专利名称：诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明诱导干细胞分化的生物技术领域，特别涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。
背景技术：
随着人均寿命的延长，人口老龄化问题越来越严重，中老年男性雄激素部分缺乏症(PADAM)患者越来越多。目前临床上主要采用了外源性雄激素替代疗法(ART)，目的是维持血清中睾酮的生理浓度，以替代内源性睾酮的生理功能。然而长期服用激素副作用较大，其一体内雄激素的靶细胞较多，长期服用外源雄激素治疗容易会有毒副作用的发生，尤其是前列腺；其二不同个体间血清睾酮水平差异较大，病人需频繁抽血检查相关指标以调整用量；其三睾酮替代治疗会破坏人体雄激素分泌晨高夜低的自然节律，还会抑制自身睾丸的激素分泌和生精功能。近年来随着细胞移植疗法的发展，人们把目光转向了对睾丸间质细胞(Leydig cells)的移植。由于睾丸间质细胞分泌的睾酮约占血浆睾酮的95%，人们试图通过睾丸间质细胞的移植来治疗睾酮分泌不足的问题，睾丸间质细胞移植可以升高患者血清睾酮水平。采用将分离提纯的睾丸间质细胞微囊化的方法，既可以防止宿主对植入睾丸间质细胞的免疫排异反应，又保证微胶囊内睾丸间质细胞成活和睾酮分泌，微囊化后睾丸间质细胞能对人绒毛膜促性腺激素有良好的反应性，术后能在一定时间保持患者血清睾酮水平。以上研究说明睾丸间质细胞移植可能是一种有效的治疗男性雄激素部分缺乏症的方法，但目前尚无法解决移植细胞来源问题。间充质干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下，间充质干细胞能够被诱导分化为多种细胞，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，神经细胞和肝细胞等。向骨髓间充质干细胞中转入类固醇生成因子-1 (SF-I)基因，能产生具有合成性腺激素和肾上腺类型类固醇激素能力的细胞。但骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着年龄增长或疾病的影响逐渐不同程度的削弱甚至丧失，这种方法分化效率较低，分泌的性腺激素量较低，需要寻找一种高效地将干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效地诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。本发明的另一目的在于提供所述诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，包含以下步骤(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的SF-I基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-Ι ；然后将重组载体 pAdtrack-CMV-SF-Ι与腺病毒载体质粒pAdEasy-Ι共转染大肠杆菌BJ5183细胞，得到携带 SF-I基因的腺病毒质粒pAd-SF-Ι ；将腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化，转染人胚肾细胞 AD-293细胞，得到腺病毒；(2)按MOI = 200的量将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)，将人脐带间充质干细胞诱导分化，得到睾丸间质细胞； 其中，诱导培养液的组成为基础培养基为DMEM-F12，含有体积百分比10%的胎牛血清 (FBS) U00U/ml的青霉素、100 μ g/ml的链霉素、Ing/mlLH黄体生成素(LH)、500yM的二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)、l(TM的全反式维甲酸(ATRA)、10mU/ml的人绒毛膜促性腺激素 (hCG)和2. 4uM的促肾上腺皮质激素(ACTH)。步骤(1)中所述的腺病毒质粒pAd-SF-Ι单酶切线性化优选通过I^c I酶切进行线性化；步骤(1)中所述的转染优选通过磷酸钙共沉淀法进行；步骤O)中所述的人脐带间充质干细胞优选通过如下方法制备得到首先从出生的正常足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织(Wharton’ s Jelly)，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80 90%融合，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有10% (ν/ν)胎牛血清(FBS)，5ng/ml bFGF, 216 μ g/ml 谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素和1 μ g/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液；所述人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子可用FACScan流式细胞仪检测，人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式细胞的鉴定条件为细胞的密度不低于 106/ml，采用 mouse anti IgGl/R-PE, mouse anti IgGl/FITC 作为同型对照；可用成脂、成骨分化鉴定干细胞的分化能力，成脂分化用油红染色鉴定，成骨分化用ALP染色及 Von kossa染色鉴定；步骤O)中所述诱导分化的条件优选为用胰酶将人脐带间充质干细胞消化，离心收集，按5 X IO5个细胞/孔的密度接种到6孔板，培养箱培养过夜让细胞贴壁，接着更换诱导培养液，以MOI = 200的量将腺病毒加入到诱导培养液中，轻晃培养板，使病毒分布均勻， 然后每两天更换新鲜诱导培养液；诱导分化的时间为7天。上述的方法应用于诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。一种睾丸间质细胞，通过上述方法得到。一种睾酮，通过上述睾丸间质细胞分泌得到。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)人脐带沃顿胶组织(Wharton's Jelly)来源的间充质干细胞取自免疫系统尚未发育完善胎儿的脐带，具有增殖效率高，免疫原性低，在无免疫抑制的情况下也不会出现免疫排斥。而骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着年衰或疾病的影响，逐渐不同程度的削弱甚至丧失。脐带来源间充质干细胞比骨髓来源间充质干细胞更容易获得，而且增殖能力更强，因此脐带间充质干细胞可以成为干细胞治疗中细胞移植的良好的细胞来源。
(2)本发明所述的方法利用携带SF-I基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞，并在DMEM-F12培养液中添加LH，dbcAMP，ATRA, hCG和ACTH，整个分化时间短，仅需一周即可获得睾丸间质细胞，具有更高的分化效率，能够获得更好睾酮分泌能力的睾丸间质细胞。本发明是一种高效地将干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，为治疗男性雄激素部分缺乏症提供了稳定的移植细胞的来源。
图1是人脐带间质干细胞原代与培养5代图，其中图(a)为原代细胞；图(b)为培养5代的细胞；观察倍数均为100X。图2是人脐带间充质干细胞流式细胞术鉴定图。图3是ALP染色鉴定人脐带间充质干细胞成骨分化能力图，其中图(a)为人脐带间充质干细胞经过观天的成骨诱导分化后ALP染色图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞，为阴性对照。图4是Von Kossa染色鉴定人脐带间充质干细胞成骨分化能力，其中图(a)为人脐带间充质干细胞经过观天成骨诱导分化后的Von kossa染色图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞，为阴性对照。图5是油红染色鉴定人脐带间充质干细胞成脂分化能力图，其中图(a)为人脐带间充质干细胞经过21天成脂分化诱导后的油红染色图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞，为阴性对照。图6是亚甲基蓝染色鉴定人脐带间充质干细胞软骨分化能力图，其中图(a)为人脐带间充质干细胞经过21天软骨分化诱导后的亚甲基蓝染色图；图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞，为阴性对照。图7携带SF-I基因的腺病毒的制备过程检测图，其中图(a)为从小鼠睾丸间质瘤细胞中拷贝SF-I基因，泳道1为回收的SF-I基因的 PCR产物，泳道M为200bp DNAmarker分子量标准；图(b)为将扩增得到的SF-I基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP内， 构建pAdtrack-CMV-SF-Ι质粒，连接产物转化大肠杆菌toplO细菌，泳道1_8为挑取的8个单克隆中所提取的质粒，泳道M为11Λ DNAmarker分子量标准；图(c)为EcoR I酶切验证，泳道1 6分别代表从图7(b)中选取1、2、4、5、7、8 号pAdtrack-CMV-SF-Ι质粒，采用EcoR I酶切后验证；泳道M为IlibDNA marker分子量标准；图(d)为采用电穿孔法将pAdtrack-CMV-SF-Ι与pAdEasy-Ι共转染BJ5183，挑取 4个单克隆，提取质粒进行电泳分析；泳道1 4为所提取质粒，泳道M为11Λ DNA marker 分子量标准。