专利名称：人PON2基因多态性(rs12026)检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定单核苷酸多态性的方法。更具体地，本发明涉及鉴定人P0N2基因多态性rsl2026的方法。
背景技术：
SNP(单核苷酸多态性)是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基的置换、插入和缺失等形式。SNP现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析、关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆。聚合酶链式反应-限制性片断长度多态 (PCR-RFLP)技术是一种快速、简便、准确、低成本检测SNP基因型的经典方法。该方法原理是限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4 6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定DNA等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的替换或插入、缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切割后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。该方法主要优点在于操作简便，快速，终点判断准确。主要缺点在于酶切位点的选择，并不是所有的SNP 位点都可以使用该方法来鉴别，且部分内切酶价格昂贵。对氧磷酶(paraoxonase，PON)是由肝脏合成的一类与高密度脂蛋白结合的芳香醇。早在1953年就被发现，因其能水解神经毒杀虫剂对氧磷(paraoxon)而被命名为对氧磷酶。目前发现哺乳动物对氧磷酶基因家族有3个成员P0N1、P0N2和P0N3，它们具有结构同源性和相似的酶活性。这三个基因具有高度结构同源性，在氨基酸水平和核苷酸的水平上分别有大约65%和70%的同一性。人P0N2基因位于7号染色体，该基因第5外显子多态即C/G碱基变异可引起第 148位氨基酸变异(Gly/Ala)，常记为G148A多态，该多态可能影响P0N2的功能。美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)可查阅 P0N2基因及其多态序列和相关信息，该多态在SNP数据库中编号为rsl2026。因此，通常该多态在人群中存在三种P0N2基因的基因型GG型(人体基因组rsl2(^6多态位点的两个等位基因碱基均为G)，CG型(人体基因组rsl2026多态位点的两个等位基因碱基分别为C 和G)和CC型(人体基因组rsl2(^6多态位点的两个等位基因碱基均为C)。目前人P0N2基因多态rsl2026的鉴定常采用PCR-RFLP方法。目前鉴定人P0N2 基因多态rsl2(^6时常使用内切酶i^nU4H I进行鉴定，，该内切酶的价格昂贵(关于部分内切酶的参考价格可以参考后面的表1)，影响了实验的费用，难以在实验室中普及使用。并且由于传统PCR-RFLP方法的固有缺陷，本领域技术人员通常难以选择其他限制性内切酶对人P0N2基因多态rsl2(^6进行鉴定。
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因此，本领域存在对操作简」 求。
i，成本低，使用范围广的新型检测SNP的方法的需
发明内容
本发明提供了一种操作简单，成本低，使用范围广的鉴定人P0N2基因多态性 rsl2026的方法，其包括以下步骤a)提供待测人基因组DNA ；b)使用扩增人P0N2基因多态性rsl2(^6位点附近序列的正向引物和反向引物，以所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；c)使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获得酶切产物；以及d)对所述酶切产物进行电泳，以鉴定人P0N2基因多态性rsl2026，其中，所述反向引物3’末端与多态位点相邻，反向引物中与多态位点下游第四个碱基A相配的碱基由原始序列中的T更改为错配后的碱基G，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成GAGAC结构， 错配后原序列CAGAA或GAGAA更改为CAGAC或GAGAC (其中第一个碱基为rsl2(^6多态，第五个碱基为引物中错配碱基G所配对的碱基C)，其中当多态等位基因为G时形成GAGAC序列(与GTCTC互补)可被识别该序列的内切酶BsmAI或Alw26I识别，进而，可以根据片段切开情况来判断多态基因型，更具体地，经序列分析和文献查阅可知，原有检测该C/G多态的方法可使用表1中前四种内切酶，如通过碱基错配PCR将多态位点后面第四位碱基A替换为C，则该多态可由BsmAI内切酶及其同裂酶(isoschizomer，来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶)识别，即G等位基因可被BsmAI内切酶及其同裂酶识别并切开，而C等位基因不能切开。下表1中提供了 NEB公司内切酶价格信息(从http://WWW. neb-china, com获取) 作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。表INEB公司几种内切酶识别序列及其价格
