专利名称：一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于水产养殖中鱼种鉴定技术领域，具体涉及一种用于大眼鳜 和斑鳜的分子鉴定方法及该方法所使用的试剂盒。
背景技术：
鳜鱼(S/m》era3 c/zwa加')俗称桂花鱼，隶属舻形目(尸wcz/wmes)、鱖亚 科(57"z^w"""e)，是原产于中国各主要江河湖泊的珍贵淡水鱼类，主要有 翅嘴嫩CSVwz) e/ra c/2Ma&〃、大目艮嫩(5Vm) erc" ^2gr/)禾口珍王嫩(5Vmj^rca sc/ erzer/) 3个物种。在鱼种和成鱼阶段，可以通过形态学的方法进行鉴定，但在育苗 阶段无法根据形态学来鉴定。
微卫星(Microsatellite)是一类广泛存在于真核生物基因组中的具有高度 变异性的简单重复DNA序列。它具有按照孟德尔方式分离、多态信息含量 丰富、呈共显性遗传等特点，被广泛应用于简便快速的物种鉴定，目前尚 没有采用微卫星分子鉴定法进行大眼鳜和斑鳜鱼苗鉴定的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便快捷、准确有效的用于淡水养殖鱼类 中大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法。 本发明的方法包括以下步骤
1) DNA提取提取基因组DNA并测定其纯度和浓度；
2) DNA片段扩增采用聚合酶链式反应扩增DNA片段，扩增引物序 列为正向引物5'GGCTCGTAGAAGCAGTAGGT3'，
反向弓l物5' GGGATAATGTAGTAGGTGGATT 3';
3) PCR产物的电泳及银染色鉴定采用非变性聚丙稀酰胺凝胶，进行 常规银染色；
4) 与标准图谱进行对比如样品在靠近标准Marker的300bp位置扩 增出1条特异性DNA条带，则鉴定为斑鳜；如样品在靠近标准Marker的 400bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为大眼鳜。
所述l)步骤中测得DNA的A26。/A28o比值处于1.78 1.83，测得DNA的 浓度范围为385.8 3167.5ng/ti 1。
所述2)步骤中PCR反应体系优选为
所述2)步骤中PCR反应程序优选为94"C预变性5min，然后按以下 条件进行35个循环94。C变性30s， 53 58。C退火40 45s， 72。C延伸lmin， 循环结束后72'C延伸10min结束，4"C中保存。
所述3)步骤采用8%非变性聚丙稀酰胺凝胶。
本发明的另一目的在于提供一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定试剂 盒，包括一对SSR引物和标准图谱，其中用于聚合酶链式反应的一对引物 序列为
正向引物5'GGCTCGTAGAAGCAGTAGGT3'， 反向引物5' GGGATAATGTAGTAGGTGGATT 3';
本发明的优点在于
1、本发明的用于大眼鱖和斑鳜的分子鉴定方法不仅能提高大眼鳜和斑 鳜鉴定的效率和准确性，且操作简便快捷，具有广泛的适用性。
模板DNA 50 ng
10 X buffer 2.5 ul
25 mmol/L MgCl2 2.5 y 1
dNTPs 1.0mmol/L
引物 0.4umol/L
TaqDNA聚合酶 1.0 U
去离子水补齐至 25 U 1
①②③④⑤⑥⑦
2、采用本发明技术可望解决水产养殖中大眼鳜和斑鳜苗鱼的鉴定难
题，从而促进鳜鱼养殖业的健康发展。.
