专利名称：一种检测植物乳杆菌st-ⅲ的pcr检测方法及其引物和试剂盒的制作方法
一种检测植物乳杆菌ST-I I I的PCR检测方法及其引物和试剂盒技术领域
本发明属于生物检测领域，特别涉及一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的PCR检测方法及其引物和试剂盒。
背景技术：
益生菌是指当摄入一定数量，能以活菌状态到达胃肠道，通过调节肠道菌群组成， 对人体或动物健康起促进作用的单一或特定微生物的混合物。近年来，随着其益生作用的相继发现，益生菌制品的生产及销售量也呈逐年上升趋势。然而目前市场上对益生菌制品质量的监管和认证，尤其是在对其进行定性、定量检测和鉴定方面缺乏科学、合理、快速的方法，这导致菌种滥用，鱼目混珠的现象经常出现，使得产品质量良莠不齐，严重地阻碍了益生菌制品的发展。
随着科技的进步，分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点逐步替代传统的形态学和生理学检测方法，已成功介入到益生菌的鉴定领域。然而由于同种细菌不同菌株间的相似性超过99%，常用的分子生物学手段仍很难从菌株水平对益生菌进行区分。 伴随着高通量测序技术的快速发展，大量益生菌菌株的基因组图谱已被解析出来。这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为同种细菌不同菌株间的区分和鉴定奠定了基础。
在乳业发达的国家，都十分重视保护特有的益生菌菌株，如荷兰DSM公司、芬兰的维里奥公司等。他们对其筛选出的益生菌菌株都进行了分子标记并进行了专利保护。我国益生菌的研究起步较晚，少数筛选出来的优良的益生菌株也没有进行及时的专利保护，这为其将来的应用和发展埋下了隐患。
植物乳杆菌ST-III是一种从泡菜中分离得到的具有降胆固醇、降血脂、粘附肠道上皮细胞等多种功能的益生菌，其全基因组图谱已于2010年测定并公布。同时该菌株已作为生产发酵剂在光明乳业有限公司正式投产上市，市场反映良好。为了防止植物乳杆菌 ST-III菌株在未被授权的情况下被添加到其他益生菌产品当中，更好的保护该菌株的合理合法使用，从菌株水平对该菌株进行分子标记，寻找特异性的检测方法便显得尤为重要，迫在眉睫。发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前尚不存在植物乳杆菌ST-III菌株分子检测手段的现状，提供一种快速、特异性强、灵敏度高、成本低的植物乳杆菌ST-III菌株的分子生物学检测方法。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之一为一种植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) ST-III菌株的遗传标记分子，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因。
KilA结构域蛋白(KilA domain protein)是一类DNA结合蛋白。编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因的核苷酸序列较佳的是GenBank Accession No.为 YP_003924036. 1。优选的，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KiIA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个。更优选的，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸。所述的遗传标记分子最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 的第360位至第601位所示。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之二为一种检测植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) ST-III 菌株的引物对。
该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp ；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。该引物对的扩增片段为200-867bp，优选M2bp。优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如 SEQ ID N0. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID N0. 3所示。
本发明所述的特异性扩增植物乳杆菌ST-III菌株的引物，根据本发明的遗传标记物的序列(SEQ ID NO 1)进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得，例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之三为一种检测植物乳杆菌 ST-III菌株的试剂盒，该试剂盒包括所述的引物。其中，所述的引物如上所述。所述的试剂盒较佳的还包括dNTP，10XPCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。更佳的，所述的试剂盒还包括阳性对照或者基因抽提试剂。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之四为一种植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，包括如下步骤
1)提取待测样品菌株DNA ；
2)以步骤1)所得菌株DNA为模板，以本发明所述引物对进行PCR反应；
