断肠草鉴别的引物及pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种能 够特异鉴定断肠草的PCR扩增方法及其特异引物。
【背景技术】
[0002] 断肠草为马前科植物钩吻Gelsemium elegans (Gar化.el Qiamp) Benth.的茎藤。 又名胡蔓藤、野葛、水莽草、大茶叶、烂肠草，是一种剧毒草药。有巧风攻毒、消肿、止痛之功 效。可治湿疹、痛肿、风湿瘍痛等。
[0003] 近年来由于误服断肠草而中毒的事故在各地不断发生，对其也进行了许多研究， 证实断肠草的根、茎、叶子的主要成分为钩吻素子、钩吻素寅、钩吻素卯等。调查发现误将断 肠草为金银花煮水当凉茶喝而中毒的事件时有发生，在断肠草中毒的78例临床事件中，发 现43例为因误将断肠草为金银花煮水当凉茶喝而中毒，18例为将断肠草根为其他草药煮 水喝而中毒（李文升.急性断肠草中毒78例临床分析，医学信息，2011,24巧）；5872)。因 此，建立一种用于鉴别钩吻和金银花的方法非常重要。
[0004] 黄伟雄等采用色谱的方法通过分析钩吻碱成分对断肠草中进行鉴定（黄伟雄， 李化生，范山湖，等.应用TLC法鉴定断肠草中钩吻碱，华南预防医学，2008,34(1) ;60)， 但该种方法比较繁琐，不利于推广。近年来发展的W分子生物学为基础的检测方法如DNA barcoding和位点特异性PCR等克服了药材传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点。对 断肠草与金银花之间的分子鉴别还尚未见报道，本发明通过特异性PCR的方法实现了断肠 草与金银花的快速、准确鉴别。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请 中所提及的PCR方法及引物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种断肠草的PCR引物及其鉴定方法，该PCR鉴定方法操作 简单、样品量少，能快速、准确的将断肠草从其易混淆的金银花样品中鉴定出来，为断肠草 鉴定提供了一种实用的技术。
[0006] 1、一种鉴定断肠草的特异引物F1、巧，其序列为：
[0007] F1 ; 5，-TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3，，
[0008] F2 ; 5，-GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3，。
[0009] 2、一种断肠草的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
[0010] a)从所述材料中提取到DNA样品；
[0011] b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，扩增反应体系包括；10 Xbuffer缓冲 液 2 y L，dNTPl. 6 y L，引物各 0. 5 y L，EX Tap 酶 0. 2 y L，DNA0. 5 y L，灭菌蒸觸水 14. 7 y L。 反应条件：解链温度95°C，时间5min，退火温度57°C，时间30s，复性温度72°C，时间为 lmin40s，35个循环后72°C延伸，时间为7min ;
[0012] C)电泳所述扩增产物，如果存在分子量约为3(K)bp的单一条带，则确定所检材料 为断肠草。
【附图说明】
[001引图1 ;断肠草、金银花、山银花及水银花PCR鉴别结果
[0014] 1.断肠草（广西）；2.断肠草（贵州、安徽药市）；3.空白对照；4.金银花（河 南）点金银花（广西）；6.金银花（江苏）；7.金银花（北京）；8.山银花（广西）；9.山 银花（云南）；1〇.山银花（贵州）；11.水银花（贵州）；M.DNA分子量标准；从上至下依次 为 2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp、lOObp
【具体实施方式】
[00巧]1材料
[0016] 所用材料如表1所示，包括：
[0017] 表1样品来源表
[0018]
【主权项】
1. 一种鉴定断肠草的特异引物F1、F2,其序列为：Fl :5'-TCTCCGCCCTCTGCTCTA-3'，F2 : 5'-GGAAGAAAGGAGTTTTTATGAGG-3'。
2. -种断肠草的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤： a) 从所述材料中提取到DNA样品； b) 用权利要求1所述的引物进行PCR反应，扩增反应体系包括：10Xbuffer缓冲液 2μ L，dNTPl. 6μ L，引物各 0· 5μ L，EX Tap 酶 0· 2μ L，DNAO. 5μ L，灭菌蒸馏水 14. 7μ L ;反应 条件：解链温度95°C，时间5min，退火温度57°C，时间30s，复性温度72°C，时间为lmin40s， 35个循环后72°C延伸，时间为7min ; c) 电泳所述扩增产物，如果存在分子量约为300bp的单一条带，则确定所检材料为断 肠草。
【专利摘要】本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种能够特异鉴定断肠草的PCR扩增方法及其特异引物。使用此方法鉴别断肠草与金银花，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。主要用于断肠草与金银花之间的快速鉴定。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104630326
【申请号】CN201310548155
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 李旻辉, 崔占虎, 蒋超
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月8日