一种红花籽抗氧化肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗氧化肤的制备方法，具体为一种红花巧抗氧化肤的制备方法。 特指W红花巧稍为原料，利用酶解技术制备抗氧化多肤的制备方法，属于红花巧的综合开 发利用。
【背景技术】
[0002] 随着现代社会的发展，生存环境的恶化W及社会压力的加大使现代人的健康受 到严重的威胁，自由基引起机体损伤变性，导致机体各种疾病产生，已经引起人们强烈的 重视。抗氧化肤能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和 功能，防止脂质过氧化的发生，而氧化与人类及其他动物的许多疾病诸如癌症、老化、动脉 硬化等的发病机理有关。因此低价、高效、低毒的天然食品抗氧化剂的开发成为研究热点。 在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面有广阔的应用前景。因而筛选具有强抗 氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。我国是地大物博的国 家，特别是农产品资源。因此开发利用各种农产品生产高效的抗氧化剂具有十分重要的意 义。
[000引红花巧稍是红花巧制油时的副产物，其中含有29%--70%的优质蛋白质。但目前红 花巧稍一般仅用作饲料，没有对其中的蛋白质作深加工利用，附加值低。
[0004] 据文献报道，许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如半脫氨酸、组氨酸、色氨 酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、额氨酸、5-轻色氨酸等。现已发现一些含组氨酸、色氨 酸和酪氨酸等功能短肤具有明显的抗氧化作用。此外，对于抗氧化肤，疏水性氨基酸，特别 是芳香族氨基酸，在很大程度上影响其生物活性。经检测表明，红花巧蛋白的上述氨基酸酸 含量达36%左右，且其疏水值与大豆蛋白相接近，为探索其抗氧化活性提供了一定的理论 依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种原料来源广泛、制造成本低、高附加值、抗氧化活性高 的红花巧抗氧化肤的制备方法，优化蛋白酶的酶解条件，W获得抗氧化活性高的抗氧化肤 粗品。
[0006] 本发明是通过W下技术方案实现的： (1)红花巧蛋白的制备：W红花巧稍为原料，红花巧稍粉碎，过60目筛，先用正己焼按 料液比1:5 (w/v)常温浸提，不断揽拌，脱脂立次，每2小时换一次，瞭干，再用甲醇按料液 比1:5 (w/v)常温浸提，不断揽拌，脱苦H次，每2小时换一次，瞭干。脱脂脱苦的红花巧稍 在45C下，1:14 (w/v)的料液比加水揽拌，然后用1.0 mol/L化0H调节到抑9.0,并保 温1 h,再经3000 r/min下离也10 min。取碱提工艺中的上清液，用Imol/L肥1调抑 值为5. 5,再经5000 r/min下离也lOmin，用去离子水洗涂沉淀H次，用1 mol/L化0H调 pH至7. 0,经冷冻干燥，得到红花巧蛋白。
[0007] (2)酶的筛选：根据酶的酶切位点不同，选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 和风味蛋白酶做预实验。配制一系列3%的红花巧蛋白溶液，按照8000U/g的酶添加量，分 别加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶对原料进行水解，混匀后分别在 每种蛋白酶最适宜的温度和抑值条件下水解化，100°c灭酶lOmin, 3500r/min，离也lOmin, 取上清液测定酶解液的还原能力。选用W水解液的还原力作为评价抗氧化效果的指标，筛 选出较合适的蛋白酶。结果显示，最佳的酶种类为碱性蛋白酶。
[0008] (3)红花巧抗氧化肤的制备：用缓冲溶液配制成质量浓度为1%-7%的红花巧蛋白 溶液，揽拌均匀，调节pH9. 0-11. 0,然后加碱性蛋白酶4000-10000u/g，在35-65C水浴中水 解1-化，水解过程中保持抑恒定，酶解液在沸水浴中加热5-15min灭酶，然后3500r/min离 也15min，取上清液，调节抑为中性，最后经浓缩和冷冻干燥，得到红花巧抗氧化肤。最佳工 艺参数为；水解时间化，水解温度49C，pH值为8. 6,酶添加量7700u/g，底物浓度5. 0%，得 到酶解液的还原力为1. 017,水解度为6. 389%。