3)将步骤2)所得PCR反应产物进行电泳检测，具有本发明所述引物扩增出的片段的样品中存在植物乳杆菌ST-III菌株。
本发明中，步骤2)所述的PCR反应体系为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。 较佳的是，所述的PCR反应体系总体积为20-50 μ L，反应体系中包括0. 25mmol/L的上游引物，0. 25mmol/L 的下游引物，0. 2mmol/L 的 dNTP, IXPCR buffer, 1. Ommo 1/L 的 Mg2+, 0. 02U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶，1. 0-2. Ong/ μ L 的 DNA 模板。
步骤2)所述的PCR反应程序为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。较佳的为 95°C，5min ；40 个循环(95°C，40S ；58°C，30S ；72°C，30S) ；72°C，8min ；4°C保存。
步骤幻所述电泳为本领域常规，可以是琼脂糖凝胶电泳或者是聚丙烯酰胺凝胶电泳，较佳的是琼脂糖凝胶电泳，优选琼脂糖凝胶电泳。按本领域常规方法，将凝胶电泳产物在一定条件下成像，即可判断结果。比如在紫外凝胶成像仪下拍照成像。采用序列如SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 3所示引物的PCR反应产物，若有M2bp核酸片段，则说明待测样品中存在植物乳杆菌ST-III菌株。若不存在 2bp的核酸片段，则说明待测样品中不存在植物乳杆菌ST-III。与本领域常规一样，可与对照DNA标准品比较而得DNA片段的长
本发明的待测样品为任何可能含有植物乳杆菌ST-III菌株的物质，较佳的比如益生菌类发酵乳制品。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
本发明中，植物乳杆菌ST-III是现有技术，为CGMCC No. 0847。
本发明提供了一种特异性检测植物乳杆菌ST-III菌株的引物及通过该引物快速检测植物乳杆菌ST-III菌株的方法，具有如下优点
1、检测速度快、特异性强
对于微生物的普通生化鉴定一般需要2-3天，PCR鉴定只需要2_3小时；且普通生化鉴定无法鉴定同种植物乳杆菌之间的不同菌株，本发明设计的PCR引物对根据编码植物乳杆菌ST-III菌株的KilA结构域蛋白基因的特异性标志片段设计，该引物对可以在植物乳杆菌ST-III菌株中扩增出相应的DNA片段，并且只特异性的扩增植物乳杆菌ST-III的基因，而不能在其他相关植物乳杆菌中扩增出相应片段，包括NCBI已报道的经过全基因组测序的三种植物乳杆菌菌株，说明以该基因片段为基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。
2、灵敏度高、成本低
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克级的起始待测模板扩增到微克水平，即使待测样品中只含有3个目标细菌，PCR也可以检出，因此灵敏度高。普通生化鉴定方法所用试剂种类多，步骤复杂，而PCR鉴定试剂种类少，操作简单，成本较低。此外，与通过全基因组序列测序区分同类细菌间不同菌株的方法相比，费用大为降低、实验周期也大为缩短，可以很方便地投入实际应用。
以下结合
本发明的特征和有益效果。
图1为植物乳杆菌ST-III菌株的引物特异性验证图，其中，M为分子量标记 DL2000Maker ；Lanel 为 L. ρlantarum ST-III，作为阳性对照；Lane2 为无菌 H20，作为阴性 X^tM ； Lane3 为 L. ρ lantarum 14917 ； Lane4 为 L. ρ lantarum 1. 2437 ；Lane5 为 L. ρ lantarum WCFSl ；Lane 6 为 L. plantarum P8 ；Lane7 为 L. casei ATCC393 ；Lane8 为 L. casei ATCC334 ； Lane9 为 L. caseiLC2ff ；LanelO.为 L.rhamnosus 1. 12 ；Lanell 为 L. acidophilus ATCC 4356 ；Lanel2 为 L.fermentum 1. 1880 ；Lanel3 为 L.delbrueckii subsp.bulgaricus ATCCl1842 ；Lanel4 为 L. helveticus CGMCC 1. 1877；Lanel5 为 L.gasseri ATCC33323 ； Lane16 为 L. johnsonii ATCC 33200。
图2为益生菌乳制品中是否含有植物乳杆菌ST-III菌株的定性检测结果，其中， M为分子量标记DL2000 Marker ；Lanel为L. plantarum ST-III纯培养物，作为阳性对照； Lane2为无菌H2O,作为阴性对照；Lane3为光明乳业所产添加了植物乳杆菌ST-III的酸奶； Lane4-9为市售益生菌乳制品。
具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究，从植物乳杆菌ST-III (lactobacillus5plantarum ST-III)的KilA结构域蛋白基因中发现较合适的扩增序列。其中，KilA结构域蛋白为一类DNA结合蛋白。该蛋白对于为DNA复制、重组和修复至关重要。选择KilA结构域蛋白基因序列作为引物，具有很好的特征性。
