的制备及其抗肿瘤作用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种天然产物活性成分的分离纯化及其抗肿瘤作用，具体涉及人参皂 苷内的分离纯化新方法及其对肺癌、胃癌和乳腺癌的作用，属于医药领域。
【背景技术】
[0002] 近几年，全球癌症病例呈迅猛增长态势，是对人类健康和生命构成严重威胁的主 要病种之一。在我国，癌症发病率前二位是肺癌、乳腺癌、胃癌，死亡率前二位是肺癌、肝癌、 胃癌，并且女性癌症发病率上升明显，特别是乳腺癌。所以，积极有效的预防和治疗癌症依 然是亟待解决的医学难题。
[0003] 人参（Panax ginseng C.A.Mey·)系五加科(Araliaceae)人参属（Panax)植物，是 产于我国东北地区的一味名贵药材。人参皂苷是人参的主要活性成分，显示出了一系列生 物活性，如抗肿瘤、抗炎和抗衰老等。人参的根、茎叶、花和果实中均含有人参皂苷，但各个 部位中人参皂苷的种类和含量不同，迄今为止已从人参各部位分离鉴定的单体人参皂苷已 有200余个。人参皂苷Fi是人参皂苷R gl和三七皂苷办的肠内菌代谢产物，在天然药材中含量 较低，目前仅在人参叶及花中分离得到过。人参皂苷主要通过诱导细胞凋亡、抑制血管生 成、干扰或调控细胞周期、抑制炎症因子等途径发挥抗肿瘤作用，不同的单体皂苷作用机制 不同，所以为了达到最大并能直接发挥其作用的目标，有必要从人参中提取出人参皂苷单 体制剂。目前，人参皂苷单体化合物制剂亦是其开发成药物的发展趋势，如人参皂苷Rg 3、 Rh2、C-K等已有上市销售品种。
[0004] 人参地上部分是不可忽视的宝贵资源，其中人参花是人参含荀待放的花，人参花 中的总皂苷含量最高（约5~7%)，部分单体皂苷的含量超过人参根中的十倍(如人参皂苷 Re)。研究发现，人参地上部分皂苷成分的药理活性与人参根总皂苷相似，因此人参地上部 分尤其是人参花具有很好的药物开发利用前景。
[0005] 经查阅专利文献得知，截至目前与人参皂-Fi制备工艺相关的专利公开如下所 述。
[0006] CN 101012473A-平滑青霉或者疣孢漆斑菌及用其制备人参皂苷Fi的方法。该项发 明是一种利用生物转化方法获得人参皂苷Fi的制备工艺。将人参三醇组皂苷或人参皂苷 Rgl，通过与具有水解人参皂苷的菌株平滑青霉或疣孢漆斑菌作用，在自动旋转摇瓶机上震 荡，220-240rpm，27-28°C培养72-96小时，得到转化产物。将转化产物离心浓缩，采用石油 醚、氯仿、正丁醇混合溶剂萃取，正丁醇部分为粗提取物，再经硅胶柱色谱法，用氯仿-甲醇 梯度洗脱薄层色谱跟踪人参皂苷Fi组分，进行纯化，进一步经重结晶，得到高纯度产物。本 发明适用于大规模工业化生产，原料成本低。
[0007] CN 1869055A--种从人参叶中分离纯化人参皂苷单体的方法。本项发明公开了从 人参叶中提取分离人参阜苷Rbi、人参阜苷Rb 2、人参阜苷Rb3、人参阜苷Rc、人参阜苷Rd、人参 皂苷F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Re、人参皂苷R gl、人参皂苷Rg2、人参皂-Fi，尤其是人参皂苷 Fi、人参皂苷F2、三七皂苷Fe的方法。利用大孔吸附树脂将人参叶中的人参皂苷分成主要由 人参皂苷Re和人参皂苷Rgdi成的混合皂苷A和主要由人参皂苷Fi、人参皂苷Rg2、人参皂苷 F2、三七皂苷Fe、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rh和人参皂苷Rb 3组成的 混合皂苷B，接着用重结晶或氧化铝柱层析的方法获得组成更加简单的人参皂苷混合物，最 后通过柱层析的方法获得人参皂苷单体。获得的各种人参皂苷单体可用于制备药物组合 物、保健食品及其他产品。
