一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖中鱼种鉴定技术领域，具体涉及一种用于翅嘴鑛、斑鑛及其 杂交子一代的分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 翅嘴鑛（Siniperca chuatsi Basilewsky)和斑鑛（Siniperca scherzeri Steindachner)同隶属于妒形目、鑛亚科、鑛属，鑛亚科自然仅分布于东亚（中国、朝鲜、韩 国、日本、越南(红河))和俄罗斯远东地区。翅嘴鑛和斑鑛肉味鲜美、营养丰富、无肌间刺，且 市场价格高，出口需求大，是我国传统的淡水养殖名贵鱼类。翅嘴鑛体型大、生长快，但抗病 力较弱；斑鑛易驯食、抗逆性强，但生长慢、养殖周期长。通过杂交获得翅嘴鑛和斑鑛的杂交 子代，杂交子代表现出较好的养殖性能及生长性能，在杂交子代的基础上继续进行人工选 择、定向交配，培育出生长快、易驯食、抗逆性强的优良品种。翅嘴鑛、斑鑛和杂交子代形态 相似，在育种过程中特别是育苗阶段和亲本选择阶段，传统的形态学鉴别方法很难准确辨 别纯种和杂交种，因此容易造成种质混杂。
[0003] 微卫星又称为简单重复序列，均匀分布于真核生物的基因组中，由2-6个核巧酸 的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因 此微卫星具有等位基因数目多、重复性好、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于物种鉴定和 基因定位等方面的研究。目前在翅嘴鑛、斑鑛及其杂交子一代的鉴别方面，学者们已经开发 了能鉴别翅嘴鑛与斑鑛的微卫星引物序列，但是目前还没有采用微卫星分子鉴定法进行翅 嘴鑛、斑鑛及其杂交子一代鉴定的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是在于提供了一种用于翅嘴鑛、斑鑛及其杂交子一代的分子鉴定方 法，方法易行，弥补了形态学鉴定的不足，解决了水产养殖中杂交鑛(翅嘴鑛和斑鑛的杂交 子一代)鉴定难和种质混杂的问题。操作简便，能快速、准确鉴别翅嘴鑛、斑鑛及其杂交子一 代，在鑛类种质鉴定和保护、遗传育种和养殖生产中有极大的应用价值。
[0005] 为了实现上述的目的，本发明采用W下技术措施：
[0006] -种用于翅嘴鑛、斑鑛及其杂交子一代的分子鉴定方法，包括W下步骤：
[0007] 1)基因组DNA的提取；采集待测鑛鱼(翅嘴鑛、斑鑛及其杂交子一代)样品(采样后 立即保存在无水己醇中，W保证DNA不降解，鑛鱼已死亡)的錯条或者肌肉组织，提取基因组 DNA并测定其纯度和浓度，该步骤中测得DNA的A2w/A2g。比值为1. 80-1. 95 ;
[000引 2)DNA目的片段的扩增；W步骤1)提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合 酶链式反应（PCR)扩增出DNA目的片段，用于PCR的一对微卫星引物序列为：
[0009] 引物正向序列；5，ATGTAACCGTAAGTGACCTC3'，
[0010] 引物反向序列；5' TGTTGTTCAGACGATGACGA3' ；
[0011] 3)PCR产物的电泳及银染色鉴定；对PCR产物用8%的非变性聚丙帰醜胺凝胶进行 电泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果，该步骤中采用8%非变性聚丙帰醜胺凝 胶。
[0012] 4)与标准图谱进行对比；与标准酶切片段比对，读出翅嘴鑛、斑鑛及其杂交子一代 的目的条带所处的位置。样品在靠近标准酶切片段的l〇5bp位置扩增出1条特异性DNA条 带，则鉴定为翅嘴鑛；样品在靠近标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带， 则鉴定为斑鑛；样品在靠近标准酶切片段的l〇5bp位置和120bp位置各扩增出1条特异性 DNA条带，则鉴定为翅嘴鑛和斑鑛的杂交子一代。
[001引所述2)步骤中测得DNA的浓度范围为579. 3-3122.化g/y 1。
[0014] 所述2)步骤中PCR反应体系为：
[0015]
【主权项】
1. 一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，其步骤是： 1) 基因组DNA的提取：采集待测鳜鱼样品的鳍条或者肌肉组织，提取基因组DNA并测 定其纯度和浓度，该步骤中测得DNA的A 26Q/A28Q比值为1. 80-1. 95 ; 2. DNA目的片段的扩增：以步骤1)提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合酶链 式反应（PCR)扩增出DNA目的片段，用于PCR的一对微卫星引物序列为： 引物正向序列：5' ATGTAACCGTAAGTGACCTC3'， 引物反向序列：5' TGTTGTTCAGACGATGACGA3' ； 3. PCR产物的电泳及银染色鉴定：对PCR产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳 分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果； 4) 与标准图谱进行对比：与标准酶切片段比对，读出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的目 的条带所处的位置，样品在标准酶切片段的105bp位置扩增出1条特异性DNA条带，鉴定为 翘嘴鳜；样品在标准酶切片段的120bp位置扩增出1条特异性DNA条带，鉴定为斑鳜；样品 在标准酶切片段的l〇5bp位置和120bp位置各扩增出1条特异性DNA条带，鉴定为翘嘴鳜 和斑鳜的杂交子一代； 所述2)步骤中测得DNA的浓度范围为579. 3-3122. 9ng/μ 1 ; 所述2)步骤中PCR反应体系为：
所述2)步骤中PCR反应程序为：94°C预变性4min，然后按以下条件进行35个循环： 94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，循环结束后再72°C延伸lOmin，反应结束后于 4°C中保存。
【专利摘要】本发明公开了一种用于翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代的分子鉴定方法，其步骤：1）提取待测鳜鱼（翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子一代）样品的基因组DNA；2）以提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）扩增出DNA目的片段，用于PCR的一对微卫星引物序列为：引物正向序列：5’ATGTAACCGTAAGTGACCTC3’，引物反向序列：5’TGTTGTTCAGACGATGACGA3’；3）PCR产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行银染色，拍照记录电泳结果；4）与标准酶切片段的图谱进行比对，读出待测鳜鱼样品的目的条带所处的位置，分别鉴定为翘嘴鳜、斑鳜、杂交子一代。方法易行，操作简便，弥补了形态学鉴定的不足，解决了水产养殖中杂交鳜（翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代）鉴定难和种质混杂的问题。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104630335
【申请号】CN201310570896
【发明人】梁旭方, 窦亚琪, 吕丽媛, 杨敏, 田昌绪, 郑荷子, 赵程, 张进
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月13日