内切酶识别序列价格HpyAVccttcn6a3,339 元/500uFnu4HIgcangc2,789 元/1000 uApeKIgacwgc1250 元/1000 uTseIgacwgc3079 元/3 75 uBsmAIGTCTCNa679 元/1000 u 在本发明的一个实施方案中，正向引物由选自下列的核苷酸序列构成SEQ ID NO :1 (AGGTCCCGTAGTTATGTCTTGT)、SEQ NO 7 (TGCCCAGAGGTCCCGTAG)禾口 SEQ NO: 12 (GTCCCGTAGTTATGTCTTGTAAA)，在本发明的另一个实施方案中，反向引物由选自下列的核苷酸序列构成SEQ ID NO 2 (TCAGATGCAACAGAGAATTGTCT)、SEQ ID NO 8 (TTCAGATGCAACAGAGAATTGTCT)和 SEQ NO 13 (CAGATGCAACAGAGAATTGTCT)，正向和反向引物的设计主要考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度和扩增效率的影响。通常按照碱基互补配对原则设计引物，引物与模板的序列要紧密互补。长度为15-30bp，过短或过长可导致特异性差，过长亦会导致其延伸温度大于74°C而不利于PCR反应。反向引物的确定必须除了上述原则外其3’端必须含有与多态位点下游第四个碱基A相配对的错配碱基G，以便在扩增产物中与多态G等位基因形成GAGAC结构，利于BsmAI内切酶及其同裂酶进行酶切鉴定。扩增产物的长度主要是由正向引物所决定的(因为反向引物位于多态位点下游附近， 其位置大致已确定)，通常扩增产物长度为100-200bp之间，这样即利于PCR产物扩增，又利于后续的酶切鉴定。否则，如果产物过短则不利于扩增，过长则酶切后片段长度差异较小， 不利于分辨。例如，在本发明的一个实施方案中，利用SEQ ID NO :1的核苷酸序列作为正向引物以及SEQ ID NO :2的核苷酸序列作为反向引物的PCR反应可以获得如下扩增产物aRRtcccRta RttatRtctt Rtaaattaac tctgttcttt caattcttta gatgacacag 60tttatctctt tgttgtaaac cacccagaat tcaagaatac agtggaaatt tttaaatttg 120a a g a a g s a r a caattctctR ttRcatctRa 150(SEQ ID NO :4)扩增后产物序列中下划线部分分别为正向、反向引物所对应的序列，127bp处s代表C/G多态即SNP位点rsl2026。该扩增产物长度为150bp JSBsmAI酶切后可出现150bp、 121bpJ9bp三种片断(其中^bp在电泳图中不能看到)。酶切后基因型判断GG型为 121bp, CG型有121bp和150bp两种片段，CC型为150bp。对于酶切产物的鉴定，通常使用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，基于成本和便利性考虑，使用琼脂糖凝胶电泳更为常见。在本发明中，对于上述150bp的扩增产物，琼脂糖凝胶电泳的条件是将酶切产物在2. 5% -4%琼脂糖凝胶中3-8V/cm条件下，电泳 40-80分钟，于紫外灯下拍照鉴定。在本发明的另一个优选实施方案中，所述限制性内切酶选自BsmAI、Alw26I以及它们的同裂酶，更优选所述限制性内切酶为BsmAI、AlW26I。这主要是基于成本和切割效率的综合考虑。在本发明中，PCR扩增反应的条件并不受到特别的限制，只要能够获得扩增产物即可。PCR的主要参数-退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶序列的长度。如果PCR退火温度过低则易出现非特异产物，过高则影响扩增产物产量，最终需要凭实验确定。PCR延伸时间根据产物长度确定，通常20s-60s即可。为了能够提高PCR扩增效率，进而进一步提高鉴定效率，在本发明的一个优选实施方式中，所采用的PCR扩增条件是95度预变性3分钟后；进行30个如下循环扩增95度变性30秒，56度退火30秒， 72度延伸30秒；30个循环结束后72度延伸5min ；对于待测DNA的选择，本发明并没有特别的限制。既可以是从人体的体液或者组织获得基因组DNA，还可以是经过预先降解处理的基因组。为了方便实施，通常优选从血液提取的基因组DNA。其中所述的组织包括人体中含有全部或至少P0N2基因的组织，而与是否表达该P0N2基因无关。从体液和/或组织中提取DNA的方法是本领域技术人员公知的， 并且可以参考常用的分子生物学手册，例如《分子克隆》第2版进行。