专利名称：一种斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法
技术领域：
本发明涉及鱼类繁殖技术，属于水产养殖技术领域，具体涉及斑鳜鱼精液的超低 温冷冻保存方法，以及用冷冻斑鳜鱼精液人工授精的方法，可广泛应用于家庭、集体鳜鱼养 殖，特别是规模化养殖繁育。
背景技术：
当前，针对鳜鱼的遗传改良工作在各地广泛进行。我国的鳜鱼资源鱼分布相对广 泛，但是资源量在逐步减少，生物多样性丢失问题严重；由于分布的广泛性，性腺成熟的时 间差大的可以达到两个月，而繁殖盛期为20天左右，杂交工作对性腺成熟度的要求更高， 过熟或者未完全成熟都将严重影响杂交育种繁殖受精率。为解决鱼类繁殖中人工授精以及孵化的技术问题，人们进行了广泛研究和实验。专利权人杨欣，2008年1月观日申请的名称“银鱼人工授精及受精卵孵化工 艺”的专利(专利号:CN200810018840. 5)，公开(公告)日:2008. 07. 16，公开(公告)号 CN101218899)，该发明涉及一种鱼类繁殖技术领域，尤其是一种银鱼人工授精及受精卵孵 化工艺，具有1.人工授精过程将精液和卵粒挤入容器，加4 8%。的生理盐水，搅拌并静 置2-3分钟；2.受精卵孵化过程，前期孵化受精卵在孵化室内，用4 8%。的生理盐水消毒 后倒入孵化盘内，加净水进行孵化，孵化室温度16 20°C、避风、采光、避免阳光直射，并且 换水和控制水温；后期管理受精卵开始出苗后，停止换水和消毒，添加净水，48至72小时 后，将开始平游的鱼苗投放进养殖池。该发明工艺采用合理、科学的方法，大幅度提高了鱼 苗产量和质量。诸如此类的涉及鱼类人工授精和受精卵孵化工艺的发明创造，相关技术还有很 多，就不一一列举，在鱼类养殖繁殖技术领域，这些技术方案无疑是成功可行的，鱼类精液的超低温冷冻保存方法已经基本成熟，但是种属差异明显存在；斑鳜精 液在室温条件下保存的时间很短，并且随着时间推移活力会大幅下降；相对于鳜鱼，斑鳜资 源量少，而且体型小，每一尾鱼可以提供的精液量通常不足1毫升，而且在繁殖过程中的应 激性大，怎样高效的利用斑鳜精液是一个关键的问题。在一般的繁殖过程中，往往没有注意 精卵比，或者不能根据精液量或者卵的量来灵活调整精卵比，以提高受精率的同时减少不 必要的资源浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种实用于解决斑鳜和翘嘴鳜杂交育种中性腺发育不同步， 在保证受精率的同时提高斑鳜精子利用率的方法。本发明是这样实现的一种斑鳜鱼精液冷冻保存方法，包括以下的步骤(1)精液采集采集成熟度好的斑鳜亲鱼精液，存放于4°C洁净的环境下备用；(2)稀释液配制配制含NaCl 0. 85% (重量比)、KC1 0. 05%、葡萄糖1. 5%的溶 液，调节PH值为6. 5，备用；
C3)精液稀释将上述稀释平衡后的精液和稀释液以1 4稀释比例混合稀释后， 添加抗冻剂DMSO至终浓度为9%，并放于4°C条件下平衡25分钟；(4)精液冷冻上述稀释精液置于液氮液面上方5厘米处平衡10分钟，再在液氮 面上方1厘米处平衡5分钟后投入液氮保存备用。该方法进一步包括所述精液采集步骤后进行质量检查肉眼观察正常精液为乳 白色，用普通显微镜，在10X40倍下，以清水激活，对平均活率大于70%的精液保存备用， 否则，弃之。本发明还包括一种斑鳜鱼人工授精的方法，其特征在于包括以下的步骤(1)精液解冻将权利要求1或2所述方法制备的冷冻精液进行解冻，即将上述精 液从液氮中缓慢提起并在接近液氮罐口液氮蒸气中静置6分钟后再浸入40°C的温水中摇 晃解冻60秒，解冻后的精液放于室温避光保存待用；(2)人工授精选取催产效应期的雌亲鱼，人工挤卵于干净无水的容器中，添加上 述适量解冻后精液以0.4% NaCl溶液激活受精。