专利名称：利用赤霉菌ca3-1转化3-氰基吡啶为烟酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及利用一株赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1转化3-氰基吡啶为烟酸的方法。
背景技术：
烟酸即3-吡啶甲酸，又名尼克丁酸，白色无味晶体，无毒，微溶于水，易溶于有机溶剂，是一种结构简单、理化性质稳定的维生素。烟酸作为人体和动物所必须的化学物质， 参与组织的氧化还原过程，具有促进细胞新陈代谢和扩张血管等功能。烟酸也是一种重要的医药原料和化工中间体，现在已被广泛用作食品添加剂、饲料添加剂、医药中间体、活性染料等。随着经济的发展和人们生活水平的提高，我国对烟酸的需求越来越多，而目前国内仍处于一个供不应求的阶段，因此烟酸的生产大有可为。目前已有的用于工业生产烟酸的方法全部采用化学法，如试剂氧化法、氨氧化法以及气相氧化法等。这些方法均需要高温高压、设备投资大，多数化学氧化剂价格昂贵、反应选择性差、收率低、三废污染严重，后期产品回收纯化需加入大量酸、工艺发杂繁琐、对环境不友好。近些年来，随着生物技术的迅猛发展，生物转化法由于具备反应条件温和，安全低耗易操作、转化率高且环境友好等特点而吸引了众多国内外研究者。具相关文献报道， 国外已有几株菌具备转化3-氰基吡啶为烟酸的能力，如细菌Miodococcussp. NDB1165, Nocardia globerula NHB-2，真菌 Aspergillus niger K10，但其底物浓度都较低，生物量和发酵周期也不占优势。因此，筛选一株高效腈水解酶菌株，通过高效、绿色环保的微生物转化或微生物催化法生产烟酸显得十分必要。本发明所涉及的菌株赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1用于生产烟酸还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有烟酸生产方法中的技术难点及存在的问题，提供一种利用赤霉菌CA3-1菌株转化3-氰基吡啶为烟酸的方法，该方法具有耐高浓度底物、转化效率高、半衰期长等特点。另外，该菌株有广域的底物谱，可用于转化多种单腈及双腈类化合物。因此，该菌株是极具开发研究价值的烟酸生产菌株，该菌株为赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-l，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为 CGMCC No. 4903，保藏日期为2011年5月24日。本发明提供的赤霉菌CA3-1可高效转化腈类化合物为羧酸，并重点对此真菌腈水解酶转化3-氰基吡啶为烟酸进行了相关研究。应用上述微生物转化3-氰基吡啶生产烟酸的方法，其步骤如下(1)采用保藏号为CGMCC No. 4903的赤霉菌CA3-1为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到查氏培养基上；(2)制备赤霉菌的细胞液体培养物挑取步骤(1)的查氏固体培养基上的赤霉菌一环，接种于已灭菌的装有20-60mL种子培养基的250mL锥形瓶中，培养温度为25_40°C，置摇床上以120-200r/min的转速培养20_24h至对数生长中期，即得到菌株的细胞液体培养物；(3)制备赤霉菌的静息细胞悬液将步骤( 中制备好的细胞液体培养物以2-4% (w/w)的接种量接入发酵培养基，装液量为250mL锥形瓶中装20_60mL发酵培养基，培养温度为25-40°C，在120-200r/min的转速下培养48h，得发酵液。发酵液在lOOOOr/min转速下离心5min，弃上清，菌体经磷酸缓冲液(0. ΙΜ,ρΗ 7. 2)洗涤三次后再用此缓冲液悬浮，制备成菌浓为lg/L的静息细胞悬液。(4)生物转化取适量(3)中所述的静息细胞悬液，加入溶于磷酸缓冲液(0. ΙΜ,ρΗ 7. 2)的3-氰基吡啶至终浓度为50mM，30°C、200r/min条件下转化30min后，再加入100 μ L 4Μ HCl使腈水解酶失活而终止反应。(5)产物检测将步骤的转化液在8000-12000r/min下离心3_5min，上清经适当稀释后用0. 22 μ m的水膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析3-氰基吡啶和烟酸的含量，并计算比酶活。其中步骤⑴中所述的查氏培养基的成分及配比为NaNO3 3_5g/L;蔗糖 30-100g/L ；K2HPO4 l-2g/L ；MgSO4 7H20 0. 1-0. 5g/L ；KCl 0. 1-0. 5g/L ；FeSO4 0. 001-0. Ig/ L;琼脂20g/L;pH自然，补充蒸馏水至1L，121°C下高压蒸汽灭菌20min;步骤( 所述种子培养基的成分及配比为葡萄糖10-30g/L ；酵母粉5-15g/L ；NaCl 0. 5_2g/L ；KH2PO4 3H20 1-5. Og/L ；MgSO4 0. 01-2g/L ；FeSO4 · 7H20 0. 01-0. 3g/L ；补充蒸馏水至 1L，灭菌前调培养基的PH至6. 8-7.6，1211下高压蒸汽灭菌201^11;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为葡萄糖 20-60g/L ；酵母粉 10-30g/L ；蛋白胨 10_30g/L ；NaCl 0. 2_2g/L ；K2HPO4 · 3H20 0. 1-1. Og/L ；己内酰胺 2. 26g/LMgS04 0. 1-lg/L ；FeSO4 ·7 H2O 0. 01-0. 10g/L ；pH 7. 0-7. 5， 121°C高压蒸汽下灭菌20min。本发明所述的赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1首次发现可转化3_氰基吡啶生成烟酸，并且具有耐高浓度底物、转化效率高、半衰期长和广域底物谱等特点，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