另外，在本发明还提供了用于鉴定人P0N2基因多态性rsl2(^6的试剂盒，其包含扩增人P0N2基因多态性rsl2026正向引物和反向引物，反向引物3’末端与多态位点相邻， 反向引物中与多态位点下游第四个碱基A相配的碱基由原始序列中的T更改为错配后的碱基G，错配后原序列CAGAA或GAGAA更改为CAGAC或GAGAC (其中第一个碱基为rsl2(^6 多态，第五个碱基为引物中错配碱基G所配对的碱基C)，其中当多态等位基因为G时形成 GAGAC序列(与GTCTC互补)可被识别该序列的内切酶BsmAI或Alw26I识别。如前所述， 该试剂盒操作简单，成本低，使用范围广。在本发明的另一个实施方案中，所述试剂盒中还包括BsmAI、Alw26I等限制性内切酶以及它们的同裂酶，这样可以方便对扩增产物的检测。进一步，优选所述限制性内切酶是BsmAI、AlW26I。这主要是基于限制性内切酶的成本和切割效率的综合考虑。当然，本领域技术人员可以理解，在试剂盒中还可以包括其他成分，例如用于实施鉴定的说明书等。
四
图1描述了实施例1中人P0N2基因(rsl2(^6)多态PCR产物经BsmAI酶切后电泳照片。其中M是DNA分子量标志物；泳道1 :CC型样品的电泳结果；泳道2和3 =CG型的电泳结果；泳道4 =GG型样品的电泳结果。
五具体实施例方式下面通过本发明的具体实施方式
对本发明的技术方案进行详细描述。其中，需要说明的是，本发明并不以任何方式受限于下面所述的具体实施方式
和实施例。下面利用SEQ ID NO=I的核苷酸序列作为正向引物以及SEQ ID NO 2的核苷酸序列作为反向引物作为例子，对本发明的概念进行详细地描述。在本发明一个实施方案中，本发明检测人P0N2基因多态rsl2026的方法，步骤是(一 )、提取待测人基因组DNA为模板，所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人基因组DNA ；(二)、PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序列的PCR产物(三)、对PCR扩增产物使用限制性内切酶进行酶切反应，得酶切产物；以及(四)、对酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定人P0N2基因多态rsl2026。下面对各个主要步骤进行详细描述(1)引物设计与合成在美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心http://www.ncbi. nlm. nih. gov网站查找P0N2基因序列和SNP信息，确定P0N2多态位点碱基变异数据；含P0N2多态rsl2(^6的部分基因序列(601bp)(SEQ ID NO 3)gaattctgta tatggagtag gaaacacttt cttaaaggtc agggagccaa tgatcagaaa 60taacaccaga cggacagcaa taggaaagac agagaatgat ctgttaggtc gtctaacagc 120ttatacattc aacctttcct tgcctgtggt atttaaatgt cagtgcctgc ccagaggtcc 180
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cgtagttatg tcttgtaaat taactctgtt ctttcaattc tttagatgac acagtttatc 240tctttgttgt aaaccaccca gaattcaaga atacagtgga aatttttaaa tttgaagaag 300sagaaaattc tctgttgcat ctgaaaacag tcaaacatga gcttcttcca aggtacttcc 360tcattttgtt ccttctctaa tttatcccca gcatttgcaa acaatcccta tggtgggttg 420tcctgtcatc ttttataagc gctaatgtat atattagcta atatgtaaga gctaaagagc 480ttatatttcc ttatttataa atgtgtgtgt atagtttcct tataaaccag ggcaagcatg 540gcatatgaaa gttgatgtca ctcatactat tcactgttct atgcggactc ctttgagaaa 600t601基因序列中301bp处s代表C/G多态即SNP位点rsl2(^6 ；根据上述序列设计引入错配碱基的引物，根据序列情况确定正向和反向引物的位置与长度，具体如下正向引物5，AGGTCCCGTAGTTATGTCTTGT 3，(SEQ ID NO 1),反向引物5，TCAGATGCAACAGAGAATTGTCT 3，(SEQ ID NO 2)；下游引物中下划线G碱基为错配碱基用来创造酶切位点，错配后PCR产物中多态附近序列由CAGAA或GAGAA (其中第一个碱基为C/G多态)更改为CAGAC或GAGAC，而BsmAI 识别GAGAC序列(与GTCTC序列互补)即多态为G等位基因时可切开，根据片段切开情况判断多态基因型；按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，合成所述引物可以使用本领域中公知的方法，例如固相合成法，也可以委托生物工程公司合成并检测正向和反向引物。