[0008] CN 1869052A--种从人参叶中提取分离人参皂苷混合物的方法。本项发明公开了 从人参叶中提取分离含有人参皂苷Fi、人参皂苷F 2、三七皂苷Fe的人参皂苷混合物方法。将 人参叶加水煎煮，合并煎煮液，过大孔吸附树脂吸附，用水冲净，85%乙醇洗脱得人参叶总 皂苷。将人参叶总皂苷用水溶解后上氧化铝柱，先用水洗脱，洗脱液过大孔吸附树脂吸附， 乙醇解吸，回收溶剂，得主要含人参皂苷F1、人参皂苷Rg 2、人参皂苷Rgl和人参皂苷Re的人参 皂苷混合物。获得的人参皂苷混合物可用于制备药物组合物、保健食品及人参皂苷单体。
[0009] CN 1869056A--种从人参叶中提取分离人参皂苷混合物的方法。本项发明公开了 从人参叶中提取分离含有人参皂苷Fi、人参皂苷F 2、三七皂苷Fe的人参皂苷混合物方法。将 人参叶加水煎煮，合并煎煮液，过大孔吸附树脂吸附，用水冲净，18%乙醇洗脱至洗脱液检 测不到人参皂苷Re和人参皂苷R gl后改用85%乙醇洗脱至洗脱液检测不到人参皂苷Rd和人 参皂苷Rbi为止。85 %乙醇洗脱液直接回收乙醇，获得含有人参皂苷Rbi、人参皂苷Rb2、人参 皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷卩!、人参皂苷F 2和三七皂苷Fe的人参皂苷混合 物。
[0010] 上述关于人参皂苷Fi*离制备的专利技术除生物转化的方法可以获得单体化合 物以外，其余分离制备的方法均以含有人参皂苷Fi的混合物为主，纯度较低，并且未见有关 于从天然植物中制备纯化人参皂苷h单体的方法报道。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了一种人参皂苷Fi单体的纯化制备方法，适用于工业化生产。本发明 是从人参花甲醇提取物中分离纯化出单体人参皂-Fi。由于单体人参皂苷抗肿瘤作用机制 不同，为了最大并且直接的发挥其作用，有必要从人参中提取出人参皂苷单体进而开发出 制剂。目前，制备单体化合物制剂是人参及其相关制品的一个主要发展趋势。
[0012] 本发明通过下述技术方案实现，人参皂苷h制备方法包括：
[0013] (1)人参花总皂苷的制备
[0014]取新鲜干燥的人参花，粉碎，用甲醇提取，合并滤液，浓缩，得到甲醇提取物。依次 用环己烷、乙酸乙酯萃取，至萃取液颜色明显变浅为止。合并乙酸乙酯萃取物，浓缩，得到含 人参皂苷^的人参花总皂苷。
[0015] (2)样品|父的制备
[0016] 将人参花总皂苷用甲醇溶解，加入总皂苷质量2-4倍的80~100目硅胶，水浴蒸干 至粉末状，成为硅胶柱层析样品胶。
[0017] (3)分离胶的制备
[0018] 取人参花总皂苷质量15-25倍的300~400目硅胶，用氯仿充分溶解，超声20min，搅 拌，除气泡制得硅胶分离胶。
[0019] ⑷洗脱
[0020] 采用硅胶柱层析，将分离胶均匀加至玻璃柱内，再把样品胶缓慢均匀加至分离胶 上层进行硅胶柱层析，分别以氯仿：甲醇:水的体积比为100:10:1，80:10:1，60:10:1，40: 10:1，20:10:1及10:10:1的混合液作为洗脱液，依次进行梯度洗脱，分别收集洗脱流份的同 时，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参皂苷Fi阳性对照品Rf值相同的流份溶液，用旋 转蒸发仪旋干并保存。
[0021] 本发明中所述的人参皂苷h阳性对照品可以由公共的商业途径获得。
[0022] (5)人参皂-Fi的纯化
[0023]将步骤(4)旋干的人参皂-Fi样品，用50%甲醇水溶液溶解后作为样品备用;称取 总皂苷质量30倍的MCI GEL作为分离胶，50 %甲醇溶液装柱;先加入两个柱体积的50 %甲醇 水溶液平衡柱子，再用滴管沿着柱内壁加入备用的样品；依次用50%甲醇，60%甲醇，70% 甲醇混合液进行梯度洗脱，采用薄层色谱法检测，收集、合并与人参皂苷Fi阳性对照品Rf值 相同的流份溶液，用旋转蒸发仪旋干并保存。