本发明根据NCBI已报道的三株植物乳杆菌LactcAaciIlus plant arumffCF S 1 (Genebank number :AL935263. 1) , Lactobacillus ρ 1 antarum14917(Geηebank number ACGZ00000000) , Lactobacillus plantarumJDMl (Genebank number :CP001617. 1)的全基因组序列，运用 blast 程序找出 ST-III所独有的核苷酸序列，根据这些核苷酸序列设计相应引物。经过对这些引物的筛选和验证，得到了能够用于鉴定植物乳杆菌ST-III的特异性引物。本发明一并提供了使用该引物的检测试剂盒和检测方法。本发明对植物乳杆菌ST-III的检测具有快速、特异性强、 灵敏度高、成本较低的特点。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1益生菌乳制品中植物乳杆菌ST-III的快速定性鉴定
当前市场上发酵类饮品玲琅满目，作为植物乳杆菌ST-III菌株相关系列产品的权利人，有必要鉴定这些发酵产品中是否含有具有强大益生功效的植物乳杆菌ST-III，从而防止假冒，保障消费者的合法权益。
a.模板DNA的制备。采用液氮冻融-CTAB法抽提样品DNA，具体步骤如下
(1)取l.Og益生菌发酵乳制品或ST-III的纯培养物于10. OmL离心管中，加入 3. OmL DNA 提取液(100mmol/L Tris-HCl ； 100mmol/L EDTA ； IOOmmo 1/L Na3P04,1. 5mol/L NaCia% CTAB, pH8. 0)混合均勻，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化 (约5min)，反复冻融3次；
(2)力口 0. 5mL 10% SDS 禾口 10. 0 μ L 10mg/mL 蛋白酶 K，37°C恒温摇床中 200r/min 摇动4h ；
(3)加入等体积的苯酚氯仿异戊醇(25 24 1)混勻，8000rpm离心IOmin, 溶液明显分为三层，上层为水相，中间为固相，下层为有机相；
(4)吸取上清液，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇05 24 1)再抽提一次；
(5)向上清液中加入0. 1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，静置 30min,8000rpm 离心 5min 以沉淀总 DNA。
(6)用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温下自然干燥DNA，加入50 μ L无菌超纯水回溶，-20°C保存备用。
b. PCR 扩增
(1)检测植物乳杆菌ST-III菌株所用的特异性引物序列如下
SEQ ID No. 2 5' -TTTCGAGTTTGCTTCCTGGGTAT-3，
SEQ ID No. 3 5' -GTGCCATGTTTAATCTATCTGCTTCAC-3，。
O) PCR反应体系
以上述提取的基因组DNA为模板，反应体系25. OyL的组成为10XPCRBuffer 2. 5μ L,25mmol/L Mg2+L 0 μ L, 2. 5mmol/L dNTPs 2 μ L，5mmol/L 上下游引物(SEQ ID No. 2CN 102533790 A和 SEQ ID No. 3)共 2. 5 μ L，50ng/ μ L DNA 模板 1. 0 μ L，5U/ μ L Taq 酶 0. 25uL, dd H20 补足至 25. 0 μ L0
(3) PCR反应程序
95°C预变性 5min ；95°C变性 40S，58°C退火 30S，72°C延伸 30S，循环 40 次；72°C延伸8min，4°C保存。
c.琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物于0.8%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳 20min, EB染色，紫外拍照。
d.结果及判断
经植物乳杆菌ST-III特异性弓I物PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检验结果见图2，含有ST-III的检验样本出现预期特征条带，其他不含ST-III样本未出现预期特征条带。结果说明引物特异性好，与预期结果一致。
实施例2特异性验证
选择不同的植物乳杆菌菌株50株，其他种乳杆菌100株，利用本发明所提供的引物序列对进行PCR反应，之后依据琼脂糖凝胶电泳图谱分析，简便、快速、准确地定性检测益生菌乳制品中是否含有植物乳杆菌ST-III菌株。部分结果见图1。实验结果表明本发明所提供的引物仅能扩增出ST-III，而对其他菌株均无相应扩增。具体地，方法包括如下步骤
1.基因组DNA的提取
采用液氮冻融-CTAB法抽提样品中益生菌样品总DNA和纯培养乳酸菌(植物乳杆菌ST-III)的总DNA，具体步骤如下
取适量乳制品或MRS培养基培养的乳酸菌于10. OmL离心管中，加3倍体积DNA提取液(100mmol/L Tris-HCl, 1 OOmmo 1/L EDTA, 1 OOmmol/LNa3P04,1. 5mol/L NaCl, 1%CTAB, pH8. 0)混合均勻，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65°C水浴中融化(约5min)，反复冻融3次，加0. 5mL10% SDS和10. 0 μ L 10mg/mL蛋白酶K，于37°C恒温摇床中200r/min摇动4h，加入等体积的酚氯仿异戊醇05 24 1)混勻，8000rpm离心lOmin，吸取上清液转移至另一离心管中再抽提1次，经0. 1倍体积的醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇沉淀总 DNA，然后用70%乙醇洗涤沉淀2次，溶解备用。
2. PCR 扩增
(1)用特异引物序列对SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3对各样品DNA模板进行扩增；
O) PCR反应体系