将合成的正向、反向引物稀释为ΙΟμπιοΙ/L浓度备用；(2)制备PCR扩增产物PCR扩增使用15-100 μ 1的反应体系为2XPCR MIX用量为PCR扩增反应体系体积的一半即7. 5-50μ l、50-2000ng所述待检测人基因组DNA和10 μ mol/L正向、反向引物各0. 1-10 μ 1，用灭菌双蒸水补充至15-100 μ 1，混勻，即得PCR扩增反应体系；其中，所述的2XPCR MIX是2倍浓度的PCR反应用的混合液制成；将PCR扩增反应体系在94-95 V预变性3_5分钟后；进行30_35个如下循环 94-95°C变性 20-60s，50-65°C退火 20_60s，72°C延伸 20_60s ；30-35 个循环结束后 72°C延伸5-lOmin，即得PCR扩增产物，其位置相对应含P0N2多态rsl2026的部分基因序列(SEQ ID NO 3)中碱基 175bp-324bp 处；扩增后序列(其位置相对应含P0N2多态rsl2(^6的部分基因序列中碱基175-3M 处，共 150bp)为(SEQ ID NO 4)aggtcccgta gttatgtctt gtaaattaac tctgttcttt caattcttta gatgacacag 60tttatctctt tgttgtaaac cacccagaat tcaagaatac agtggaaatt tttaaatttg 120aagaagsaga caattctctg ttgcatctga150150bp序列扩增后产物序列中下划线部分为正向、反向引物所对应的序列，127bp 处s代表C/G多态即SNP位点rsl2026。(3)酶切反应将PCR扩增产物在10-30 μ 1酶切体系中进行酶切反应，所述的10_30 μ 1酶切体系为:2-15 μ 1的PCR扩增产物、识别GAGAC序列(与GTCTC序列互补)的限制性内切酶1-10U和IOX酶切缓冲液占总体积的1/10，灭菌双蒸水补充至10-30 μ 1，混勻，得酶切体系，将酶切体系于37°C水浴4-16小时，即得酶切产物；所述识别GAGAC序列(与GTCTC序列互补)的限制性内切酶为BsmAI、Alw26I及其同裂酶；该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段121bp (该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加4个碱基)序列(SEQ ID NO 5)aRRtcccRta RttatRtctt Rtaaattaac tctgttcttt caattcttta gatgacacag 60tttatctctt tgttgtaaac cacccagaat tcaagaatac agtggaaatt tttaaatttg 120a121酶切后切开片段121bp序列中下划线部分为正向引物所对应的序列；该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段^bp (该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少4个碱基)序列(SEQ ID NO 6)agaagsagac aattctctgt tgcatctga296bp处s代表C/G多态即SNP位点rsl2026 ；(2)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性将酶切产物在3%琼脂糖凝胶中3-8V/cm条件下，电泳40_80分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，对于不同的基因型，P0N2位点扩增后出现150bp片断，经酶切、电泳出现 150bp、121bpJ9bp三种片断，基因型判断依据150bp和121bp片段的有无判断GG型为 121bp，CG型有150bp和121bp两种片段，CC型为150bp ；经测序鉴定，测序结果和使用现有技术检测所得的结果完全相同。下面是实施本发明的若干实施例。实施例11材料与方法1. 1主要试剂及仪器试剂:2XPCR mix (MBI公司)，限制性内切酶BsmAI (NEB公司)，琼脂糖(BBI公司)，引物由上海Sangon公司合成。仪器9600型 PCR 仪(PE 公司)，微型电泳槽(Pharmacia Biotech, EPS1000), Gel Doc 2000凝胶成像仪(Bio-RAD公司)。PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。1. 