—种用于稻曲病菌定量检测的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种定量检测稻曲病菌抱子数量的技 术。
【背景技术】
[0002] 稻曲病（Ustilaginoidea virens(cooke)I'ak)是世界性真菌病害。近年来随着杂 交梗稻等感病品种的推广与±壤服力水平的提高，致使稻曲病的发生面积及发病程度都 有所上升，在某些地区甚至造成严重的经济损失。水稻稻曲病的发生流行与田间菌源量密 切相关。对田间稻曲病菌菌源的定量检测，有利于掲示稻曲病流行规律并且指导病害防治。 传统上，分离培养和显微镜镜检也已经用于田间稻曲病菌抱子数量的检测；但是农田环境 中微生物种类繁多，稻曲病抱子小、没有特异的形态特征且萌发后生长速度缓慢，应用该些 传统方法定量检测稻曲病菌不仅费时费力，而且也不能准确的识别定量该个病原物。
[0003] 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR)及其相关技术的发明，W其 快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的定性和定量分析，其中尤W实时英光PCR 是通过实时监控PCR体系中的英光信号，对样本中初始模板进行定量分析的一项新技术， 已被广泛应用于植物病害物的定量和流行风险预测的研究工作及生产实践。PCR检测中最 为关键的是选取合适的祀位点设计高特异性的引物，针对检测对象和检测要求的不同，所 采用的特异性祀位点也不同。目前报道有应用的祀位点主要有口S(Internal Transcribed Spacer)、IGS (Inter-genic spacer)、rDNA、mtDNA (mitochon化ial DM)、W及某些蛋白 基因如 Elongation Factorl a Subunit、P-tubulin、Actin、Cytochrome oxidase、MAT、 GAPDH和AL畑s等)。其中由于ITS区域进化速率较编码区快，在种内不同菌株间高度保守， 而在真菌的种间存在着丰富的变化，其在真菌的系统发育、分类鉴定和分子检测等方面运 用最为广泛。通过不同真菌间ITS序列的比对，可W设计特异性引物对用于其定性和定量 的研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种稻曲病菌定量检测试剂盒，可W快速准确地定量检测 稻曲病菌，特异性好、灵敏性高，对稻曲病流行监测预报和种子带菌检测等方面的应用。
[0005] 本发明的目的通过W下技术方案实现：
[0006] 一种稻曲病菌定量检测试剂盒包括：上游引物UVP292、下游引物UVP397、英 光探针 UvP333、10x PCR 缓冲液、2mmol/L dNTPs、25mmol/L Mg"、化姐臟聚合酶，其 中上游引物 UvP292 :为，5 ' -GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAA-3 '，下游引物 UvP397 为： 5' -GCCGGAGGATACAACCAAAA-3,。
[0007] 在一些优选的方式中，英光探针UvP333的序列为；5' FAM-TTTGCAAAAATCCACTCAG ACATGCATTG-TAMRA3'，FAM 和 TAMRA 为英光发射基团。
[0008] 在另一些优选的方式中，本发明稻曲病菌定量检测体系PCR反应体系总体积为 20 y L，其中 lOx PCR 缓冲液 2 y L，10 y mol/L UvP292、UvP397 和 UvP333 各 0. 4 y L，2mmol/ L dNTPsO. 8 y L，25mmol/L Mg2+1. 6 y L，抓/ y L Taq DM聚合酶 0. 4 y L，阳性对照(稻曲病菌 基因组溶液）10倍梯度稀释或待检测样品DM溶液2 y L。PCR采用两步法，扩增反应程序 为先95°C Imin，然后95°C 15s、60°C 34s为1循环，共40个循环。
[0009] 优选的，本发明的样本为来自稻田周围空气中的稻曲病菌抱子溶液。