图 8 为 PAdiTrack-CMV-EGFP 质粒图。图 9 为 pAdTrack-CMV-SF-Ι 质粒图。图 10 为 pAdEasy-Ι 质粒图。图11是人脐带间充质干细胞经诱导分化为睾丸间质细胞的基因表达图。图12是人脐带间充质干细胞经诱导分化为睾丸间质细胞的睾酮分泌图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1人脐带间充质干细胞的分离与扩增采用组织块贴壁分离法。无菌条件下取得脐带，体积百分比0. 25%碘伏浸泡;3min 消毒，生理盐水冲洗，除去脐带表面及血管内血块，剪开脐带，用镊子撕下血管壁周围的沃顿胶组织(Wharton' s Jelly)，将其剪成1. 5 2. 5mm3大小的组织块，置于24孔板，加入 800ml培养液(培养液成分为10% (ν/ν)胎牛血清(FBS), 5ng/ml bFGF, 216 μ g/ml谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素和 1 μ g/ml 两性霉素 B 的 LG-DMEM 培养液)，放于培养箱，37°C，5% CO2条件下静置培养。12-15天后，镜检可看见从贴壁的组织块周围游离出的大量长梭形细胞，这时可用PBS溶液(1Χ，ρΗ = 7. 2)清洗去除组织块，质量体积比0. 25%的胰蛋白酶溶液，200g离心收集细胞，进行传代培养。贴壁细胞长至90%融合后，去除培养液，PBS溶液(1Χ，ρΗ= 7. 2)清洗，质量体积比0. 25%胰蛋白酶溶液消化，镜检等贴壁细胞收缩，胞间间隙变大时，加入含体积百分比10% FBS的LG-DMEM终止消化，轻轻吹打让细胞悬浮，200g离心收集细胞，血球计数板计数，调整细胞密度为1 X IO5个细胞/ 孔(6孔板)，37°C，5% CO2培养箱培养，每两天更换培养液。实施例2细胞形态学观察将脐带华尔通胶质组织块接种至M孔板培养10天后，逐渐可见到少量细胞从组织块中游离出来，贴壁生长，并不断增殖(图la)。在显微镜下观察，可见细胞形态呈现均一的长梭形，为典型的成纤维细胞的形态，成平行排列生长或漩涡状生长，随着集落生长的不断扩大而融合为单层贴壁细胞。常规传代培养，长满后可见细胞呈现漩涡状(图lb)。实施例3流式细胞术鉴定细胞表面抗原取正常培养的脐带间充质干细胞，流式细胞术检测细胞表面抗原的表达，包括 CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR0(1)细胞长至80 90%融合后，质量体积比0. 25%胰蛋白酶溶液消化，离心收集细胞，PBS溶液(IX，pH = 7. 2)清洗2次，调整细胞悬液浓度到IO6细胞/ml。(2)加入2ml含体积百分比为2. 5% FBS的PBS溶液(IX，pH = 7.2),吸打混勻细胞，200g离心。(3)所用抗体包括 CD105，CD73，CD90，CD45，CD34，CD14, CD19 和 HLA-DR 的抗体，非特异性背景以mouse anti IgGl/PE，mouse anti IgGl/FITC进行孵育作为对照均按1 50 比例，用PBS溶液(IX，pH = 7. 2)稀释后，冰上避光孵育40min ；。(4)孵育完成后，离心去上清，PBS溶液(IX，pH = 7. 2)重悬洗去抗体，重复1次。(5)最后用500 μ 1 PBS溶液(IX，pH = 7. 2)重悬细胞，流式细胞仪检测各组细胞荧光值。利用流式细胞术分析脐带间充质干细胞的细胞表面抗原的表达，在分离获得的脐带间充质干细胞中，⑶44、⑶73、⑶90、⑶105的表达为阳性，阳性率分别为94. 3%,95. 5%, 96. 9%,98. 1%，而CD14、⑶19、⑶34、⑶45及HLA-DR的表达基本上为阴性，其阳性率仅分别为1.8%、2.5%、2.6%、1.2%和2.3% (图2)。这些表面抗原的表达与典型的间充质干细胞的表面抗原的表达是一致的。实施例4人脐带间充质干细胞多向分化能力鉴定取实施例1制备的传代培养的脐带间充质干细胞，按2X IO4细胞/孔的密度接种到M孔板内，细胞长至60 70%融合后，去除原来培养液，PBS溶液(1Χ，ρΗ = 7. 2)清洗， 加入成骨分化诱导培养液(LG-DMEM，10% FBS,0. 216g/LNaHC03,100u/ml 青霉素，100 μ g/ ml链霉素，IOOmM地塞米松，IOmMβ -甘油磷酸钠，0. 2mM L-抗坏血酸盐)，以后每3天更换一次成骨分化诱导培养液。诱导观天后，进行von-Kossa染色和碱性磷酸酶染色(ALP staining)的成骨分化鉴定。