[0024]具体的，在上文所述的制备方法中，薄层色谱法检测的步骤包括:利用薄层层析板 Silica gel 602F254 ,以体积比为6:1:0.1的氯仿-甲醇-水混合溶剂作为展开剂，用5%硫 酸-乙醇溶液显色。
[0025]进一步地，在上述技术方案中，步骤(2)所述的超声除气泡的时间为20min。
[0026] 进一步地，在上述技术方案中，旋转蒸发仪的水浴温度为40_50°C。
[0027] 进一步地，在上述技术方案中，总皂苷中含人参皂-Fi单体约10-15%。
[0028] 本发明进一步提供了人参皂-Fi单体在抗肿瘤方面的作用，尤其是对人肺癌、人 胃癌和人乳腺癌细胞的体外抑制作用，强于人参阜苷Rg3。
[0029] 本发明进一步提供了人参皂苷^单体在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0030] 进一步地，在上述技术方案中，所述肿瘤包括人肺肿瘤、人胃肿瘤和人乳腺肿瘤。
[0031] 发明有益效果
[0032] 1、本发明所选用的原料人参花甲醇提取物来源于纯天然植物人参的花，从中分离 一种抗肿瘤作用的有效成分一人参皂苷Fi，其在人参花中的含量达到约1.02%，具备无化 学合成药物、无毒副作用、不会产生药物依赖性的特点，因而安全可靠。
[0033] 2、本发明的工艺易于操作，收率高，纯度高，不引入有毒物质，无毒副作用及药物 依赖性，而且高纯度的人参皂苷h单体，可以更好的，更加广泛的应用于抗肿瘤药物中。
【附图说明】
[0034]图1为人参花甲醇提取物乙酸乙酯萃取部位的高效液相色谱(HPLC)图。
[0035]图2为从人参花中纯化得到的人参皂苷F!单体的高效液相色谱(HPLC)图。
[0036] 图3为人参皂苷核磁共振氢谱(? NMR)图。
[0037] 图4为人参皂苷核磁共振碳谱(13C NMR)图。
[0038]图5为人参皂苷Fi的质谱(MS)图。
[0039]图6为人参皂苷Fi对三种人肿瘤细胞存活率的影响。
【具体实施方式】
[0040]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为商业途径获得;下述实 施例中所用试验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法。
[0041]本发明中，对人参皂苷h样品进行纯度检测以及结构分析，其条件如下：
[0042] 纯度检测，是通过HPLC面积归一法对其进行检测，色谱条件：色谱柱，Zorbax Eclipse XDB C-18(5ym;4.6mm i.d.X250mm);流动相，体积比为60:40的甲醇-水；流速， 1 · OmL/min;检测波长，203nm;进样量，20yL〇
[0043] 结构分析，选用Orbitrap Elite质谱仪(Thermo Scientific,Bremen,Germany)和 Bruker DRX-500型核磁共振仪(TMS作内标，C5D5N作溶剂），对其进行了结构表征，获得了人 参皂苷Fj^JMS和NMR数据。
[0044] 我们利用硅胶柱层析法和MCI GEL柱层析法，从人参花中获得了高纯度的人参皂 -Fi，通过药效学实验对3种人肿瘤细胞的抗癌试验证明具有较强的抗肿瘤活性。该制备方 法得到的人参皂苷h单体纯度高，质量稳定，能用于抗肿瘤药物开发或药物组合物的制备。
[0045] 实施例1
[0046] 本发明的目的在于提供一种从人参花甲醇提取物中制备一种抗肿瘤作用的有效 成分一人参皂苷^的提取纯化方法。具体步骤如下：
[0047] (1)人参花总皂苷的制备
[0048] 取新鲜干燥的人参花4.02kg，