[0010] 在本发明利用ct值与阳性模板(梯度稀释基因组或来自于梯度稀释稻曲病菌抱 子溶液的基因组)制成标准曲线，再根据待测样品的ct值，可准确算出该样品的基因组或抱 子起始浓度。本发明提供的稻曲病菌定量检测试剂盒，对稻曲病菌基因组DNA模板量最低 检测限度在24fg，对稻曲病菌抱子数量最低检测限度在0. 67个细胞。
【附图说明】
[0011] 图1为定量PCR检测稻曲病菌分生抱子数量的：动力学曲线；
[0012] 图2为定量PCR检测稻曲病菌分生抱子数量的LoglO值与Ct值的线性关系图
[0013] 图3为稻曲病菌的英光定量PCR特异性扩增结果图，其中M ;Dk600Marker ;1 ;稻 曲病菌；2 ;稻曲病菌；3 ;稻曲病菌；4 ;稻癌病菌；5 ;稻癌病菌；6 ;稻癌病菌；7 ;纹枯病菌； 8 ;纹枯病菌；9 ;纹枯病菌；10 ;青霉；11 ;黄曲霉；12 ;链格抱菌；13 ;裂權菌；14 ;米根霉； 15 ;黑曲霉；16 ;枝状枝抱困；17 ;阴性对照。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明建立稻曲病菌的英光定量PCR检测方法，能对该病原菌在环境中，特别是 空气中的数量进行监测，为稻曲病发生的预测预报和防治指导提供一种新技术。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 ;稻曲病菌的抱子定量检测
[0017] 抱子息浮液基因组的提取；用TE溶液对稻曲病菌分生抱子液进行稀释，获得 4. 2X 107、4. 2X 106、4. 2X 105、4. 2X 104、4. 2X 103、4. 2X 102、4. 2X 10 个 /血抱子溶液。各 取400 y L抱子息浮液提取基因组DM,最终获得各50 y L的DNA样品溶液。分别取2 y L作 为模板进行实时PCR定量检测。
[001引稻曲病菌抱子DNA提取；在每份样品加入0. 4g的酸洗珠，置化st-pr巧仪器中， W 6m/s的转速，处理样品40s，重复H次。加入400 y L DNA提取缓冲液（lOmM Tris ?肥L， PH7.5 ;0.1 mM邸TA，6%SDS，2%目-琉基己醇)，混匀，置65°C水浴1小时。加入800yL的 氯仿苯酷（1:1)，混匀，12000g离也lOmin，转移上清至新的离也管中。加入ly L的糖原 (20 y g/ y L)，40 y L6M 的醋酸馈，600 y L 异丙醇，混匀，置-20°C 中 10-60min。12000g 离也 lOmin，去除上清。加入50y L含RNA酶（lOmg/ml)的TE缓冲液，混匀，37°C温育15min。加 入150y L的TE缓冲液，200y L苯酷，混匀，12000g离也lOmin，转移上清至新的离也管中。 加入lOy L6M的醋酸馈，600y L的异丙醇，混匀，置-20°C中lOmin。12000g离也lOmin，去 除上清。加入预冷的70%己醇洗涂沉淀，室温干燥DM,加入50 y L TE缓冲液溶解DM。
[0019] 定量PCR反应体系总体积为20y L，其中lOx PCR缓冲液2y L，10ymol/L UvP292、 UvP397 和 UvP333 各 0. 4 y L，2mmol/L dNTPsO. 8 y L，25mmol/L Mg2+1. 6 y L，5U/ y L 化姐臟 聚合酶0. 4 y L，待测样品DNA溶液2 y L。PCR采用两步法，扩增反应程序为先95°C Imin，然 后95°C 15s、60°C 34s为1循环，共40个循环。
[0020] 循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果。7个稻曲病菌抱子梯度相 应 DNA 样品 Ct 值分别为，14. 25、17. 39、20. 83、24. 09、27. 48、30. 28 和 33. 18,其与抱子数量 的LoglO值呈现良好的线性关系，相关性R2=0. 9989,理论上至少可检出0. 67个抱子。
[0021] 实施例2 ;对空气传播抱子捕捉样品的定量检测
[0022] 对浙江省宁海县稻作区2012年8月21日至9月10日，抱子捕捉样本中的稻曲病 菌抱子数量进行定量检测。Burkard公司的7天抱子捕捉仪进行抱子捕捉，将聚脂胶片按天 分成小块，装入加有400 y L的TE的离也管。