图1为本发明的赤霉菌CA3-1转化3-氰基吡啶为烟酸的转化过程研究。图2为本发明的赤霉菌CA3-1的耐热性研究。
具体实施例方式实施例1利用赤霉菌CA3-1转化3-氰基吡啶合成烟酸(1)制备赤霉菌的细胞液体培养物挑取固体查氏培养基上的赤霉菌菌株一环，接种在装有30mL种子培养基的250mL 锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以200r/min的转速培养20_24h至对数期，即制得菌株的细胞液体培养物。(2)发酵培养基的成分及配比为碳源50-100g/L ；有机氮源 10_30g/L ；NH4Cl 20_30g/L ;K2HP04 0. 1-1. 0g/L ；MgSO4 0. 1-lg/L ；CuCl2 0. 01-0. lg/L ；ZnSO4 0. 01-0. 10g/L ；MnSO4 0. 01-0. 10g/L ；FeSO4 ‘ 7H200. 01-0. 10g/L ；pH 6. 5-7. 5，121°C高压蒸汽下灭菌20min。所述的碳源选自葡萄糖，蔗糖，麦芽糖的一种或两种；所述的有机氮源选白玉米浆，蛋白胨，酵母粉中的一种或两种。(3)制备赤霉菌的静息细胞悬液将步骤( 中制备好的细胞液体培养物以2-4% (w/w)的接种量接入发酵培养基， 装液量为20-60m/250mL，于25_40°C，120-200r/min的转速下培养48h，收获菌体。发酵液在lOOOOr/min转速下离心5min，弃上清，菌体经磷酸缓冲液(0. ΙΜ,ρΗ 7. 2)洗涤三次后再用此缓冲液悬浮，制备成菌浓为lg/L的静息细胞悬液。(4)生物转化取适量(3)中所述的静息细胞悬液，加入溶于磷酸缓冲液(0. ΙΜ,ρΗ 7. 2)的3_氰基吡啶至终浓度为50mM，30°C、200r/min条件下转化IOmin后，再加入100 μ L 4Μ HCl使腈水解酶失活而终止反应。(5)产物检测转化液于lOOOOr/min的转速下离心3min，上清经0. 22 μ m的水膜除杂后用高效液相色谱法检测3-氰基吡啶和烟酸的浓度。比酶活定义为在最适反应条件下，每min形成 ΙμΜ的产物所需要的酶。实施例2赤霉菌CA3-1热稳定性研究取适量静息细胞悬液，分别置于30°C、40°C、5(TC水浴锅中温浴，定时取样，按实施例1中所述的方法转化3-氰基吡啶，采用HPLC法跟踪检测底物的消耗和产物的生成情况， 分别与初始酶活相比来计算相对酶活，以残余酶活的对数(InRA)对时间作图，其斜率KD_t 即代表酶活的损失速度，结果见图2。实施例3赤霉菌CA3-1的底物谱研究取适量赤霉菌的静息细胞，分别加入不同的腈类化合物(终浓度20mM)，按实施例2中的方法进行转化，HPLC法检测底物和产物的浓度，计算相对酶活和转化率，结果见下表。表 1
底物比酶活(U/mg'min)相对酶活(％)转化率(％)
2-氰基吡啶0.0295.36.5
3-氰基吡啶0.54910093.5
4-氰基吡啶0.16930.838.1 2-氰基吡嗪 0.046 8.4 10.4
苯乙腈0.19535.644.0
对甲氧基苯乙腈0.0203.64.4
扁桃腈0.0132.43.0
甘氨腈0.26949.060.6
乙腈0.08114.718.1
丙烯腈0.32559.273.1
正戊腈0.44080.189.0
权利要求
1.利用赤霉菌(Gibberella intermedia) CA3-1转化3_氰基吡啶的方法，其特征为 250mL三角瓶装20-50mL的发酵培养基，接种量按体积比为4_8 %，培养温度25-30 V，摇床转速180-220r/min，培养48h ；发酵液于lOOOOr/min转速下离心5min，弃上清，菌体用 0. 1M、pH 7. 2的磷酸缓冲液洗涤三次后再用此缓冲液悬浮，加入3-氰基吡啶至终浓度为 50mM，于3(TC、200r/min转速下转化30min ；所用发酵培养基组成如下葡萄糖20_60g/L， 酵母粉 10_30g/L，蛋白胨 10-30g/L，NaCl 0. 2_2g/L，K2HPO4 · 3H20 0. 1-1. Og/L，己内酰胺 2. 26g/L, MgSO4 0. 1-lg/L, FeSO4 · 7H20 0. 01-0. lOg/L, pH 7. 0-7. 5，121 °C高压蒸汽下灭菌 20mino
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体涉及利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1转化3-氰基吡啶为烟酸的方法，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.4903。该菌株能在底物浓度为5.2g/L(50mM)的条件下转化3-氰基吡啶为烟酸，底物转化率高达98％；在最适反应温度30℃条件下，半衰期长达231.1h；菌株CA3-1的腈水解酶有广域的底物谱，能转化多种单腈和双腈类化合物。
文档编号C12R1/645GK102492750SQ20111043875
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者史劲松, 吴燕, 朱小燕, 李会, 李恒, 许正宏, 陆震鸣, 龚劲松 申请人:江南大学