2序列查找及引物设计在NCBI网站查找P0N2基因序列和SNP信息，结合有关文献确定P0N2多态位点碱基变异信息，设计引物，具体如下正向引物5，AGGTCCCGTAGTTATGTCTTGT 3，(SEQ ID NO 1),反向引物5，TCAGATGCAACAGAGAATTGTCT 3，(SEQ ID NO 2)；1. 3从全血标本提取DNA作为待测DNAEDTA抗凝管采集人外周血全血血样300 μ 1，使用TIANGEN公司RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统(主要成分为细胞裂解液CL、蛋白酶K、缓冲液TO、洗脱缓冲液TB)提取全血基因组DNA为待测人基因组DNA模板300 μ 1外周血转移至离心管，加入750 μ 1细胞裂解液CL，颠倒混勻5次；
10, 000r/min离心20秒，倒弃上清液；在离心管中加入150μ 1的缓冲液混合液，缓冲液混合液是由缓冲液TO与蛋白酶 K以体积比100 1混合制成，涡旋混勻器混勻至溶液无团块；然后，在65°C水浴lOmin，其间颠倒混勻5次；加入质量浓度为99. 9%的异丙醇150μ 1，颠倒充分混勻至出现丝状或簇状基因组 DNA ；10, 000r/min离心3分钟，倒弃上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保DNA
沉淀物在管中；加入质量浓度为70%乙醇150 μ 1，涡旋振荡5秒钟，10，000r/min离心3分钟，倒弃上清液后，再加入质量浓度为70%乙醇150 μ 1，涡旋振荡5秒钟，10，000r/min离心3分
钟，倒弃上清液；将离心管倒置在干净的吸水纸上停留5分钟，确保DNA沉淀物在管中；将离心管在室温下静置，干燥至所有的液体挥发干净(至少5分钟)；再加入200 μ 1洗脱缓冲液ΤΒ，涡旋振荡5秒，65°C加热10分钟至1小时，加热时， 轻弹数次助溶，即得全血基因组DNA。1. 4PCR扩增及酶切鉴定人基因组DNAlOOng (制备方法如上所述)，每个引物0. 2 μ mol/L, IXPCRmix,灭菌双蒸水补足25 μ 1反应体系。PCR反应条件为首先94°C预变性5min，然后94°C变性30s，根据引物Tm值取56°C退火20s，72°C延伸20s，共30个循环后72°C延伸IOmin。PCR扩增后， 取PCR产物10 μ 1，加入5U内切酶和2 μ 1 IOX酶切缓冲液和灭菌双蒸水组成20 μ 1反应体系，37°C水浴中酶切他后，电泳后于凝胶成像仪观察成像，结果示于图1中。2 结果2. 1酶切结果上述酶切产物在3%琼脂糖凝胶8V/cm条件下，电泳40分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，P0N2位点扩增后出现150bp片断(以上游序列为准，以下同)JSBsmAI酶切后电泳会出现150bp、121bp (下游序列相比上游序列由于MspI酶切产生粘性末端增加四个单链碱基)、29bp(下游序列相比上游序列由于MspI酶切产生粘性末端减少四个单链碱基)三种片断(其中^bp电泳图中不能看到)。如图1所示。酶切后基因型判断GG为121bp —个片段，CG有121bp和150bp两种片段，CC为150bp —个片段。2. 2P0N2基因多态结果鉴定检测结果发现P0N2出现GG型、CG型和CC型三种基因型。另外，对P0N2多态各类型PCR产物进行测序鉴定，测序结果与预期结果完全一致。实施例2外周血全血标本测定人P0N2基因rsl2(^6多态与实施例1的步骤基本相同，PCR反应所采用的正向引物是SEQ ID N0:7，反向引物是SEQ ID N0:8，退火温度为57°C，并且所采用的限制性内切酶是Alw26I(MBI公司)；正向引物5'TGCCCAGAGGTCCCGTAG 3' (SEQ ID NO 7)反向引物5‘ TTCAGATGCAACAGAGAATTGTCT 3 ‘ (SEQ ID NO 8)结果
扩增后序列(其位置相对应含P0N2多态rsl2(^6的部分基因序列中碱基168-325 处，共158bp)，所获得的扩增产物序列如下(SEQ ID NO 9)tgcccagagg tcccgtagtt atgtcttgta aattaactct gttctttcaa ttctttagat 60gacacagttt atctctttgt tgtaaaccac ccagaattca agaatacagt ggaaattttt 120aaatttgaag aagsagacaa ttctctgttg catctgaa158扩增后产物序列中下划线部分为正向、反向引物所对应的序列，s代表C/G多态即 SNP 位点 rs 12(^6。