反应采用25. OyL 体系10 X PCR Buffer 2. 5 μ L, 25mmol/L Mg2+L O μ L, 2. 5mmol/L dNTPs 2 μ L, 5mmol/L 上下游引物(SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 3)共 2. 5 μ L， 50ng/ μ L DNA 模板 1· O μ L，5U/ μ L Taq 酶 0. 25uL, dd H2O 补足至 25. O μ L。
(3) PCR反应参数
95°C预变性 5min ；95°C变性 40S，58°C退火 30S，72°C延伸 30S，循环 40 次；72°C延伸8min，4°C保存。
3.琼脂糖凝胶电泳
将PCR产物于0. 8%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20min，EB染色，紫外拍照。检验过程中分别设阳性对照、阴性对照。以植物乳杆菌ST-III纯培养物为阳性对照，以无菌H2O作为阴性对照。
4.结果及判断
样本经菌株特异性引物扩增后，检验样本出现预期特征条带时，报告相应菌种为阳性；检验样本未出现预期特征条带时，报告相应菌种为阴性。即若在M2bp处检测到扩增条带说明此样品中含植物乳杆菌ST-III。若没检测到相应的条带，说明此样品中不含植物乳杆菌ST-III。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明所述引物作各种非实验必需的修饰和改动，如增加或减少若干个碱基，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum) ST-III菌株的遗传标记分子，其特征在于，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白的基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的242-867个。
2.如权利要求1所述的遗传标记分子，其特征在于，所述的遗传标记分子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第360位至第601位所示。
3.一种检测植物乳杆菌(LactcAacillus plantarum) ST-III菌株的引物对，其特征在于，该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp ；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，该引物对的扩增片段为200-867bp。
4.如权利要求3所述的引物，其特征在于，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQID NO. 2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO. 3所示。
5.一种检测植物乳杆菌ST-III菌株的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求 3或4所述的引物。
6.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTP，10XPCR缓冲液和Taq DNA聚合酶。
7.一种植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在于，包括如下步骤1)提取待测样品菌株DNA;2)以步骤1)所得菌株DNA为模板，以权利要求3或4所述引物对进行PCR反应；3)将步骤2)所得PCR反应产物进行电泳检测，具有权利要求3或4所述引物扩增出的片段的样品中存在植物乳杆菌ST-III菌株。
8.如权利要求7所述的植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在于，步骤2)所述的PCR反应体系中包括0. 25mmol/L的上游引物，0. 25mmol/L的下游引物，0. 2mmol/L的 dNTP, IXPCR buffer, 1. Ommo 1/L 的 Mg2+, 0. 02U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶，1. 0-2. Ong/μ L 的 DNA模板。
9.如权利要求7所述的植物乳杆菌ST-III菌株的检测方法，其特征在于，步骤2)所述的 PCR 反应程序为95°C，5min ；40 个循环 95°C 40S, 58°C 30S, 72°C 30S ；72°C，8min ；4°C保存。
10.如权利要求1所述的遗传标记分子作为植物乳杆菌ST-III菌株的特征序列在检测植物乳杆菌ST-III菌株中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测植物乳杆菌ST-III的PCR检测方法及其引物和试剂盒。本发明提供ST-III菌株的遗传标记分子，其是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白的基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的242-867个。本发明作为植物乳杆菌ST-III菌株的分子检测方法，可以用于在益生菌类乳制品中快速检测其中是否存在植物乳杆菌ST-III菌株。具有灵敏度高、特异性强、检测成本低等优点，可以很方便地将植物乳杆菌ST-III菌株与同种植物乳杆菌中其它不同菌株区分开来，有很强的实际应用价值。
文档编号C12N15/31GK102533790SQ20111043917
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者任婧, 周方方, 艾连中, 陈臣 申请人:光明乳业股份有限公司