取实施例1制备的传代的人脐带间充质干细胞，按2X IO4细胞/孔的密度接种到 24孔板内，细胞长至60 70%融合后，去除原来培养液，PBS清洗，加入成脂分化诱导培养液(LG-DMEM，10%FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素，60 μ M茚甲新， 1 μ M地塞米松，0. 5mM IBMX, 5 μ g/ml胰岛素)，以后每3天更换培养液一次，诱导21天后， 进行Oil Red 0染色检测。取实施例1制备的传代的人脐带间充质干细胞，经胰酶消化后，转移Iml细胞悬液于15ml塑料离心管中，500g离心15分钟，使其形成细胞微团结构，小心吸掉上层培养液， 加入2ml软骨分化培养液(LG-DMEM，10% FBS, 2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100 μ g/ ml链霉素，胰岛素铁硒传递蛋白(1化)，0. IyM地塞米松，SOyg/mL 2-磷酸抗坏血酸， 40 μ g/mL L-脯氨酸，100μ g/mL丙酮酸钠，lOng/ml转化生长因子β 1)，4天后首次换液，以后每隔2天换液，在21天后取出培养的细胞团块。行固定、包埋、切片。将切片进行亚甲基蓝染色，显微镜下观察并拍照。间充质干细胞的一个重要的鉴定标准，就是间充质干细胞具有多向分化的能力。 人脐带间充质干细胞在成骨分化诱导培养液中诱导观天以后，通过yon Kossa染色以及碱性磷酸酶(ALP)染色对分化后的细胞进行成骨分化鉴定。图3(a)中的棕红色显色区域显示ALP的染色结果。可见脐带间充质干细胞经成骨诱导分化后，胞质中呈现了碱性磷酸酶活性。图4(a)中的黑色颗粒状小结是矿质沉淀经Von Kossa染色的结果。而对照组则均呈现为阴性(图3(b)与图4(b))。脐带间充质干细胞经成脂分化诱导培养液的诱导21天后，采用Oil Red 0染色进行脂滴的检测。人脐带间充质干细胞经过成脂诱导后，分化的细胞中出现细小的脂滴，呈现明显的阳性(图5(a))，而在未分化的细胞内，染色未见脂滴的存在(图5(b))。软骨细胞分化诱导培养液中培养的细胞团约2天时与管壁分离形成球形结构，并在培养过程中逐渐长大。培养21天后进行切片和亚甲基蓝染色观察，可见经诱导的人脐带间充质干细胞呈现均一异染，细胞外基质呈淡蓝色(图6(a))，提示经诱导后细胞分泌的基质中含有大量的酸性蛋白多糖，而对照组未着色(图6(b))。实施例5携带SF-I基因腺病毒的制备从小鼠睾丸间质瘤细胞(MLTC-1，中国科学院上海细胞所，上海，中国)中提取总mRNA，反转录得到cDNA，用PrimerSTAR高保真DNA聚合酶扩增SF-I基因(98°C 10s， 58°C 20s, 72°C 1. 5min,反应30个循环)，回收SF-I的PCR产物，并将其磷酸化。其中扩增 SF-I基因的引物根据基因库号NM_139051的序列设计，如下正向PCR 引物5，-ATTCTCCTTCCGTTCAGCGGACG-3，；
反向 PCR 引物5，-GGCTGATGGAGGAAGGAATGGT-3，。 将扩增得到的SF-I基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-cmv-EGFP内(见图8，Stratagene公司，加利福尼亚州，美国)，具体步骤如下首先用内切酶Ml I消化 pAdtrack-cmv-EGFP载体，然后将先线性化的载体末端补平并去磷酸化。将制备好的SF-I 片段和pAdtrack-CMV-EGFP载体按照3 1的比例进行连接构建pAdtrack-CMV-SF-Ι质粒 (见图9)，连接产物转化大肠杆菌toplO细菌(Tiangen公司，北京，中国)并挑取单克隆。 由于SF-I片段和载体上各有一个EcoR I酶切位点。用EcoR I消化单克隆，正向连接的质粒将被切成2. 8kb和8. Okb的DNA片段，反向连接的产物将被切成7. Ikb和3. 3kb的DNA 片段，从而可以通过酶切筛选得到阳性克隆，再通过测序进行验证。将构建好的携带SF-I基因的穿梭质粒pAdtrack-CMV-SF-Ι与腺病毒载体质粒pAdEasy-Ι (见图10，Stratagene公司，加利福尼亚州，美国)共转染大肠杆菌 BJ5183 (Genmed公司，上海，中国)，两质粒在BJ5183细胞内会发生重组，得到携带SF-I基因的腺病毒质粒pAd-sf-1。将得到的携带SF-I基因的腺病毒质粒pAd-sf-Ι用I^c I酶切线性化后，磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(AD-293细胞，NIH, MD，美国)，以产生腺病毒。腺病毒的产生可根据EGFP的绿色荧光来确定。当表达绿色荧光的AD-293细胞越来越多，并出现细胞变圆， 核变大，细胞脱板悬浮的情况下，吸打收集AD-293细胞，PBS溶液(IX，PH7. 2)清洗，离心， 只保留200 μ 1 PBS, -80°C和37°C反复冻融三次，使细胞破壁，释放腺病毒，IOOOOg离心10 分钟，上清液为含制备的第一代腺病毒。