图l:扩增的部分大眼鳜和斑鳜的微卫星带谱
B带型为斑鳜，在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条特异性 DNA条带；M为DNA分子量标记；D带型为大眼鱖，在靠近标准Marker 的400bp位置扩增出1条DNA条带。
具体实施例方式
现结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 实施例1
1、 DNA的提取
采用苯酚-氯仿法提取基因组DNA。 0.8%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白 仪(Eppendorf产品)检测DNA浓度和纯度。
2、 扩增DNA片段
即聚合酶链式反应，用于聚合酶链式反应的一对引物DNA序列为
1) 正向引物5'GGCTCGTAGAAGCAGTAGGT3'， 反向弓l物5' GGGATAATGTAGTAGGTGGATT 3';
2) PCR反应体系如下
混匀后高速离心数秒。
3)PCR反应条件PCR反应在PCR仪上进行，其反应程序为94°C 预变性5min，然后按以下条件进行35个循环94'C变性30s， 55'C退火42s，
6
模板DNA 50 ng
10 X buffer 2.5 ul
25 mmol/L MgCl2 2.5 U 1
dNTPs 1.0 mmol/L
引物 0.4umol/L
TaqDNA聚合酶 1.0 U
去离子水补齐至 25 ul
①②③④⑤⑥⑦
72。C延伸lmin，循环结束后在72'C再延伸10min，反应结束后在4'C保存。 3、 PCR产物的电泳及银染色鉴定
1) 制胶8%的非变性聚丙稀酰胺凝胶。
2) 电泳每个产物上样14pL (含2pL上样缓冲液)，同时点上分子量 标记物，用lxTBE电泳缓冲液，260-280V恒压电泳，电泳兰色染料至凝 胶底端时终止。
3) 银染色鉴定染色过程如下10。/。的乙醇固定5min， 1%的硝酸脱 色3min， 0.2Q/o的硝酸银染色15min，水漂洗3次，3%的碳酸钠和0.046% 的甲醛显影，3%的冰醋酸终止，将固定后的聚丙烯酰胺凝胶放入凝胶成像 系统进行成像拍照。
4) 电泳图谱见附图1，斑鳜和大眼鳜分别扩增出不同大小的DNA条 带，斑鳜样品在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条特异性的DNA 条带，大眼鳜样品在靠近标准Marker的400bp位置扩增出1条DNA条带， 根据扩增样品的位置不同即可分辨出斑鳜和大眼鳜。
权利要求
1、一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法，其特征在于包括以下步骤1)DNA提取提取基因组DNA并测定其纯度和浓度；2)DNA片段扩增采用聚合酶链式反应扩增DNA片段，扩增引物序列为正向引物5′GGCTCGTAGAAGCAGTAGGT3′，反向引物5′GGGATAATGTAGTAGGTGGATT3′；3)PCR产物的电泳及银染色鉴定采用非变性聚丙稀酰胺凝胶，进行常规银染色；4)与标准图谱进行对比如样品在靠近标准Marker的300bp位置扩增出1条特异性DNA条带，则鉴定为斑鳜；如样品在靠近标准Marker的400bp位置扩增出1条DNA条带，则鉴定为大眼鳜。
2、 根据权利要求l所述的一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法，其特 征在于1)步骤中测得DNA的A26o/A28o比值为1.78 1.83。
3、 根据权利要求l所述的一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法，其特 征在于1)步骤中测得DNA的浓度范围为385.8 3167.5ng/lU。
4、 根据权利要求1所述的一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法，其特 征在于2)步骤中PCR反应体系为
5、 根据权利要求1所述的一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法，其特 征在于2)步骤中PCR反应程序为94'C预变性5min，然后按以下条件进 行32个循环:94。C变性30s， 53 58。C退火40 45s， 72。C延伸lmin，循环 结束后72"C延伸10min结束，4"C中保存。
6、 根据权利要求1所述的一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法，其特模板DNA 50 ng10 X buffer 2.5 ul25mmol/LMgCl2 2.5 U 1dNTPs 1.0mmol/L引物 0.4umol/LTaqDNA聚合酶 1.0 U去离子水补齐至 25 u 1①②③④⑤⑥⑦ 征在于3)步骤中采用8%非变性聚丙稀酰胺凝胶。
7、实施权利要求1所述分子鉴定方法的试剂盒，其特征在于其中包括有-一对SSR引物和标准图谱，其中用于聚合酶链式反应的一对引物序列为正向引物5'GGCTCGTAGAAGCAGTAGGT3'， 反向引物5' GGGATAATGTAGTAGGTGGATT 3'。
全文摘要
本发明公开了一种用于大眼鳜和斑鳜的分子鉴定方法及该方法所使用的试剂盒。分子鉴定方法包括以下步骤DNA提取、DNA片段扩增、PCR产物的电泳及银染色鉴定。试剂盒中包括一对SSR引物和标准图谱。本发明的分子鉴定方法能显著提高大眼鳜和斑鳜鉴定的效率和准确性，可望解决水产养殖中大眼鳜和斑鳜苗鱼的鉴定难题，促进鳜鱼养殖业的健康发展。
文档编号C12Q1/68GK101381769SQ20081014341
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者臻 刘, 张建社, 鲁双庆 申请人:长沙学院