专利名称：与抗白粉病相关的蛋白TaWRKY2及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与抗白粉病相关的蛋白TaWRKY2及其编码基因。
背景技术：
小麦白粉病(Powdery mildew)是由专性寄生真菌禾布氏白粉菌Bgt (Blumeriagraminis f sp. tritici)引起的ー种真菌性病害,属世界性分布的病害,严重影响了世界小麦的产量。近年来，由于作物种植密度的增高，氮肥施用量的増大，以及作物种植的単一，使小麦白粉病造成的危害日益严重。小麦受害后，可导致叶片早枯，光合作用降低，呼吸作用加强，分蘖数減少，成穗率降低，干粒重下降，一般可减产5% 10%，重病田减产达20%以上。由于小麦白粉病菌具有群体大、适应范围广、生理小种众多.且变异速度快.使得许多有效抗病基因丧失抗性。目前育种工作者一直以选育和推广抗病品种作为病害的主要防 治手段，多年来，且颇见成效，但抗性丧失一直是未能解决的问题，抗源多样化是实现抗病性持久的有效途径。为此通过生物学的方法克隆新的抗病基因，利用转基因的方法提高小麦对白粉病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。
发明内容
本发明的ー个目的是提供ー种与白粉病抗性相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的蛋白，名称为TaWRKY2，来源于普通小麦京411，是如下a)或b)的蛋白质a)由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO : I所示的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与白粉病抗性相关的由a)衍生的蛋白质。所述编码基因为如下I)或2)或3)所示I)其核苷酸序列是SEQ ID NO 2所示DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。扩增上述任一所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对中的一条引物序列如SEQ ID NO :3所示，所述引物对中的另一条引物序列如SEQ ID NO 4所示。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。上述任一所述蛋白或上述任一所述蛋白编码基因在调节植物对白粉病的抗性中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述应用中，所述白粉病为大麦白粉病或小麦白粉病；所述植物为大麦或小麦。上述任一所述应用中，所述大麦白粉病由大麦白粉病菌弓I起的,所述小麦白粉病由小麦白粉病菌引起的。上述任一所述应用中，所述大麦白粉病菌为大麦白粉菌生理小种Kl (AvrMlal,virMla6, virMlal2, virMlg)或大麦白粉病菌生理小种 A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2,AvrMlg);所述小麦白粉病菌为小麦白粉病菌15号生理小种E09 ；上述任一所述应用中，所述大麦为大麦品种POl (含Mlal);所述小麦为小麦品种扬麦158 (不含Pm21)。
实验证明，本发明基因对小麦或大麦的抗白粉病性能是进行负调控的。本发明基因在小麦育种方面将有广阔的应用前景，在保证小麦高产稳产方面具有重要的意义。
图I为小麦TaWRKY2蛋白亚细胞定位。图2为抗病感病细胞图示。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、TaWRKY2的获得I、候选EST与基因全长cDNA的电子延伸以大麦HvWRKY I为种子序列，搜索小麦EST数据库(http: / / co即bio, dfci.harvard. edu/tRi/cRi-bin/tRi)中的EST序列,保存高度同源的EST序列,将搜到的序列进行拼接组装成重叠群(contig),在预测的开放阅读框(Open reading frame, 0RF)タト,设计特异性引物；引物序列如下TaffRKY2 :F2 5，> ATGGAGGAGCAGTGGATGAT > 3，(SEQ ID NO :3)R2 5，> TCAAGCAACAGGGATCCGAC > 3’ (SEQ ID NO :4)2、小麦TaWRKY2基因的cDNA的克隆挑选大小一致小麦品种豫麦66 (高抗白粉病)、京411 (高感白粉病)各40粒种子，播种于苗钵中，长至第一片叶完全展开时(大约一周左右时间)，利用北京地区流行的小麦白粉病菌15号生理小种(E09菌株)对小麦材料进行高密度接菌处理，在接菌后O、I、
2、3、12、24小时，收集小麦叶片，用于总RNA的提取。利用Trizol法提取小麦总RNA，以总RNA 为模板，米用 Invitrogen 公司的 M-MLV Reverse Transcriptase 合成 cDNA 第一链，以合成的第一链为模板，用上述的引物对F2/R2进行RT-PCR扩增，扩增产物进行测序。对京411的扩增产物的测序结果表明得到cDNA为SEQ ID NO 2所示的基因，将该基因命名为TaWRKY2，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。实施例2、小麦TaWRKY2的分子特性及作用机制研究转录因子的特征之ー是定位于细胞核中，并在细胞核中执行其转录调控功能。为此，利用基因枪介导的方法在小麦叶片细胞中对小麦TaWRKY2蛋白的亚细胞定位进行了研究。结果表明，与大麦HvWRKY2相同，小麦TaWRKY2也定位于细胞核中(图I)。图I中，CFP (青色荧光蛋白)、CFP-HvWRKY2 (CFP在HvWRKY2的N端、TaWRKY2_YFP (黄色荧光蛋白在TaffRKY2 的 C 端)、Overlay 重叠。