该方法进一步包括所述精液解冻后在^rc室温环境下保存十分钟，再人工授 精，即精卵充分混合后用0. 4% NaCl溶液激活受精。所述人工授精精卵数量配比为1000000 1时效果和成本更佳。本发明的一种斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法具有如下有益效果1.采用精液冷冻保存方法，解决不同类鳜鱼性腺成熟的时间差大自然条件无法得 到不同类鳜鱼杂交取优的问题，促进品种多元化和优化组合，适合规模化养殖繁育。2.斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法杂交工作克服对性腺成熟度的要求更 高，过熟或者未完全成熟都将严重影响杂交繁殖受精率的问题，提高杂交繁殖受精率，即解 决鳜杂交育种中鳜和斑鳜性腺发育不同步的问题并提高斑鳜精子利用率的方法。3.本发明设备要求低，操作易于实现，可用于一般的鱼类繁殖场地；能实现对斑 鳜资源的储存，解决杂交中斑鳜鱼和鳜鱼性腺发育不同步的问题；在繁殖过程中可以根据 育种需求和亲鱼资源量进行精卵比的灵活调整。
下面结合附图对本发明一种斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法，实施例进行 详细说明。所述实施例是以非限定性示例的方式给出图1 不同精卵比条件下鲜精和冻精的受精率对比
具体实施例方式实施例一下面以冷冻保存两尾斑鳜的约2毫升精液为例，说明具体操作过程(1)精液采集选取成熟度好的斑鳜亲鱼两尾；用毛巾擦干鱼体腹部；轻轻挤压腹 部，挤出少量精液后用干毛巾或者卫生纸擦去并擦干净生殖孔；再轻轻挤压腹部挤出无尿 液和粪便污染的精液并用两支2毫升离心管收集，分别编号B-I和B-2。采集的精液放于冰 面上暂时保存。(2)精液质量检查肉眼观察正常精液为乳白色；载玻片上滴一滴清水，并准备好盖玻片，以牙签挑取少许浸入事先准备好的清水中激活，立即盖片后用普通显微镜，在 10X40倍下观察，重复两次，平均活率大于70%的用于后续冷冻保存。(3)稀释液配制分别称取0. 85克NaCUO. 05克KC1、1. 5克葡萄糖溶解于水中， 加水定容至100毫升，调节PH值为6. 5，配制好后放入4°C冰箱备用。(4)精液稀释及分装分别于10支2毫升的冻存管中分装0. 8毫升稀释液和0. 1 毫升4°C保存的DMSO后摇勻，再分别取精液0.2毫升加入冻存管中并吹打均勻，两毫升分装 于10支冻存管中，然后放于冰面上避光平衡25分钟。抗冻剂DMSO即二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide或DMS0)，是分子式为(CH3) 2S0的化学物质，其为一无色液体，本实施例为抗冻 剂。(5)精液冷冻平衡后的冻存管在液氮罐的液氮液面上方5厘米处平衡10分钟， 液氮面上方1厘米处平衡5分钟后投入液氮保存。实施例二下面以解冻一管冷冻保存精液用于授精为例，说明具体操作过程(1)精液解冻解冻时将一支冻存管从从液氮中缓慢提起并在接近液氮罐口液氮 蒸气中缓冲6分钟后再浸入事先准备好的40°C的温水中摇晃解冻60秒。解冻后的精液放 于室温(^rc)避光保存待用。(2)授精选取催产后效应期到了的雌亲鱼一尾，人工挤卵于干净无水的碗中，取 卵10毫升添加1毫升已解冻10分钟的冻精，混合均勻并搅拌1分钟后，添加10毫升0. 4% Nacl溶液激活受精；加水充气孵化，原肠中期统计受精率可达40%。实施例三下面以0. 