得到的腺病毒可直接用于感染AD-293细胞，进行再一轮的扩增，以提高腺病毒的滴度。将AD-293细胞按2 X IO4细胞/孔的密度接种到24孔板内，待细胞长至50%融合后，更换新鲜高糖培养液(培养液成分为10% (ν/ν)胎牛血清(FBQ，216 μ g/ml谷氨酸盐， 2mg/ml NaHCO3,100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的HG-DMEM培养液)，将需要测定滴度的腺病毒悬液从KT1到10_12，接10倍的梯度进行稀释，然后每个梯度取50 μ 1加到培养液中进行感染，每个梯度设3个重复孔。M小时后荧光显微镜下检查绿色荧光的表达情况。 如在10_7梯度的孔中计数得到绿色细胞为50个，则病毒的滴度计为101(1。研究结果从小鼠睾丸间质瘤细胞中提取总mRNA，反转录得到cDNA，PCR扩增SF-I 基因，回收PCR产物(如图7(a)所示)，跑胶结果显示PCR产物符合目标基因大小。将制备好的SF-I片段和pAdtrack-CMV-EGFP载体按照一定的比例进行连接，将连接产物转化 toplO细菌，并挑取8个单克隆(如图7(b)所示)。用EcoR I酶切消化验证连接产物(如图7 (c)所示)，正向连接的质粒将被切成2. Skb和8. Okb的DNA片段，反向连接的产物将被切成7. Ikb和3. 3kb的DNA片段。从酶切结果可以判断7号克隆为正向连接，将7号克隆测序后发现该克隆DNA序列正确。将得到的pAdtrack-CMV-SF-Ι与pAdEasy-Ι质粒采用电穿孔法共转染BJ5183，挑选重组质粒，重组质粒大小约为44Kb (如图7 (d)所示)，挑选2号质粒进行酶切转化AD-293细胞，以产生携带SF-I基因的腺病毒。实施例6采用携带SF-I基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞采用常规培养的实施例1制备得到的人脐带间充质干细胞，酶消化，离心收集，按 5 X IO5的密度接种到6孔板内，培养箱培养过夜让细胞贴壁。第二天早上，更换诱导培养液 (DMEM-F12,10% FBS, 100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素，lng/ml LH, 500 μ M dbcAMP, KT5MATRA, 10mU/ml hCG，2. 4uM ACTH)，以MOI = 200的量将腺病毒加入到培养液中，轻晃培养板，使病毒分布均勻。以后每两天更换新鲜诱导培养液，诱导分化7天。实施例7鉴定诱导分化的细胞的基因表达携带SF-I基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞后第7天，用Real-timeRT-PCR 检测类固醇合成相关基因的表达，包括P450SCC、17 β -HSD, LHR和3 β -HSD，引物及荧光探针如下P450SCC-F 5' -GCGGGCTCCGGAAATTACTC-3’
P450SCC-R 5’ -CTGGTAGATGGCATCAATGAATCG-3 ’P450SCC-P :5，-(FAM)AGTGATGACCTGTTCCGCTTTGCCT (Eclipse)_3，17 β -HSD-F 5，-TTAGTCAACAATGTCGGAATGCTTC-3，17 β -HSD-R 5’ -ACTACGGAGGTGATGTTACAATGG-3 ’17 β -HSD-P :5，-(FAM)CCCAAGCCATTTCCTGAACGCACCG(Eclipse)-3，LHR-F :5，-CAATGTGAAAGCACAGTAAGGAAAG-3‘LHR-R :5，-GGTGTCTTGGGTAAGCAGAAAC-3，LHR-P :5，-(FAM)CCAGCCACTCAGTTCACTCTCAGCA (Eclipse)-3，3 β -HSD-F 5’ -AAGCTAGTGTGCCAGTCTTCATC-3 ’3 β -HSD-R 5’ -CGTTTTTCAGATTCCACCCGTTAG-3’3 β -HSD-P :5，-(FAM)CGCCAGTACAGCCTTCTCAGCAAGC(Eclipse)_3，反应扩增条件为
权利要求