[000引（4)还原力的测定；将酶解液稀释1倍，取1. 0血红花抗氧化肤于试管中，依次加 0. 2mol/L磯酸盐缓冲液（P册.6)2. 5血、1%的铁氯化钟溶液2. 5血并充分混合，5(TC水浴保 温20min,迅速冷却，然后加入10%H氯己酸2. 5血，摇匀，300化/min离也lOmin。吸取上 清液2. 5血，加入蒸觸水2. 5血和0. 1%H氯化铁0. 5血，静置lOmin，测定700皿波长处的吸 光值，所有测定值均为H次数据平均值。W 700nm波长处的吸光值反映还原力的大小，吸光 值越大，表明水解液抗氧化性越强。
[0010] (5)水解度的测定：采用pH-stat法进行水解。
[0011] 水解度DH与水解过程中耗碱量成正比，可用耗碱量来表征水解度的大小，记录下 不同时间的耗碱量即可得酶解进程曲线。
[0012] 水解度计算公式为：
【主权项】
1. 一种红花籽抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 原料预处理：以红花籽柏为原料，红花籽柏粉碎，过60目筛，先用正己烷常温浸提， 不断搅拌，脱脂三次，每2小时换一次，晾干，再用甲醇常温浸提，不断搅拌，脱苦三次，每2 小时换一次，晾干。 (2) 红花籽蛋白的制备：脱脂脱苦的红花籽柏在45°C下，1:14的料液比加水搅拌， 然后用LO mol/L NaOH调节到pH 9. 0-11.0,并保温I h，再经3000 r/min下离心10 min。取碱提工艺中的上清液，用lmol/L HCl调pH值为5. 0-6. 0,再经5000 r/min下离 心IOmin,用去离子水洗漆沉淀三次，用I mol/L NaOH调pH至7.0,经冷冻干燥，得到红 花籽蛋白。 (3) 蛋白酶的筛选：根据各种蛋白酶的作用方式和作用位点不同，选取碱性蛋白酶、中 性蛋白酶、木瓜蛋白酶及风味蛋白酶4种酶，配制一系列3%的红花籽蛋白溶液，混匀后分 别在每种蛋白酶最适宜的温度和pH值条件下水解2h, 100°C灭酶IOmin, 3500r/min，离心 lOmin，取上清液测定酶解液的还原能力。选用以水解液的还原力作为评价抗氧化效果的指 标，筛选出较合适的蛋白酶。 (4) 红花籽抗氧化肽的制备：用缓冲溶液配制成质量浓度为1%-7%的红花籽蛋白溶液， 搅拌均匀，调节PH9. 0-11. 0,然后加蛋白酶4000-10000u/g，在35-65°C水浴中水解l_4h，水 解过程中保持pH恒定，酶解液在沸水浴中加热5-15min灭酶，然后3500r/min离心15min， 取上清液，调节pH为中性，最后经浓缩和冷冻干燥，得到红花籽抗氧化肽。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)中，溶剂正己烷和甲醇与红花籽柏 的量均按5:1 (v/w)加入。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2)中，处理后的红花籽柏与溶剂的料 液比为1:14 (w/v)，碱溶时的pH为9. 0-11.0,酸沉时的pH为5. 0-6.0。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)中，每种酶都在其最适的温度和 PH值下进行酶解。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑷中，蛋白浓度为1%_7%，根据所调 节的pH不同，用适当的缓冲溶液，酶添加量为4000-10000u/g，在35-65°C水浴中水解l_4h， 沸水浴中加热5-15min灭酶。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4)中，酶解上清液在旋转蒸发器上进 行浓缩，控制真空度为0. 4-0. 8MPa，温度为80°C，待溶液浓缩为原来体积的1/2 -1/4,再进 行冷冻干燥，干燥温度为_48°C ^ - 52°C冷冻干燥时间为8-15h，至抗氧化肽的含水量不超 过3%为宜。
【专利摘要】本发明涉及一种抗氧化肽的制备方法，具体为一种红花籽抗氧化肽的制备方法。是通过以下制备方法得到的：用缓冲溶液配制成质量浓度为1%-7%的红花籽蛋白溶液，搅拌均匀，调节pH9.0-11.0，然后加碱性蛋白酶4000-10000u/g，在35-65℃水浴中水解1-4h，水解过程中保持pH恒定，酶解液在沸水浴中加热5-15min灭酶，然后3500r/min离心15min，取上清液，调节pH为中性，最后经浓缩和冷冻干燥，得到红花籽抗氧化肽。最佳工艺参数为：水解时间2h，水解温度49℃，pH值为8.6，酶添加量7700u/g，底物浓度5.0%，得到酶解液的还原力为1.017，水解度为6.389%。属于红花籽的综合开发利用，实现了废物利用的目的。
【IPC分类】C12P21-06
【公开号】CN104630317
【申请号】CN201410537080
【发明人】毛晓英, 吴庆智, 孙立
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年10月13日