一种蒲公英籽抗氧化四肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蒲公英籽抗氧化四肽及其制备方法和在食品领域中的应用，属于 食品生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 活性氧自由基是氧的衍生物，因带有不成对轨道电子而极不稳定，它包括羟基自 由基、超氧化物自由基、过氧化氢和单线态氧。人体新陈代谢过程中会产生一些活性氧和其 他自由基产物，这些物质的过量积累会对DNA、蛋白质、脂质和碳水化合物等生物大分子产 生氧化性损伤。许多证据表明，活性氧自由基对于引起许多严重的疾病如癌症、心血管疾 病、糖尿病、风湿性关节炎、老年痴呆起着决定性的作用。活性氧自由基被认为参与了脂质 氧化过程，脂质氧化会产生许多异味分子、有色物质和毒性物质。因此抗氧化剂的补充显得 十分必要。
[0003] 人体内的一切活性物质均以肽的形式存在，几乎所有的细胞都受多肽的调节，如 细胞生长、细胞分化、合成增殖、神经激素递质调节、免疫调节等。但随着年龄的增大或者各 种因素，仅靠人体内自身合成各种肽类来调节生理功能不能满足人体的正常生理需要，因 此，对外源性生物活性肽的研究越来越受到大众的认可。生物活性肽具有多种生理活性，如 抗氧化活性、降血压活性和免疫活性，且具有分子质量小、热稳定、易吸收的特点。与人工的 抗氧化剂相比，抗氧化肽天然安全、无毒副作用，目前已成为国内外的研究热点。活性肽是 蛋白质经酶、酸、碱的水解产物，酶法水解由于高效，对蛋白质营养价值破坏小，无异味而被 广泛采用。
[0004] 蒲公英籽是菊科多年草本生植物蒲公英(Taraxacum mongolicum)成熟干燥的种 子。蒲公英是一味常见的清热解毒类中草药，别名婆婆丁、黄花地丁和奶汁草等，生长地区 主要分布在北半球，在我国大部分地区也均有分布。蒲公英作为药用植物的研究历史已有 数千年，《千金方》、《本草纲目》等中记载蒲公英具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋之功效， 而现代研究表明，蒲公英具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、保肝利胆、抗胃损伤的作用。蒲公 英还可供食用，是营养价值很高的野生蔬菜。蒲公英含有丰富的蛋白质，其蛋白含量为 18.8%，可作为潜在的食用蛋白来源。在我国大部分地区均有栽种蒲公英，因此产量丰富，且 其含有一些具有重要的生物活性的化学成分，具有极高的研究价值和开发前景。目前，国内 外对蒲公英全草的研究较多，而且主要研究蒲公英黄酮、多糖以及萜类化合物，而对蒲公英 籽的蛋白及多肽的研究很少。多肽的分离纯化和功能研究对于植物的综合开发、科学研究 以及食品、药物等领域应用中均具有重要作用。因此，有必要对其进行深入系统研究，对于 蒲公英籽的综合开发和利用提供重要的科学依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种蒲公英籽抗氧化四肽及其制备方法，可以将该抗氧化四 肽应用于食品添加剂的研制与开发。
[0006]本发明的一种抗氧化四肽，其氨基酸序列为Trp-Thr-Leu-Asn。用单字母表示为 WTLN，即由色氨酸-苏氨酸-亮氨酸-天冬酰胺4个氨基酸残基构成。
[0007] 所述抗氧化四肽分离纯化方法，具体步骤包括如下： 1) 抗氧化四肽的制备:蒲公英籽蛋白经碱性蛋白酶，所述酶解条件为酶解时间4.90h、 pH 8.5、酶底比7.80%、底物浓度为2%; 2) 分离纯化:取蒲公英籽酶解物利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为 洗脱液，流速〇. 3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值，并测定各吸收峰对应的洗 脱组分的DPPH自由基清除活力；收集活性高的峰，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进一步 分离;RP-HPLC的洗脱梯度为0~60 min，体积分数为5%~55%V/V乙腈;流速为2.0 mL/min，检 测波长214 nm，收集体积分数为35%V/V乙腈浓度的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗氧化四肽。
[0008] 所述抗氧化四肽具有强活性，对DPPH，超氧阴离子、ABTS自由基和羟基自由基都有 强的清除作用，并对亚油酸过氧化具有抑制作用，表明其在抗氧化活性开发和应用方面有 重要价值。该蒲公英籽天然抗氧化四肽对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基都具有较 强的清除活力，EC 5Q值（自由基清除率达到50%时的多肽浓度)分别为0.81mg/mL，0.032 mg/ mL，l .35mg/mL，同时对超氧阴离子自由基也有一定的清除活力。
【附图说明】
[0009] 图1:蒲公英籽酶解物Sephedex G-25凝胶过滤色谱图。
[0010]图2:凝胶色谱洗脱峰4反相高效液相色谱图。
[0011] 图3:蒲公英籽抗氧化四肽的质谱图。
[0012] 图4:蒲公英籽抗氧化四肽对DPPH自由基清除作用。
[0013] 图5:蒲公英籽抗氧化四肽对ABTS自由基清除作用。
[0014] 图6:蒲公英籽抗氧化四肽的羟基自由基清除作用。
[0015] 图7:蒲公英籽抗氧化四肽对超氧阴离子自由基清除作用。
[0016] 图8:蒲公英籽抗氧化四肽对亚油酸过氧化的抑制作用。
【具体实施方式】
[0017] 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过 程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施实例。
[0018] 实施例1 本发明所述抗氧化四肽的制备方法如下： 蒲公英籽蛋白的提取:蒲公英籽经高速中药粉碎机粉碎，用〇. lmol/L的NaOH溶液浸提， 在40 °C下搅拌140min，10000 rpm离心20min，取其上清液，用lmol/L盐酸调其pH值为4.0， 12000 rpm离心20min，取其沉淀冷冻干燥，得到蒲公英籽蛋白粉。
[0019] 蒲公英籽蛋白的酶解:采用碱性蛋白酶酶解蒲公英籽蛋白，蛋白浓度为2%(w/v)， 酶底比为7.8%，酶解时间4.90h，pH 8.5，温度为45°C，酶解结束后沸水浴灭酶lOmin，然后迅 速冷却至室温，10000 rpm离心20min，收集上清液冷冻干燥备用。
[0020] Sephadex G-25凝胶过滤色谱:按上述方法获得蒲公英籽蛋白酶解物冻干粉，溶解 于去离子水中，12000 rpm离心15 min。取上清液用0.22 μπι孔径微滤膜过滤。Sephadex G- 25凝胶柱（1.6cmX 100 cm)用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速 0.3 mL/min，于214 nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集洗脱峰峰 4，冷冻干燥，-80 °C低温保存备用。
[0021 ]高效液相色谱:去离子水溶解上述峰4冻干粉，采用RP-HPLC进一步分离。液相色谱 系统