专利名称：诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明为诱导干细胞分化的生物技术领域，特别涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。
背景技术：
随着人均寿命的延长，人口老龄化问题越来越严重，中老年男性雄激素部分缺乏症(PADAM)患者越来越多。目前临床上主要采用了外源性雄激素替代疗法(ART)，目的是维持血清中睾酮的生理浓度，以替代内源性睾酮的生理功能。然而长期服用雄激素副作用较大，其一体内雄激素的靶细胞较多，长期服用外源雄激素治疗容易会有毒副作用的发生，尤其是前列腺；其二不同个体间血清睾酮水平差异较大，病人需频繁抽血检查相关指标以调整用量；其三睾酮替代治疗会破坏人体雄激素分泌晨高夜低的自然节律，还会抑制自身睾丸的雄激素分泌和生精功能。近年来随着细胞移植疗法的发展，人们把目光转向了采用睾丸间质细胞(Leydig cells)的移植。由于睾丸间质细胞分泌的睾酮约占血浆睾酮的95%，人们试图通过睾丸间质细胞的移植来治疗睾酮分泌不足的问题，睾丸间质细胞移植可以升高患者血清睾酮水平。采用将分离提纯的睾丸间质细胞微囊化的方法，既可以防止宿主对植入睾丸间质细胞的免疫排异反应，又保证微胶囊内睾丸间质细胞成活和睾酮分泌，微囊化后睾丸间质细胞能对人绒毛膜促性腺激素有良好的反应性，术后能在一定时间内保持患者血清睾酮水平。 以上研究说明睾丸间质细胞移植可能是一种有效的治疗男性雄激素部分缺乏症的方法，但目前尚无法解决移植细胞来源的问题。间充质干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下，间充质干细胞能够被诱导分化为多种细胞，包括成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，神经细胞和肝细胞等。向骨髓间充质干细胞中转入类固醇生成因子-1 (SF-I)基因，能产生具有合成性腺激素和肾上腺类型类固醇激素能力的细胞。但骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着骨髓供体的年龄增长或疾病的影响逐渐不同程度的减弱甚至丧失；并且，骨髓间充质干细胞的分化效率较低，分泌的性腺激素量较低，需要寻找其他来源的干细胞和有效的诱导分化方法，可以更高效地将干细胞诱导分化为睾丸间质细胞。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种有效地诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法。本发明的另一目的在于提供所述诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞方法的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，包含以下步骤
(1)将SF-I基因(NM 139051，核苷酸序列171-1828，如SEQ ID NO. 1所示)插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-Ι ； 然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-Ι与腺病毒载体质粒pAdEasy-Ι共转染大肠杆菌 BJ5183，得到携带SF-I基因的腺病毒质粒pAd-SF-Ι ；将腺病毒质粒pAd-SF-Ι单酶切线性化，转染人胚肾细胞AD-293后得到腺病毒。(2)采用MOI = 200的量，将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞；诱导培养液的组成为基础培养基为DMEM/F12，含有体积百分比10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、 100 μ g/ml链霉素、500 μ M 二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)。步骤(1)中所述的腺病毒质粒pAd-SF-Ι单酶切线性化是采用I^c I酶切进行线性化；步骤(1)中所述的转染采用磷酸钙共沉淀法进行；步骤O)中所述的人脐带间充质干细胞通过如下方法制备得到从正常的足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织(Wharton’ s jelly)，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80 90%融合时，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养，得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有体积百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和1 μ g/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液。