ystem, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。 使用 Fast Start Universal Probe Master Mix (Roche, Germany)逆转录。"TagMan 探针法 qRT-PCR 检测 miR-122、 1111尺-140-化、11111?-144、11111?-720、11111?-1225-化和11111?-1228 表达，43337 10分别为；002245、 002234、197375、002895、002766 和 002919 (Applied Biosystems)。应用 SYBR Green qRT-PCR 方法，Fast SYBR Green Select Master Mix(Applied Biosystems, USA)检测 miR-2861和miR-3149表达水平，引物委巧南京聽梁生物工程有限公司（Nanjing BioSteed BioTechnologies Co.，Ltd)合成。引物序列如下：
[0038] miR-2861 ：
[0039] 反转录引物；5, -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCC
[0040] CAC-3,；（沈Q ID No. 1)
[0041] 正向引物；5, -ACACTCCAGCTGGGGGGGCCTGGCGGT-3,；（沈Q ID No. 2)
[0042] 反向引物；5, -TGGTGTCGTGGAGTCG-3'（SEQ ID No. 3)。
[0043] miR-3149 ：
[0044] 反转录引物；5, -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATACA
[0045] CAC-3,；（沈Q ID No. 4)
[0046] 正向引物；5, -ACACTCCAGCTGGGTTTGTATGGATATGTGT-3,（SEQ ID No. 5);
[0047] 反向引物；5, -TGGTGTCGTGGAGTCG-3'（SEQ ID No. 6)。
[0048] 应用 cDNA synthesis kit (Roche, Germany)，W 20ng总 RNA逆转录成 cDNA,反应条 件为16°C 30分钟、42°C 30分钟、85°C 5分钟灭活逆转录酶。qRT-PCR分析采用20 y L反应 体系，H次重复实验矫正实验变异。qRT-PCR反应程序为5(TC 2分钟，95°C 10分钟，95°C 15 砂，6(TC 60砂，45个循环。比较Ct法计算miRNA相对表达量。Ct值>45的结果按照45计 算。按照拷贝数=2 (-Ct)将Ct值转化成拷贝数，并W miR-1228矫正。qRT-PCR获得数据 经对数转换，统计分析时应用散点图排除离群值。血浆也肌巧蛋白I(c化I)检测
[0049] 血浆cTnl浓度按产品手册（Abnova，化iwan，化ina)应用ELISA方法检测。
[0050] 动物实验方案
[0051] 36只雄性己马小型猪（10月龄体重25到3化g)经高胆固醇饮食（3%胆固醇、15% 猪油、6. 0%花生油、5%白糖、0. 5%胆汁酸盐和0. 025 y g/kg体重/天尼古下）饲喂20周， 不限制体力活动。然后，将猪随机分为两组：（1)急性也肌梗死组（AMI，n = 30);实验动物 结扎冠状动脉左前降支（LAD) 4小时；该组进一步分为急性也肌梗死后无室颤组（AMI-NVF) 和急性也肌梗死合并室颤组（AMI-VF) ;(2)假手术组（n = 6):冠状动脉左前降支仅W缝 合线环绕，并不结扎。所有动物行肌肉注射7〇〇mg盐酸氯胺丽和30mg安定麻醉，并每小时 2mg/kg体重持续静脉滴注维持麻醉。每只动物都用呼吸机（SV900 ;Siemens-Elema，Solna, Sweden)辅助呼吸。用直肠式温度计监控体温，并用热垫保持动物体温在37-38C。如果也 室颤动持续超过10砂钟，采用2焦耳体内除颤。手术前及缺血30、60、90、120、180和240 分钟时采集血样用W检测miRNA。
[0052] 所有实验动物均按照《实验动物护理和使用指南》（美国国家卫生研究所出版）受 到人道主义关怀。动物实验方案经由中国医学科学院阜外也血管病医院实验动物管理委员 会批准。
[00閲统计分析