酶切后的产物序列分别如下该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段U8bp (该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加4个碱基)序列(SEQ ID NO 10)tRcccaRaRR tcccRtaRtt atgtcttgta aattaactct gttctttcaa ttctttagat 60gacacagttt atctctttgt tgtaaaccac ccagaattca agaatacagt ggaaattttt 120aaatttga128该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段30bp (该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少4个碱基)序列(SEQ ID NO=Il)agaagsagac aattctctgt tgcatctgaa30上述酶切产物在3%琼脂糖凝胶6V/cm条件下，电泳50分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，P0N2位点扩增后出现158bp片断，经酶切、电泳出现158bp、128bp、30bp三种片断， 基因型判断依据158bp和128bp片段的有无判断=GG型为128bp, CG型有158bp和128bp 两种片段，CC型为158bp。实施例3外周血血凝块标本测定测定人P0N2基因rsl2(^6多态与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从外周血血凝块标本提取DNA 作为待测DNA。另外，PCR反应所采用的正向引物是SEQ NO :12，反向引物是SEQ N0:13，退火温度是56 °C。正向引物5‘GTCCCGTAGTTATGTCTTGTAAA 3' (SEQ NO 12)反向引物5‘CAGATGCAACAGAGAATTGTCT 3' (SEQ NO 13)提取DNA:普通采血管采集人外周血400 μ 1，使用TIANGEN公司RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统提取外周血血凝块中基因组DNA为待测人基因组DNA模板；待采血管内血清析出后分离血清，然后按下列步骤进行将上述采血管中凝血块研磨为勻浆状后置于离心管中，加入750μ 1细胞裂解液 CL，颠倒混勻5次；10, 000r/min离心20秒，倒弃上清液；加入150μ 1缓冲液混合液，缓冲液混合液是由缓冲液re与蛋白酶K以体积比 100 1混合制成，涡旋混勻器混勻至溶液无团块；然后，在65°C水浴lOmin，其间颠倒混勻6次；加入质量浓度为99. 9%的异丙醇150μ 1，颠倒充分混勻至出现丝状或簇状基因组 DNA ；
10，000r/min离心3分钟，倒弃上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上，确保DNA
沉淀物在管中；加入质量浓度为70%的乙醇150 μ 1，涡旋振荡5秒钟，10，000r/min离心3分钟， 倒弃上清液后，再加入质量浓度为70%的乙醇150 μ 1，涡旋振荡5秒钟，10，000r/min离心 3分钟，倒弃上清液；将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5分钟，确保DNA沉淀物在管中；将离心管在室温下静置，干燥至所有的液体挥发干净(至少5分钟)；加入200 μ 1洗脱缓冲液TB,涡旋振荡5秒，65°C加热10分钟至1小时，加热时，轻弹数次助溶，即得外周血血凝块中基因组DNA。结果扩增后序列(其位置相对应含P0N2多态rsl2(^6的部分基因序列中碱基177-323 处，共147bp)，所获得的扩增产物序列如下(SEQ ID NO 14)gtcccgtagt tatgtcttgt aaattaactc tgttctttca attctttaga tgacacagtt 60tatctctttg ttgtaaacca cccagaattc aagaatacag tggaaatttt taaatttgaa 120gaagsagaca attctctgtt gcatctg147扩增后产物序列中下划线部分为正向、反向引物所对应的序列，s代表C/G多态即 SNP 位点 rs 12(^6。酶切后的产物序列分别如下该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段119bp (该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加4个碱基)序列(SEQ ID NO 15)RtcccRtaRt tatRtcttRt aaattaactc tgttctttca attctttaga tgacacagtt 60tatctctttg ttgtaaacca cccagaattc aagaatacag tggaaatttt taaatttga 119该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段^bp (该片段下游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少4个碱基)序列(SEQ ID NO 16)aRaaRsaRac aattctctet tecatcte28上述酶切产物在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳60分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，P0N2位点扩增后出现147bp片断，经酶切、电泳出现147bp、119bp、28bp三种片断， 基因型判断依据147bp和119bp片段的有无判断=GG型为119bp，CG型有147bp和119bp 两种片段，CC型为147bp。