所述的人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子可用FACScan流式细胞仪检测， 人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式细胞的鉴定条件为细胞的密度不低于 IO6 细胞/ml，采用 mouse anti IgGl/PE，mouse anti IgGl/FITC 作为同型对照；采用成脂分化、成骨分化和成软骨分化鉴定干细胞的分化能力，成脂分化用油红染色鉴定，成骨分化用碱性磷酸酶(ALP)染色及Von kossa染色鉴定，成软骨分化用亚甲基蓝染色鉴定。步骤O)中所述的诱导分化的条件采用胰酶将人脐带间充质干细胞消化，离心收集，按5 X IO5个细胞/孔的密度接种到6孔板，在培养箱培养过夜让细胞贴壁后，更换为诱导培养液，以MOI = 200的量将腺病毒加入到诱导培养液中，轻摇动培养板使病毒分布均勻，然后每两天更换新鲜诱导培养液，诱导分化的时间为7天。上述的方法应用于诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。一种睾丸间质细胞，通过上述方法得到。一种睾酮，通过上述睾丸间质细胞分泌得到。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)人脐带沃顿胶组织(Wharton's jelly)来源的间充质干细胞取自免疫系统尚未发育完善胎儿的脐带，具有增殖效率高，免疫原性低，在无免疫抑制的情况下不会出现免疫排斥。而骨髓间充质干细胞体外增殖能力、多向分化能力以及细胞稳定性都会随着骨髓供体年衰或疾病的影响，逐渐不同程度的减弱甚至丧失。脐带来源间充质干细胞比骨髓来源间充质干细胞更容易获得，而且增殖能力更强，因此脐带间充质干细胞可以成为干细胞治疗中细胞移植的良好的细胞来源。(2)本发明所述的方法利用携带SF-I基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞，并在DMEM-F12培养液中添加dbcAMP，整个分化时间短，仅需一周即可获得睾丸间质细胞，具有更高的分化效率，能够获得更强睾酮分泌能力的睾丸间质细胞。本发明是一种高效地将间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，可为治疗男性雄激素部分缺乏症提供稳定的移植细胞的来源。
图1是人脐带间质干细胞原代与培养5代图；图(a)为原代细胞，图(b)为培养5代的细胞，观察倍数均为100倍。图2是人脐带间充质干细胞的流式细胞术鉴定图。图3是ALP染色鉴定人脐带间充质干细胞的成骨分化能力图；图(a)为人脐带间充质干细胞经过观天成骨诱导分化后的碱性磷酸酶(ALP)染色图，图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。图4是Von Kossa染色鉴定人脐带间充质干细胞的成骨分化能力图；图(a)为人脐带间充质干细胞经过观天成骨诱导分化后的Von kossa染色图，图 (b)为未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。图5是油红染色鉴定人脐带间充质干细胞的成脂分化能力图；图(a)为人脐带间充质干细胞经过21天成脂诱导分化后的油红染色图，图(b)为未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。图6是亚甲基蓝染色鉴定人脐带间充质干细胞的软骨分化能力图；图(a)为人脐带间充质干细胞经过21天软骨诱导分化后的亚甲基蓝染色图，图 (b)为未分化的人脐带间充质干细胞作为阴性对照。图 7 是 PAdiTrack-CMV-EGFP 质粒图。图 8 是 pAdTrack-CMV-SF-Ι 质粒图。图 9 是 pAdEasy-Ι 质粒图。图10是携带SF-I基因的腺病毒的制备过程检测图；图(a)为从小鼠睾丸间质瘤细胞中拷贝SF-I基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为回收的SF-I基因的PCR产物，泳道M为200bp DNA marker分子量标准；图(b)为pAdtrack-CMV-SF-Ι阳性克隆筛选图，泳道1 8为挑取的8个单克隆中所提取的质粒，泳道M为11Λ DNA marker分子量标准；图(c)为采用EcoR I酶切验证图，泳道1 6分别为图(b)中的1、2、4、5、7、8号质粒的EcoR I单酶切后产物，泳道M为11Λ DNA marker分子量标准；图(d)为采用电穿孔法将pAdtrack-CMV-SF-Ι与pAdEasy-Ι共转染大肠杆菌 BJ5183后的克隆筛选图泳道1 4为所提取的质粒，泳道M为11Λ DNAmarker分子量标准。