1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于包含以下步骤(1)将核苷酸序列如SEQID NO 1所示的小鼠类固醇生成因子-1基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-Ι ；然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-Ι与腺病毒载体质粒pAdEasy-Ι共转染大肠杆菌BJ5183细胞， 得到携带SF-I基因的腺病毒质粒pAd-SF-Ι ；将腺病毒质粒pAd-SF-Ι单酶切线性化，转染人胚肾细胞AD^3，得到腺病毒；(2)按MOI= 200的量将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化，得到睾丸间质细胞；其中，诱导培养液的组成为基础培养基为DMEM-F12，含有体积百分比10%的胎牛血清、100U/ml的青霉素、100 μ g/ml的链霉素、0. 3-3ng/ml黄体生成素、200-800 μ M的二丁酰环磷酸腺苷、 5Χ 10_6-5Χ KT4M的全反式维甲酸、10mU/ml的人绒毛膜促性腺激素和2. 4uM的促肾上腺皮质激素。
2.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于步骤⑴中所述的腺病毒质粒pAd-SF-Ι单酶切线性化为通过I^c I酶切进行线性化。
3.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于步骤(1)中所述的转染为通过磷酸钙共沉淀法进行。
4.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于步骤O)中所述的人脐带间充质干细胞通过如下方法制备得到首先从出生的正常足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80 90%融合，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有体积百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，216 μ g/ml谷氨酸盐，2mg/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ ml链霉素和1 μ g/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液。
5.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于所述的人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子为通过FACScan流式细胞仪进行检测，人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式细胞的鉴定条件为细胞的密度不低于 106/ml，采用mouse anti IgGl/R-PE,mouse anti IgGl/FITC作为同型对照;所述的人脐带间充质干细胞通过成脂、成骨分化鉴定干细胞的分化能力，成脂分化用油红染色鉴定，成骨分化用ALP染色及Von kossa染色鉴定。
6.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于步骤O)中所述诱导分化的条件为用胰酶将人脐带间充质干细胞消化，离心收集， 按5X IO5个细胞/孔的密度接种到6孔板，培养箱培养过夜让细胞贴壁，接着更换诱导培养液，以MOI = 200的量将腺病毒加入到诱导培养液中，轻晃培养板，使病毒分布均勻，然后每两天更换新鲜诱导培养液；诱导分化7天。
7.权利要求1 6任一项所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法的应用，其特征在于所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法用于诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。
8.一种睾丸间质细胞，通过权利要求1 6任一项所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法得到。
9.一种睾酮，通过权利要求8所述的睾丸间质细胞分泌得到。
全文摘要
本发明公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。本发明所述的方法包括如下步骤采用携带小鼠类固醇生成因子-1基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞，在含有0.3-3ng/ml黄体生成素，200-800μM二丁酰环磷酸腺苷，5×10-6-5×10-4M全反式维甲酸，10mU/ml人绒毛膜促性腺激素和2.4uM促肾上腺皮质激素的DMEM-F12培养液内培养一周。经过本发明所述方法的诱导，人脐带间充质干细胞在体外可以分化为睾丸间质细胞，为采用细胞替代或者基因方法治疗睾酮缺乏症提供了重要的细胞来源。
文档编号C12N7/01GK102174468SQ20111004501
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者白杨, 魏星 申请人:暨南大学