实施例3、TaffRKY2在大麦和小麦抗白粉病中的功能研究I、TaWRKY2在大麦抗白粉病中的功能(I) TaffRKY2对大麦小种专化抗性的影响载体pGY_l 在文献“Patrick Schweizer et al, A Transient Assay Systemfor tne Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat. MPMI,1999,12 647-654”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。载体p35S_GUS 在文献“Patrick Schweizer et al, A Transient Assay Systemfor tne Functional Assessment of Defense-Related Genes in Wheat. MPMI,1999,12 647-654”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。大麦品种POl (含 Mlal)在文献“ Shen Q H et al. , Recognition Specificityand RARiVSiafl Dependence m Barley Mla Disease Resistance Genes to the PowaeryMildew Fungus. 2003,15 :732_744”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。大麦白粉病菌生理小种Kl(AvrMlal, virMla6, virMlal2, virMlg)在文献“Shen QHet al. , Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla DiseaseResistance Genes to the Powdery Mildew Fungus. 2003,15 :732-744，，中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。p D0NR201 购自 Invitrogen 公司；pUbi_GW 购自 Invitrogen 公司。BP 反应试剂及LR反应试剂均购自Invitrogen公司。载体pUbi_TaWRKY2的构建及鉴定方法设计扩增TaWRKY2全长的引物，上游引物的前端加上attBl，下游引物加上 attB2F :5GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATGGAGGAGCAGTGGATGAT3R 5GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCAAGCAACAGGGATCC3。以人工合成的SEQ ID NO 2所示基因为模板，进行PCR扩增；扩增产物进行回收，回收后产物和PD0NR201进行BP反应生成ENTRY载体。PCR 产物(40ng/ul) 3. 5ulBP重组酶混合物 0. 5ulp D0NR201(100ng/ul) Iul25°C,3hr。酶切鉴定阳性克隆，阳性克性即为ENTRY载体。ENTRY载体再和p Ubi-Gff进行LR反应。体系如下ENTRY 载体(100ng/ul) IulLR重组酶混合物0. 5ulp Ubi-Gff(100ng/ul) IulTE (PH = 8. 0)2ul25°C,3hr。酶切鉴定阳性克隆，阳性克性即为pUbi_TaWRKY2。将阳性克隆进行测序验证，测序验证结果测得pUbi-TaWRKY2中含有SEQ ID NO 2所示基因序列。用于后续实验。载体pUbi_HvWRKY2的构建及鉴定方法用如下引物对F/R，以人工合成的Genebank号为AJ853838的序列为模板，进行PCR扩增，得到HvWRKY2基因。按照上述方法得到重组载体pUb i-HvffRKY2。F 5GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATGGAGGAGCAGTGGATG3R 5GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC TCAAGCAACAGGGATCC3。转化方法基因枪介导的方法大麦种子经保湿吹芽种植后，待长至一周左右，剪下第一片叶，叶面朝上，放置于含有培养基(1%的琼脂，80mg/L苯丙咪唑，其余为水)的培养皿上，恢复3小时，进行基因枪轰击；将目的质粒pUbi-TaWRKY2和质粒p35S_GUS按I : I体积充分混合，包裹在直径为Ium金粉微粒上，采用roS-1000/He (美国Bio-Rad)轰击靶材料，基因枪轰击參数为阻挡网与轰击材料之间的距离为5. 5cm，可裂膜压カ为llOOPa，每枪金粉-DNA用量为42/0. 2lug。
接大麦白粉菌生理小种Kl (AvrMlal, virMla6, virMlal2, virMlg)的方法基因枪轰击完毕后，将大麦叶片放入培养箱中恢复培养4小时(培养条件20°C 16h光照/18°C 8h黑暗)，4小时后进行接菌，将孢子抖落在大麦叶片上，保证I个孢子/mm2，培养40小时(培养条件20°C 16h，光照/18°C 8h，黑暗)，进行⑶S染色，37°C过夜染色完毕后进行脱色，两天后利用显微镜进行细胞观察。统计表达⑶S的细胞中感病细胞的比例来计算吸器指数，根据吸器指数来判断基因TaWRKY2的功能。吸器指数与抗病性的关系吸器指数小于20%为高抗，大于60%为高感、30%-60%之间为(包括30%和60%)中抗或中感。抗病细胞的判断标准细胞内表达GUS，且细胞内不含有吸器，而细胞表面附着有分生孢子的细胞为抗病细胞(图2A)。感病细胞的判断标准细胞内表达GUS，且细胞内含有吸器的细胞为感病细胞(图2B)。吸器指数的计算公式吸器指数=感病细胞的个数パ抗病细胞的个数+感病细胞的个数)X 100%。以转入pGY-1和p35S-GUS的大麦叶片作为空对照，以转入pUbi_HvWRKY2和载体P35S-GUS的大麦叶片作为阳性对照。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，转入载体pUbi_TaWRKY2和载体p35S_GUS的大麦叶片的吸器指数为55. 69 % ;转入pGY-1和载体p35S-GUS的大麦叶片的吸器指数为17. 58% ;转入pUbi-HvffRKY2和载体p35S-GUS的大麦叶片的吸器指数为58. 65%。结果显示，在大麦叶片中过表达TaWRKY2后，吸器指数明显上升，说明TaWRKY2和HvffRKY2的作用相同，在大麦的小种专化抗性中有负调控作用。(2) TaffRKY2对大麦本底抗性的影响大麦白粉病菌生理小种A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2, AvrMlg)在文献“Shen QH et al. Recognition Specificity and RAR1/SGT1 Dependence in Barley Mla DiseaseResistance Genes to the Powdery Mildew Fungus. 2003,15 :732_744”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。方法与实验(I)中所述基本相同，不同的是接种的致病菌为大麦白粉病菌生理小种 A6 (virMlal, AvrMla6, AvrMlal2, AvrMlg)。