图11是采用Real-time RT-PCR方法检测将人脐带间充质干细胞经过诱导分化为睾丸间质细胞的基因表达的图。图12是采用酶联免疫吸附测定法检测将人脐带间充质干细胞经过诱导分化为睾丸间质细胞的睾酮分泌图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1人脐带间充质干细胞的分离与扩增采用组织块贴壁分离法。在无菌条件下取得脐带，采用体积百分比0. 25%碘伏浸泡脐带:3min消毒，采用生理盐水冲洗除去脐带表面及血管内的血块，剪开脐带，用镊子撕下血管壁周围的沃顿胶组织(Wharton's jelly)，将其剪成1. 5_2. 5mm3大小的组织块，置于 24孔板内，加入800ml培养液(培养液含有体积百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和1 μ g/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液)，放于培养箱，37°C,5% CO2条件下静置培养。 12-15天后，镜检可看见从贴壁的组织块周围游离出的大量长梭形细胞，这时可用PBS溶液 (货号14190-144，GIBCO公司，以下所用PBS同)清洗去除组织块，采用质量体积比0. 25% 的胰蛋白酶溶液消化贴壁细胞，200g离心收集细胞，进行传代培养。等贴壁细胞长至90% 融合后，去除培养液，采用PBS溶液清洗，采用质量体积比0. 25%胰蛋白酶溶液消化，镜检等贴壁细胞收缩，胞间间隙变大时，加入含体积百分比10% FBS的LG-DMEM终止消化，轻轻吹打让细胞悬浮，200g离心收集细胞，采用血球计数板计数，调整细胞密度为1 X IO5个细胞 /孔(6孔板)，放置于37°C，5% CO2培养箱培养，每两天更换培养液。实施例2细胞形态学观察将脐带华尔通胶质组织块接种至M孔板培养10天后，逐渐可见到少量细胞从组织块中游离出来，贴壁生长，并不断增殖(图la)。在显微镜下观察，可见细胞形态呈现均一的长梭形，为典型的成纤维细胞的形态，成平行排列生长或漩涡状生长，随着集落生长的不断扩大而融合为单层贴壁细胞。常规传代培养，长满后可见细胞呈现漩涡状(图lb)。实施例3流式细胞术鉴定细胞表面抗原取正常培养的脐带间充质干细胞，流式细胞术检测细胞表面抗原的表达，包括 CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19 和 HLA-DR。(1)细胞长至80 90%融合后，采用质量体积比0. 25%胰蛋白酶溶液消化，离心收集细胞，PBS溶液清洗2次，调整细胞悬液浓度到IO6细胞/ml。(2)加入2ml含体积百分比为2. 5% FBS的PBS溶液，吸打混勻细胞，200g离心。(3)所用抗体包括 CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19 和 HLA-DR 的抗体， 非特异性背景以mouse anti IgGl/PE，mouse anti IgGl/FITC进行孵育作为对照。均按体积百分比1 50比例，用PBS溶液将抗体稀释后，冰上避光孵育40min。(4)孵育完成后，离心去上清，PBS溶液重悬洗去抗体，重复1次。(5)最后用500 μ 1 PBS溶液重悬细胞，采用流式细胞仪检测各组细胞的荧光值。利用流式细胞术分析脐带间充质干细胞的细胞表面抗原的表达，在分离获得的脐带间充质干细胞中，⑶44、⑶73、⑶90、⑶105的表达为阳性，而⑶14、⑶19、⑶34、CD45及 HLA-DR的表达基本上为阴性(图2)。这些表面抗原的表达结果与典型的间充质干细胞的表面抗原的表达是一致的。实施例4人脐带间充质干细胞多向分化能力鉴定(1)检测方法CN 102533659 A
取实施例1制备的传代培养的脐带间充质干细胞，按2X IO4细胞/孔的密度接种到M孔板内，等细胞长至60 70 %融合后，去除原来培养液，用PBS溶液清洗，加入成骨分化诱导培养液(基础培养基为LG-DMEM，含体积百分比10% FBS, 0. 216g/L NaHCO3,100U/ml 青霉素，100 μ g/ml链霉素，IOOnM地塞米松，IOmMβ -甘油磷酸钠，0. 2mM L-抗坏血酸盐)， 以后每3天更换一次成骨分化诱导培养液。诱导28天后，进行von-Kossa染色和碱性磷酸酶染色(ALP staining)的成骨分化鉴定。取实施例1制备的传代的人脐带间充质干细胞，按2X IO4细胞/孔的密度接种到 24孔板内，细胞长至60 70%融合后，去除原来培养液，PBS清洗，加入成脂分化诱导培养液(基础培养基为LG-DMEM，含体积百分比10% FBS，2mML_谷氨酰胺，100U/ml青霉素， 100 μ g/ml链霉素，60μ M茚甲新，1 μ M地塞米松，0. 