[0054] 应用单因素方差化e way AN0VA分析和Fisher精确检验，比较不同组患者基线 特征。miRNA芯片数据分析时，用Mann-Whitney非配对检验进行健康组和急性也肌梗死 组、高危组和急性也肌梗死组、W及稳定性也绞痛和急性也肌梗死组该H对两两比较。分析 qRT-PCR数据时，使用比较Ct法计算miRNA相对表达。miRNA表达值W平均数+标准误表 示。应用单因素方差分析进行H组间参数比较，应用Bonferroni进行检验后两两比较。两 组间采用独立样本t检验。应用双侧检验，P<0. 05为统计显著性标准。建立受试者工作特 征曲线（R0C) W区别急性冠脉综合征患者和胸痛患者。使用SPSS 20.0进行统计分析。
[00巧]实施例1、miRNA芯片分析验证本发明的标志物在健康组和高危人组间的表达差 异
[0056] 本实施例中，收集急性冠脉综合征病例及健康对照共32人，分为健康组、高危组、 不稳定性也绞痛组和急性也肌梗死组（每组8例），各组间临床特征无显著差异（见表1)。
[0057] 表1. miRNA芯片分析各组样本临床特征
[0058]
【主权项】
1. 循环miRNAs作为急性冠脉综合征的早期诊断的标志物的应用，其中，所述循环 miRNAs 包括 miR-3149 和 / 或 miR-122。
2. 根据权利要求1所述的应用，其中，所述循环miRNAs还包括miR-2861。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述循环miRNAs还包括miR-140-3p和/或 miR-720。
4. 检测循环miRNAs的表达水平的试剂在制备用于急性冠脉综合征的早期诊断的组 合物中的应用，其中，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂包括检测miR-3149和/或 miR-122的表达水平的试剂。
5. 根据权利要求4所述的应用，其中，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂还包括 检测miR-2861的表达水平的试剂。
6. 根据权利要求4或5所述的应用，其中，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂还 包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
7. 根据权利要求4所述的应用，其中，检测循环miRNAs的表达水平的试剂包括：采用 Nothern blot方法检测循环miRNAs的表达水平的试剂，采用qPCR或qPCR Array技术检测 循环miRNAs的表达水平的试剂，采用miRNA芯片技术检测循环miRNAs的表达水平的试剂， 或者采用高通量测序法检测循环miRNAs的表达水平的试剂。
8. 根据权利要求1~7任一项所述的应用，其中，当临床症状和心电图改变不典型的待 测个体样品中血浆循环miRNAs的表达水平显著升高时，则个体罹患急性冠脉综合征的危 险性增大； 优选地，当miR-122和miR-3149的水平同时升高，更优选当miR-122、miR-2861和 miR-3149的水平同时升高，则个体罹患急性冠脉综合征的危险性增大。
9. 一种用于急性冠脉综合征的早期诊断的组合物，该组合物包括检测miR-3149和/或 miR-122的表达水平的试剂，进一步优选还包括检测miR-2861的表达水平的试剂，更进一 步优选还包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
10. -种用于急性冠脉综合征的早期诊断的试剂盒，该试剂盒包括检测miR-3149和/ 或miR-122的表达水平的试剂，进一步优选还包括检测miR-2861的表达水平的试剂，更进 一步优选还包括检测miR-140-3p和/或miR-720的表达水平的试剂。
【专利摘要】本发明提供了用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs(即microRNAs)及其应用。所述循环miRNAs包括miR-3149和/或miR-122，进一步包括miR-2861，更进一步包括miR-140-3p和/或miR-720，这些循环miRNAs可作为标志物用于急性冠脉综合征的早期诊断。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104630339
【申请号】CN201410557018
【发明人】顾东风, 李向东, 王来元, 杨跃进, 黄建凤, 李宏帆
【申请人】中国医学科学院阜外心血管病医院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年10月20日