5毫升冷冻保存精液，在低精卵比条件下用于授精为例，说明具体操作 过程选取催产后效应期到了的雌亲鱼一尾，人工挤卵于干净无水的碗中，取卵50毫 升，添加0. 5毫升已解冻10分钟的冻精，混合均勻并搅拌1分钟后，添加50毫升0. 4% Nacl 溶液激活受精；加水充气孵化，可孵出鱼苗3000尾。参见说明书附图1，不同精卵比条件下鲜精和冻精的受精率对比，人工授精时，用 冻精授精，精卵比为1000000 1时可以获得近似鲜精授精时精卵比200000 1的受精率。 当鲜精精卵比大于200000 1，冻精精卵比大于1000000 1时，受精率只有小幅度的提高。当然，本发明不限于上述及附图示出的实施例，凡依本创造之精神所作的修改及 等效变换，或在此基础上采用多种变形，都属于本发明保护范围内。
权利要求
1.一种斑鳜鱼精液冷冻保存方法，其特征包括以下步骤(1)精液采集采集成熟度好的斑鳜亲鱼精液，存放于4°c洁净的环境下备用；(2)稀释液配制配制含NaCl0. 85% (重量比)、KC1 0. 05%、葡萄糖1. 5%的溶液，调 节PH值为6. 5 ；(3)精液稀释将上述精液和稀释液以1 4稀释比例混合稀释后，添加抗冻剂DMSO至 终浓度为9%，并放于4°C条件下平衡25分钟；(4)精液冷冻上述稀释平衡后的精液置于液氮液面上方5厘米处平衡10分钟，然后 在液氮面上方1厘米处平衡5分钟后投入液氮保存备用。
2.根据权利要求1所述的斑鳜鱼精液冷冻保存方法，其特征在于所述精液采集步骤后进行质量检查肉眼观察正常精液为乳白色，用普通显微镜，在 10X40倍下，以清水激活，对平均活率大于70%的精液保存备用，否则，弃之。
3.一种斑鳜鱼人工授精的方法，其特征在于包括以下的步骤(1)精液解冻将权利要求1或2所述方法制备的冷冻精液进行解冻，即将上述精液从 液氮中缓慢提起并在接近液氮罐口液氮蒸气中静置6分钟后再浸入40°C的温水中摇晃解 冻60秒，解冻后的精液放于室温下避光保存待用；(2)人工授精选取处于催产效应期的雌亲鱼，人工挤卵于干净无水的容器中，添加上 述适量解冻精液后，以0.4% NaCl溶液激活受精。
4.根据权利要求3所述的斑鳜鱼人工授精的方法，其特征在于所述精液解冻后在 ^TC室温环境下保存十分钟，再人工授精，即精卵充分混合后用0. 4% NaCl溶液激活受精。
5.根据权利要求3或4所述的斑鳜鱼人工授精的方法，其特征在于所述人工授精精 卵数量配比为1000000 1。
6.根据权利要求3或4所述的斑鳜鱼人工授精的方法，其特征在于所述雌亲鱼为翘 嘴鳜。
7.根据权利要求6所述的斑鳜鱼人工授精的方法，其特征在于所述人工授精精卵数 量配比为1000000 1。
全文摘要
本发明属于鱼类繁殖技术领域，涉及斑鳜鱼精液超低温冷冻保存及杂交人工授精方法，可广泛应用于家庭、集体鳜鱼养殖，特别是规模化养殖繁育。本发明包括精液采集、稀释液配制、精液稀释、精液冷冻、精液解冻、人工授精等步骤，人工授精时，通过不同的精卵比实验确定1000000∶1为最佳冻精与鲜卵比。本发明设备要求低，操作易于实现，可用于一般的鱼类繁殖场地，能实现对斑鳜资源的储存，解决了鳜杂交育种中鳜和斑鳜性腺发育不同步的问题并提高斑鳜精子利用率的方法，在繁殖过程中可以根据育种需求、生产需要和亲鱼资源量进行精卵比的灵活调整。
文档编号A01N1/02GK102077823SQ201010546568
公开日2011年6月1日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者何建国, 孙际佳, 李桂峰, 洪锡标, 王小林, 王海芳, 罗渡 申请人:中山大学, 佛山市生生水产股份有限公司