[0023] DNA的提取：在每份样品加入0. 4g的酸洗珠，置化st-pr巧仪器中，W 6m/s的转 速，处理样品40s，重复H次。加入400y L DNA提取缓冲液（lOmM Tris ?肥L，PH7. 5 ;0.1 mM 邸TA，6%SDS，2%目-琉基己醇)，混匀，置65°C水浴1小时。加入800 y L的氯仿苯酷（1:1 )，混 匀，12000g离也lOmin，转移上清至新的离也管中。加入1 y L的糖原（20 y g/ y L)，40 y L6M 的醋酸馈，600yL异丙醇，混匀，置-20°C中10-60min。12000g离也lOmin，去除上清。加 入50 y L含RNA酶（lOmg/ml)的TE缓冲液，混匀，37°C温育15min。加入150 y L的TE缓冲 液，200 y L苯酷，混匀，12000g离也lOmin，转移上清至新的离也管中。加入10 y L6M的醋酸 馈，600UL的异丙醇，混匀，置-20°C中lOmin。12000g离也lOmin，去除上清。加入预冷的 70%己醇洗涂沉淀，室温干燥DNA，加入50 y L TE缓冲液溶解DNA。
[0024] 定量PCR反应体系总体积为20 y L，其中lOx PCR缓冲液2 y L，10 y mol/L UvP292、 UvP397 和 UvP333 各 0. 4 y L，2mmol/L dNTPsO. 8 y L，25mmol/L Mg2+1. 6 y L，5U/ y L 化姐臟 聚合酶0. 4 y L，待测样品DNA溶液2 y L。PCR采用两步法，扩增反应程序为先95°C Imin，然 后95°C 15s、60°C 34s为1循环，共40个循环。
[0025] 循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果。根据实例1中抱子量与Ct 值的线性关系换算抱子数量。抱子数量的计算方法为；y=-〇. 3135X+10. 332 (X为ct值），抱 子数(个）=10^X25。
[0026] 定量PCR Ct值与样品中稻曲病菌抱子数
[0027]
【主权项】
1. 一种稻曲病菌定量检测试剂盒包括：上游引物UvP292、下游引物UvP397、荧光探 针 UvP333、10 X PCR 缓冲液、2 mmol/L dNTPs、25mmol/L Mg2+、TaqDNA 聚合酶，其中上 游引物 UvP292 的序列为：5 ' - GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAA-3 '，下游引物 UvP397 为： 5， -GCCGGAGGATACAACCAAAA-3,。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒,其中，该试剂盒还包括荧光探针UvP333,该探针的序 列为：5，FAM- ITTGCAAAAATCCACTCAGACATGCATTG-TAMRA 3'，FAM 和 TAMRA 为荧光发射基 团。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒,其中，稻曲病菌为来自稻田周围空气中的稻曲病菌 孢子。
【专利摘要】本发明提供一种稻曲病菌定量检测试剂盒包括：上游引物UvP292、下游引物UvP397、荧光探针UvP333、10xPCR缓冲液、2mmol/LdNTPs、25mmol/LMg2+、TaqDNA聚合酶，其中上游引物UvP292的序列为：5′-GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAA-3′，下游引物UvP397为：5′-GCCGGAGGATACAACCAAAA-3′。通过本发明的试剂盒可以高灵敏度地检测稻田周围的稻曲病菌孢子，特别稻田周围空气中的孢子，为该病的流行病学的研究提供很好的帮助。
【IPC分类】C12Q1-68, C12R1-645, C12Q1-04
【公开号】CN104630330
【申请号】CN201310559671
【发明人】张震, 柴荣耀, 王教瑜, 王艳丽, 姜华, 邱还萍, 毛雪芹, 杜新法, 孙国昌
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月12日