5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤IBMX， 5 μ g/ml胰岛素)，以后每3天更换培养液一次，诱导21天后，进行Oil Red 0染色检测。取实施例1制备的传代的人脐带间充质干细胞，经胰酶消化后，转移Iml细胞悬液于15ml塑料离心管中，500g离心15分钟，使其形成细胞微团结构，小心吸掉上层培养液， 加入2ml软骨分化培养液(基础培养基为LG-DMEM，含体积百分比10% FBS, 2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，质量体积比1 %胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)，0. 1 μ M 地塞米松，50 μ g/mL 2-磷酸抗坏血酸，40 μ g/mL L-脯氨酸，100 μ g/mL丙酮酸钠，10ng/mL 转化生长因子β 1)，4天后首次换液，以后每隔2天换液，在21天后取出培养的细胞团块。 进行固定、包埋、切片。将切片进行亚甲基蓝染色，显微镜下观察并拍照。(2)检测结果间充质干细胞的一个重要的鉴定标准，就是间充质干细胞具有多向分化的能力。 人脐带间充质干细胞在成骨分化诱导培养液中诱导观天以后，通过von Kossa染色以及碱性磷酸酶(ALP)染色对分化的细胞进行成骨分化鉴定。图3(a)中的棕红色显色显示ALP 的染色结果，可见脐带间充质干细胞经成骨诱导分化后，胞质中呈现了碱性磷酸酶活性。图 4(a)中的黑色颗粒状小结是矿质沉淀经Von Kossa染色的结果。而对照组则均呈阴性(图 3(b)与图 4(b))。脐带间充质干细胞经成脂分化诱导培养液的诱导21天后，采用Oil Red O染色检测脂滴。人脐带间充质干细胞经过成脂诱导后，分化的细胞中出现细小的脂滴，呈现明显的阳性(图5(a))，而在未分化的细胞内，染色未见脂滴的存在(图5(b))。在软骨细胞分化诱导培养液中培养的细胞团约2天时与管壁分离形成球形结构， 并在培养过程中逐渐长大。培养21天后进行切片和亚甲基蓝染色观察，可见经诱导的人脐带间充质干细胞呈现均一异染，细胞外基质呈淡蓝色(图6(a))，说明经诱导后细胞分泌的基质中含有大量的酸性蛋白多糖，而对照组未着色(图6(b))。实施例5携带SF-I基因腺病毒的制备从小鼠睾丸间质瘤细胞(MLTC-1，中国科学院上海细胞所，上海，中国)中提取总 mRNA,通过反转录得到cDNA，用I^rimerSTAR高保真DNA聚合酶扩增SF-I基因(98°C，IOs ； 580C，20s ；72°C，1. 5min,反应30个循环)，回收SF-1的PCR产物，并将其磷酸化。扩增SF-1 基因的引物根据基因库号NM 139051的序列设计如下正向PCR 引物5，-ATTCTCCTTCCGTTCAGCGGACG-3，；反向PCR 引物5，-GGCTGATGGAGGAAGGAATGGT-3，。
将扩增得到的SF-1基因插入腺病毒的穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP内(见图7，Stratagene公司，加利福尼亚州，美国)，具体步骤如下首先用内切酶MlI消化 pAdtrack-CMV-EGFP载体，然后将线性化的载体末端补平并去磷酸化。将制备好的SF-I片段和pAdtrack-CMV-EGFP载体按照3 1的比例进行连接构建pAdtrack-CMV-SF-Ι质粒 (见图8)，连接产物转化大肠杆菌toplO (Tiangen公司，北京，中国)，并挑取单克隆。由于 SF-I片段和载体内各有一个EcoR I酶切位点，用EcoR I消化单克隆，正向连接的质粒将被切成2. 8kb和8. Okb的DNA片段，反向连接的产物将被切成7. Ikb和3. 3kb的DNA片段，从而可以通过EcoR I酶切筛选得到阳性克隆，再通过测序进行验证。将构建好的携带SF-I基因的穿梭质粒pAdtrack-CMV-SF-Ι与腺病毒载体质粒pAdEasy-Ι (见图9，Stratagene公司，加利福尼亚州，美国)共转染大肠杆菌 BJ5183 (Genmed公司，上海，中国)，两质粒在BJ5183细菌内会发生重组，从而得到携带SF-I 基因的腺病毒质粒pAd-sf-1。将得到的携带SF-I基因的腺病毒质粒pAd-SF-Ι用I^c I酶切线性化后，采用磷酸钙共沉淀法转染人胚肾细胞(AD-293细胞，NIH，MD，美国)，可以产生腺病毒，腺病毒的产生可根据EGFP的绿色荧光来确定。当表达绿色荧光的AD-293细胞越来越多，并出现细胞变圆，核变大，细胞脱板悬浮的情况下，吸打收集AD-293细胞，PBS溶液清洗，离心，只保留 200 μ 1 PBS, -80°C和37°C反复冻融三次，使细胞破壁，释放腺病毒，IOOOOg离心10分钟，上清液含制备的第一代腺病毒。将得到的腺病毒直接用于感染AD-293细胞，进行再一轮的扩增，以提高腺病毒的滴度。