实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，转入载体pUbi_TaWRKY2和载体p35S_GUS的大麦叶片的吸器指数为81.40% ;转入pGY-1和载体p35S-GUS的大麦叶片的吸器指数为54. 60 % ;转入pUbi-HvffRKY2和载体p35S-GUS的大麦叶片的吸器指数为81. 45%。结果显示，在大麦叶片中过表达TaWRKY2后，吸器指数明显上升，说明TaWRKY2和HvffRKY2的作用相同，在大麦的本底抗性中有负调控作用。2. TaffRKY2在小麦抗白粉病中的功能(I) TaffRKY2对小麦本底抗性的影响小麦品种扬麦158(不含 Pm2I)在文献“LIUP et al. Transfer ofdisease resistance oi Triticum aes11tpvum-HaynaIaia villosa DゾS/6AI J trans丄ocationlines in diferent wheat background. Journal of Naming AgriculturalUniversity. 2004,27(2) :1 5”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。小麦白粉病菌15号生理小种(菌株E09)在文献“Hu T Z et al. Identificationand Molecular Mapping Gene in Wheat Cultivar yu mai 66 of the Powdery MildewResistance. ACTA AGRONOMICA SINICA 2008,34(4) :545_55”中公开过，公众可从中国科学
院遗传与发育生物学研究所获得。方法与实验I中⑴所述基本相同，不同的是接种的致病菌为小麦白粉病菌15号生理小种(菌株E09)，转化的是小麦品种扬麦158(不含Pm21)的叶片。实验设3次重复，结果取平均数结果表明，转入载体pUbi_TaWRKY2和载体p35S_GUS的小麦叶片的吸器指数为80. 36% ;转入pGY-1和p35S-GUS的小麦叶片的吸器指数为54. 60% ;转入pUbi_HvWRKY2和p35S-GUS的小麦叶片的吸器指数为81. 45%。结果显示，在小麦叶片中过表达TaWRKY2后，吸器指数明显上升，说明TaWRKY2在小麦的本底抗性中起负调控作用。(2) TaffRKY2对小麦广谱抗性的影响小麦品种小麦一簇毛麦易位系6VS/6AL(含Pm21)在文献“CaoAZ et al. Cloningand Analysis of an Hv-OxOLP bene induced by Ergsiphe gramims in H. villosa.Journal of Triticeae Crops. 2006, 26 (5) :27 32”中公开过,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。方法与实验⑴中所述基本相同，不同的是所用的小麦品种是小麦品种小麦ー簇毛麦易位系6VS/6AL(含Pm21)。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，转入载体pUbi_TaWRKY2和载体p35S_GUS的小麦叶片的吸器指数为12. 57% ;转入pGY-1和载体p35S-GUS的小麦叶片的吸器指数为13. 60% ;转入pUbi-HvffRKY2和载体p35S-GUS的小麦叶片的吸器指数为12. 62%。结果显示，小麦叶片中过表达TaWRKY2后，吸器指数几乎不变，说明Pm21介导的广谱抗性不依赖于TaWRKY2。说明TaWRKY2的功能在广谱抗性中没有作用，可能在小种专化抗性中起作用。
权利要求
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质 a)由SEQID NO 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将SEQID NO :I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与白粉病抗性相关的由a)衍生的蛋白质。
2.权利要求I所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下I)或2)或3)所示 1)其核苷酸序列是SEQID NO 2所示DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 3)与I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于所述引物对中的一条引物序列如SEQID NO 3所示，所述引物对中的另一条引物序列如SEQ ID NO 4所示。
6.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒。
7.权利要求I所述蛋白或权利要求2或3中所述编码基因在调节植物对白粉病的抗性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述白粉病为大麦白粉病或小麦白粉病；所述植物为大麦或小麦。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述大麦白粉病由大麦白粉病菌引起的，所述小麦白粉病由小麦白粉病菌弓I起的。
全文摘要
本发明公开了与抗白粉病相关的蛋白TaWRKY2及其编码基因。该蛋白质是如下a)或b)的蛋白质a)由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ IDNO1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与白粉病抗性相关的由a)衍生的蛋白质。实验证明，实验证明，本发明基因对小麦或大麦的抗白粉病性能是进行负调控的。本发明基因在小麦育种方面将有广阔的应用前景，在保证小麦高产稳产方面具有重要的意义。
文档编号C12N7/01GK102649811SQ20111004497
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者刘敏, 沈前华, 王秋韫, 韩新运 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所