实施例4人肺组织标本测定人P0N2基因rsl2(^6多态与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从肺组织标本提取DNA作为待测 DNA。使用手术切除肺组织，酚-氯仿法提取肺组织基因组DNA为待测人基因组DNA模板将肺组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0. lg，玻璃勻浆器研磨碎肺组织后放入1. 5ml的第一个离心管中；在第一个离心管中加入Iml DNA 提取缓冲液(lOmmol/Ltris 'Cl2,0. lmol/LEDTA, 20 μ g/ml胰RNA酶，0. 5 %的十二烷基硫酸钠)混勻，再加入50 μ 1质量浓度为10 %的十二烷基硫酸钠，浓度为20mg/ml的蛋白酶K5. 0 μ 1，充分混勻后，于56°C保温5h，每池摇1次；
放置到室温，加入饱和酚500 μ 1，颠倒混勻，10000r/min离心lOmin，分离水相和
有机相，吸取上层含核酸的水相置于1. 5ml的第二个离心管中；在第二个离心管中加入与管内的含核酸的水相等体积的酚氯仿异戊醇的混合液，其中，酚氯仿异戊醇的混合液是由酚氯仿异戊醇以体积比25 24 1混合制成，颠倒混勻，10000r/min离心10分钟，取上层液体转移到1. 5ml第三个离心管中；第三个离心管中，加入与管内液体等体积的氯仿异戊醇以体积比M 1混合制成的混合液，颠倒混勻，10000r/min离心10分钟，取上层清液到1. 5ml第四个离心管中；在第四个离心管中加入管内清液2. 5倍体积的-20°C预冷的无水乙醇，沉淀DNA， 得DNA沉淀物；将DNA沉淀物，12000r/min离心10分钟，弃乙醇；再加入_20°C的质量浓度为75%的乙醇洗涤，10000r/min离心5分钟，去乙醇，在 55 °C下干燥，得干燥的DNA沉淀物；加入100 μ 1灭菌双蒸水溶解干燥的DNA沉淀物，_20°C保存，即得肺组织基因组 DNA，备用。结果所得酶切产物在3%琼脂糖凝胶4V/cm条件下，电泳70分钟，于紫外灯下拍照鉴定，其中，P0N2位点扩增后出现150bp片断，经酶切、电泳出现150bp、12 Ibp、^bp三种片断， 基因型判断依据150bp和121bp片段的有无判断GG型为121bp，CG型有150bp和121bp 两种片段，CC型为150bp。经测序鉴定，测序结果和使用现有技术检测所得的结果完全相同。从上述实施例可以看出，本发明针对使用PCR-RFLP鉴定P0N2多态rsl2026的缺点，即使用识别原多态附近序列的内切酶，内切酶选择余地小，价格昂贵等因素。本发明通过设计包含酶切位点的错配引物来克服该缺点。该方法可认为是PCR-RFLP的特殊应用，其原理是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计PCR引物，其中一条引物根据突变位点邻近序列设计，人为引入错配碱基，使得引物3'端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点，其PCR产物可用类似PCR-RFLP的方法进行分析。由于这种方法应用了引物3'端错配技术，PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际运用中具有很大的灵活性，且检测方法简单易行，成本低，酶切结果易分辨，是一种进行基因型鉴定的较好方法。本发明通过改进实验方法，重新设计新的引物扩增该多态序列，使扩增产物中该基因多态附近序列改变，能够应用其他内切酶进行鉴定，从而可以选择更为廉价的内切酶完成检测。
权利要求
1. 一种用于鉴定人P0N2基因多态性rsl2026的试剂盒，其特征在于，包含扩增人P0N2 基因多态性rsl2(^6位点附近序列的正向引物和反向引物以及限制性内切酶，所述正向引物如SEQ ID NO :7所示，所述反向引物如SEQ ID NO :8所示，所述限制性内切酶是Alw26I。
全文摘要
人PON2基因多态性(rs12026)检测试剂盒，包含扩增人PON2基因多态性rs12026位点附近序列的正向引物和反向引物以及限制性内切酶，所述正向引物如SEQ ID NO7所示，所述反向引物如SEQ ID NO8所示，所述限制性内切酶是Alw26I。本发明操作简单，成本低，使用范围广。
文档编号C12Q1/68GK102433386SQ20111043867
公开日2012年5月2日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者姚武, 杨永利, 王威 申请人:郑州大学