将AD-293细胞按2 X IO4细胞/孔的密度接种到M孔板内，待细胞长至50%融合后，更换新鲜高糖培养液(培养液成分为10% (ν/ν)胎牛血清(FBQ，2mML-谷氨酰胺， 216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的HG-DMEM培养液)，将需要测定滴度的腺病毒悬液从KT1到10_12，按10倍的梯度进行稀释，然后每个梯度取50 μ 1加到培养液中进行感染，每个梯度设3个重复孔。M小时后荧光显微镜下检查绿色荧光的表达情况。如果在10_7梯度的孔中计数得到绿色细胞为50个，则病毒的滴度计为101(l(PFU/ml)。研究结果从小鼠睾丸间质瘤细胞中提取总mRNA，通过反转录得到cDNA，采用PCR 扩增SF-I基因，回收PCR产物(如图10(a)所示)，跑胶结果显示PCR产物符合目标基因大小。将制备好的SF-I片段和pAdtrack-CMV-EGFP载体按照一定的比例进行连接，将连接产物转化toplO细菌，并挑取8个单克隆(如图10 (b)所示)。用EcoR I酶切消化验证连接产物(如图10 (c)所示)，正向连接的质粒将被切成2. Skb和8. Okb的DNA片段，反向连接的产物将被切成7. Ikb和3. 3kb的DNA片段。从酶切结果可以判断7号克隆为正向连接， 将7号克隆测序后发现该克隆DNA序列正确。将得到的pAdtrack-CMV-SF-Ι与pAdEasy-1 质粒采用电穿孔法共转染BJ5183，挑选重组质粒，重组质粒大小约为44Kb (如图10 (d)所示)，挑选2号质粒进行酶切转化AD-293细胞，以产生携带SF-I基因的腺病毒。实施例6采用携带SF-I基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞采用常规培养的实施例1制备得到的人脐带间充质干细胞，酶消化，离心收集，按 5 X IO5的密度接种到6孔板内，在培养箱培养过夜让细胞贴壁。第二天早上，更换为诱导培养液(基础培养基为DMEM/F12，含体积百分10%的FBS，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，500 μ M dbcAMP)，以MOI = 200的量将腺病毒加入到培养液中，轻摇动培养板使病毒分布均勻。以后每两天更换新鲜诱导培养液，诱导分化7天。
实施例7鉴定诱导分化的细胞的基因表达
采用携带SF-I基因的腺病毒感染人脐带间充质干细胞后的第7天，用Real-time RT-PCR检测类固醇合成相关基因的表达，包括P450SCC，17 β -HSD, LHR和3 β -HSD，引物及荧光探针如下
P450SCC-F 5' -GCGGGCTCCGGAAATTACTC-3’
P450SCC-R 5' -CTGGTAGATGGCATCAATGAATCG-3，
P450SCC-P 5' -(FAM)AGTGATGACCTGTTCCGCTTTGCCT(Eclipse)-3'
17 β -HSD-F 5，-TTAGTCAACAATGTCGGAATGCTTC-3，
17 β -HSD-R 5’ -ACTACGGAGGTGATGTTACAATGG-3 ’
17 β -HSD-P :5，-(FAM)CCCAAGCCATTTCCTGAACGCACCG(Eclipse)-3，
LHR-F :5，-CAATGTGAAAGCACAGTAAGGAAAG-3‘
LHR-R :5，-GGTGTCTTGGGTAAGCAGAAAC-3，
LHR-P :5，-(FAM)CCAGCCACTCAGTTCACTCTCAGCA(Eclipse)-3，
3 β -HSD-F 5’ -AAGCTAGTGTGCCAGTCTTCATC-3 ’
3 β -HSD-R 5’ -CGTTTTTCAGATTCCACCCGTTAG-3’
3 β -HSD-P :5，-(FAM)CGCCAGTACAGCCTTCTCAGCAAGC(Eclipse)-3，
反应扩增条件为
权利要求
1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于包含以下步骤(1)将核苷酸序列如SEQID N0:1所示的SF-I基因插入腺病毒的穿梭质粒 pAdtrack-CMV-EGFP的多克隆位点中，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-1 ；然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-Ι与腺病毒载体质粒pAdEasy-Ι共转染大肠杆菌BJ5183，得到携带 SF-I基因的腺病毒质粒pAd-SF-Ι ；将腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化，转染人胚肾细胞 AD-293后得到腺病毒；(2)采用MOI= 200的量，将步骤(1)制备得到的腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞；诱导培养液的组成为 基础培养基为DMEM/F12，含有体积百分比10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μ g/ml链霉素、500 μ M 二丁酰环磷酸腺苷。
