向上述获得的含有油脂的有机溶剂中加入等体积的纯水，振 荡混匀后2000r/min离心1分钟加速分层，收集上层有机相至已烘干并准确称量净重的玻璃 试管中（试管净重计为W1); (4)氮气吹干溶剂，80°C干燥lh，准确称量玻璃试管重量，计为 W2; (5)计算藻细胞的总脂含量Clipid (%干重）：
[0107]
[0108] 式中m代表所称取的干燥藻粉的重量，W1是玻璃试管的重量、W2是玻璃试管和总脂 提取物的总重量。
[0109] 根据生物质产率Pbi_ss和对应的总脂含量Clipid计算总脂产率Pii Pid(g πΓ2:1):
[0110] Plipid = Pbiomass X Clipid
[0111] 申请人利用200m2培养池进行了三次油球藻Graesiella sp.WBG-l的培养，培养过 程中日平均光照强度在31~45mol n^cf1范围内变化，日平均水温在23~29°C范围内变化。 生物质产率、总脂含量、总脂产率和C〇2利用率见表3。
[0112] 表3 200m2开放式培养池培养油球藻Graesiella sp.WBG-l
[0113]
[0114] 利用硅胶薄层层析法(常规分析方法)对抽提到的总脂肪进行定量分析(见图2)， 其中中性脂(TAGs)在总脂中的比例达到88.89 % (三次平均值）。利用甲醇(含0.5 %NaOH)对 上述总脂提取物进行酯化并进行脂肪酸组成的气相色谱分析(常规分析方法，见图3)，其中 C16、C18等适合于炼制生物柴油的脂肪酸占总脂肪酸的75%以上(三次平均值），各种脂肪 酸组成见表4。
[0115] 表4油球藻Graesiella sp.WBG-l脂肪酸组成及相对含量
[0116]
[0117] 200m2开放池培养油球藻Graesiella sp.WBG-1，生物质产率平均7.36g m-2d-、总 脂含量平均31.55%，总脂产率平均2.32g πιΛΓ1。藻油中性脂(合成生物柴油的主要原料） 约占总脂的88.89%，其中C16和C18是主要的脂肪酸，占脂肪酸总量的76.07%，而柴油的主 要成分就是C16和C18烷烃。由此可见，采用本发明技术规模培养产油微藻，可以获得大量的 微藻油脂，而且生产的油脂非常适合作为生物柴油的原料。本发明以外源C0 2为碳源培养产 油微藻，C02利用率达到65%以上，在利用烟道气C02为碳源培养产油微藻方面具有应用潜 力。
【主权项】
1. 一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法，其步骤是： A、 藻种的扩大培养： 以油球藻Graesiella sp . WBG-1为藻种，培养藻种从2000mL三角瓶开始，依次经过 2000mL三角瓶、室外50L培养箱、室外5m2培养池、室外20m2培养池逐级扩大培养，得到油球藻 Graesiella sp.WBG-Ι藻种液，在室外光温条件下逐级扩大培养的过程中，藻细胞逐步适应 了自然光照与温度的变化，实验期间光照强度变化范围〇~2600μπι 〇 1 nf2 ?Γ1、藻液温度变化 范围20~35°C; B、 反应器准备与配制培养基： 室内2000mL三角烧瓶和培养用水经过湿热灭菌121°C、20min，冷却到室温后，加入培养 基母液，配制成培养基； 所用培养基成分，除碳酸氢钠直接称量干粉配制培养基外，先配制成浓缩母液并煮沸 消毒，再按所需数量添加到反应器中，得到所需培养基，培养基体积为200m2开放池，硝酸 盐、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙按照终浓度称量干粉加入，硝酸盐可以是硝酸钠、硝酸钾、 硝酸镁、硝酸钙，不同硝酸盐分子量不同，培养基组成中硝酸盐的浓度统一以硝酸根的浓度 计量;培养基组成及配制方法C、 接种与培养： 按照藻种扩大培养所述，逐级扩大培养，反应器提前清洗、消毒并配制好培养基，前一 级培养为后一级培养提供藻种，接种时加入藻种液的体积不小于培养基体积的1/10,室外 培养箱以过滤除菌的压缩空气进行搅拌;开放式培养池以调速电机带动叶轮搅拌器进行搅 拌，藻液深度控制在10~30cm范围内，培养过程中每天取样，监测藻液OD、生物质干重，在显 微镜下观察细胞形态； 对于藻种扩大培养，依据自然光照的强弱和温度的高低，培养时间4~6天； 对于产油微藻的规模培养，从接种到完成油脂的积累，整个培养周期12~18天； D、 培养过程中藻液pH控制和C02供给： 利用在线pH控制器一传感器系统将藻液pH控制在一定范围内，藻液pH随着细胞光合作 用消耗二氧化碳逐渐升高，当pH传感器检测的藻液pH达到设定范围的上限时，pH控制器接 通二氧化碳气体通道，二氧化碳气体经过管道流入安置在池底的微孔气体分散器形成细小 的气泡进入藻液，C0 2气泡在藻液中上升的过程中逐渐被藻液吸收，藻液pH随之下降；当藻 液pH下降到设定值的下限时，pH控制器切断二氧化碳气体通道，停止通入二氧化碳;通过以 上过程的不断循环，藻液的pH控制在一定的范围内，向培养液中补充碳源，供微藻光合作用 使用，所述的pH范围为9.0~10.0之间的任意值； E、 微藻的米收： 200m2培养池培养结束时停止搅拌，藻液静置6小时后细胞沉降到池底;上清液从排水口 自然排出，获得浓缩50倍的浓藻浆，再经过离心机脱水，采收生物质。2. 根据权利要求1所述的一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法，其特征在于:所 述的2000mL三角瓶培养藻种时，光照强度设置为50~100μ mol m-2s-S温度范围25~30°C， 再逐级扩大培养。3. 根据权利要求1所述的一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法，其特征在于:所 述的油球藻Graesiella sp.WBG-1藻种液制备时，培养基中硝酸盐的浓度为0.073~0.219g I/1;进行油球藻Graesiella sp.WBG-1200m2开放式培养池培养时，培养基中硝酸盐浓度为 O.OST-O.HegL-1。
【专利摘要】本发明公开了一种开放式培养池规模培养产油微藻的方法。以产油微藻油球藻<i>Graesiella</i>？sp.？WBG-1为藻种，经过逐级扩大培养，接种到200m2开放式培养池，在自然光温条件下进行规模培养，利用pH在线控制系统控制外源CO2通入藻液，将藻液pH维持在9.0~10.0的范围内，培养结束后，使藻液静置，藻细胞自然沉降到池底，排出上清液，得到浓缩了50倍以上的浓藻浆，再经过离心脱水，藻泥的生物质干重达到25%以上；总脂含量平均达到生物质干重的31.55%，总脂产率平均2.32？g？m-2？d-1，中性脂占总脂的88.89%，对外源CO2的利用率平均达到65.77%。CCTCC NO：M201548620150814
【IPC分类】C12N1/12, C12R1/89, C12N1/02
【公开号】CN105624043
【申请号】CN201610108221
【发明人】李夜光, 温小斌, 耿亚洪, 王中杰, 丁奕, 杜奎, 彭新安, 陶焕平, 许岩
【申请人】中国科学院武汉植物园, 中国石油化工股份有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月26日