2.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于步骤(1)中所述的腺病毒质粒pAd-SF-Ι单酶切线性化是通过I^c I酶切进行线性化。
3.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于步骤(1)中所述的转染为通过磷酸钙共沉淀法进行。
4.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于步骤O)中所述的人脐带间充质干细胞通过如下方法制备得到首先从正常的足月新生儿的人脐带中分离得到沃顿胶组织，将沃顿胶组织剪碎，用培养液培养，待从组织块游离出来的细胞长至80 90%融合时，用胰酶消化游离出来的细胞，进行细胞传代培养， 得到人脐带间充质干细胞；其中培养液为含有体积百分比10%的胎牛血清，5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，2mM L-谷氨酰胺，216 μ g/ml NaHCO3,100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素和1 μ g/ml两性霉素B的LG-DMEM培养液。
5.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于所述的人脐带间充质干细胞的细胞表面抗原分子为通过FACScan流式细胞仪进行检测，人脐带间充质干细胞不表达造血标志分子⑶14、⑶19、⑶34、⑶45和HLA-DR，而强表达间充质干细胞表面特异性抗原⑶44、⑶73、⑶90和⑶105 ；流式细胞的鉴定条件为细胞的密度不低于106/ml，采用mouse anti IgGl/PE和mouse anti IgGl/FITC作为同型对照;所述的人脐带间充质干细胞通过成骨分化，成脂和成软骨分化鉴定干细胞的分化能力，成脂分化用油红染色鉴定，成骨分化用碱性磷酸酶染色及Von kossa染色鉴定，成软骨分化用亚甲基蓝染色鉴定。
6.根据权利要求1所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法，其特征在于步骤O)中所述诱导分化的条件为用胰酶将人脐带间充质干细胞消化，离心收集， 按5X IO5细胞/孔的密度接种到6孔板，在培养箱培养过夜让细胞贴壁，接着更换诱导培养液，以MOI = 200的量将腺病毒加入到诱导培养液中，轻摇动培养板使病毒分布均勻，然后每两天更换新鲜诱导培养液；诱导分化7天。
7.权利要求1 6任一项所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法的应用，其特征在于所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法用于诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞。
8.一种睾丸间质细胞，通过权利要求1 6任一项所述的诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法得到。
9.一种睾酮，通过权利要求8所述的睾丸间质细胞分泌得到。
全文摘要
本发明公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用。该方法包括如下步骤首先将小鼠类固醇生成因子-1基因克隆入腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-EGFP，得到重组载体pAdtrack-CMV-SF-1；然后将重组载体pAdtrack-CMV-SF-1与腺病毒载体质粒pAdEasy-1重组，得到携带SF-1基因的腺病毒质粒pAd-SF-1；将腺病毒质粒pAd-SF-1单酶切线性化，经人胚肾细胞AD-293包装后得到腺病毒；再将该腺病毒加入到诱导培养液中感染人脐带间充质干细胞，将人脐带间充质干细胞诱导分化为睾丸间质细胞。经过本发明所述方法的诱导，人脐带间充质干细胞在体外可以分化为睾丸间质细胞，需时仅为1周，从而为采用细胞替代或者基因方法治疗睾酮缺乏症提供了重要的细胞来源。
文档编号C12N15/861GK102533659SQ20111043968
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年2月24日
发明者彭公峰, 魏星 申请人:暨南大学