专利名称：基于实时荧光pcr的染色体非整倍体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种染色体非整倍体的定量检测试剂盒，尤其是涉及一种基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒。
背景技术：
染色体(chromosome)是遗传物质的载体，真核细胞的基因(gene)大部分存在于染色体上，并随着染色体的传递而传递。染色体的数目与形态结构具有物种特异性，即在同一物种中，染色体的数目与形态结构是恒定的，如此得以维持该物种的特征。染色体如果发生了异常，将会导致许多基因的剂量变化如增加或减少，进而导致出现多种畸形的综合征， 称之为染色体综合征。
染色体异常包括结构异常和数目异常，数目异常又分为整倍体改变和非整倍体改变。染色体结构变异所造成的表型改变往往较轻且不固定。整倍体改变往往是高度致死的， 患病胎儿无法存活至出生。而非整体在新生儿中出现的比例高，造成的病征严重，且目前尚没有有效的治疗手段。
一个体细胞的染色体数目增加或减少了一条或数条，称之为染色体非整倍体 (chromosomal aneuploidy)，这是临床上最常见的人类染色体畸变类型。迄今为止，在人类 22条常染色体中只发现21三体，18三体和13三体这三种类型的非整倍体活产儿，而其他常染色体非整倍体胎儿均在妊娠早期自发性流产。对于非整倍体胎儿目前最为有效的控制方法只能是通过产前诊断确诊后采取中止妊娠的方法预防患病胎儿的出生。因此染色体非整倍体的产前诊断一直是医学遗传学的研究热点。
目前，染色体非整倍体的产前诊断以细胞生物学方法为主要手段，分子细胞生物学与分子生物学方法互为有效补充。
细胞生物学方法主要指染色体组型分析(karyotyping)，也称核型分析。目的是对待测细胞的全部染色体按大小、形态特征等排列后形成的核型(karyotype)进行数目与形态的分析，以确定是否与正常核型完全一致。染色体组型分析不仅可以诊断整条染色体的丢失和增加，还可以检测缺失、重复、易位、重组等染色体结构异常，并且具有直观的形态结果和很高的可信度，因此三十多年来，此项技术没有太大的改变却仍然是国内外染色体异常的产前诊断金标准，并有许多相应的试剂盒面世。虽然如此，这项技术却有明显的不足之处。首先，从样品采集至结果输出，整个诊断过程需要大约两周时间，容易给受检对象造成较大的心理负担；其次，虽然有商品化的试剂盒与相关软件的帮助，这项技术仍需要较为专业的从业人员进行细胞培养、结果判断等工作；第三，存在细胞培养失败、母源细胞污染等较多不确定因素。这些不足之处决定了染色体组型分析是一个耗时、高成本、低通量的诊断技术。
上世纪末，分子生物学技术与传统细胞生物学技术结合形成了许多分子细胞遗传学技术。这些分子细胞遗传学技术与分子生物学技术作为传统染色体组型分析的有效补充，主要具有快速、低成本、高通量等特点。但是由于许多方法面世的时间并不长，因此仍然需要更大量的临床评价和进一步的完善。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)(Nederlof PM, van der Flier S, Wiegant J, et al. Cytometry, 1990,11 :126-31)和比较基因组杂交技术(Comparative genome hybridization, CGH) (Barrett IJ, Lomax BL, Loukianova T，et al. Arch Pathol Lab Med,2001,125 :81-4) 1 是分子细胞生物学技术的典型。它们的原理都是利用荧光标记的DNA探针与处于中期或间期的羊水细胞内染色体DNA杂交，然后通过荧光显微镜等仪器观察荧光的分布和数量来判断染色体异常的情况。这两项分子细胞生物学技术由于其灵敏度高、特异性强等优点被广泛应用于确定未知区域的染色体重复和缺失、染色体不平衡片段的识别以及染色体重排的发现等染色体结构异常的研究中。然而相对于发生异常频率最高的整条染色体数目发生变化的非整倍体检测来说，采用这两项技术的综合成本较高，给患者造成了较大的经济负担， 也影响了自身在临床上的广泛应用。
PCR技术的出现使分子生物学迈入一个新的时代。基于PCR技术的诊断方法也以其操作简便、低成本、高通量、易自动化等优势弓I起人们的广泛兴趣。最早应用于染色体非整倍体的产前诊断的这类方法是定量PCR(Quantitative PCR) (Von Eggeling F，Freytag Μ, Fahsold R, et al. Hum Genet，1993，91 :567-70)，这项技术的原理是选取特定染色体上的短串联重复序列(Small-tandem-r印eat，STR)的两端序列作为引物结合位点，对STR序列进行扩增，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析。该方法的优点是准确性高，无需细胞培养，诊断可在一天内完成。它的不足之处在于有的同源染色体可能含有相同长度的STR序列，因此一个STR序列对于精确诊断就有所不足，通常会同时对一个染色体上的4个或以上STR序列进行分析。这就增加了扩增反应的重数，增加了扩增的难度。 同时，不同人种的STR序列也有差别，适合于某一人种的STR诊断组合并不一定适合另一人种，因此需要重新设计扩增位点，增加了实验难度。
近几年来，一种新的多重探针连接再扩增技术(Multiplex ligation-d印endent probe amplification, MLPA) (Schouten JP, McElgunn CJ, Waaij er R, et al. Nucleic Acids Res, 2002, 30 :e57)以其耗时短和较高的准确性赢得了诊断界的青睐，与QF-PCR — 样获得了广泛的应用。国内一些医院在近几年也弓I入了该技术用于传统染色体组型分析方法的辅助分析。该方法的创新之处在于采用杂交连接的方法将不同染色体间数目的比例转化为不同杂交探针数目的比例，并使用一对扩增引物进行扩增，消除了因为不同引物扩增效率不同而引起的误差，大大增强了实验结果的准确性。并且通过stuffer序列和核酸测序仪的使用，大大提高了分析的通量，从而可以在一条染色体上分析多个位点，也增加了结果的准确性。但是，由于杂交探针的长度较长，超过了化学合成的范围，只能通过M13噬菌体克隆获得，增加了技术难度和成本。同时PCR产物的后处理使得PCR产物造成的交叉污染难以避免。测序仪器分析同样增加了仪器、试剂的成本和工作量。以上因素限制了这项技术临床的普及。
实时荧光PCR技术(Real-time PCR)使PCR技术摆脱了琼脂糖与毛细管电泳的束缚，迈上一个新的阶梯。它的基本原理是通过荧光标记的寡核苷酸探针或嵌入式荧光染料结合相关仪器实时获得PCR扩增反应的动力学曲线，通过Ct值(产物荧光值到达设定阈值所需的反应循环数)即可获得初始模板的相对或绝对数量信息。无需电泳等PCR产物后处理步骤，且由于扩增初始误差未被放大，因此比终产物定量的方法更加准确。实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)(Zimmermann B, Holzgreve W, Wenzel F, et al.Clin Chem, 2002 ；48 :362-3)就是这样一种用于染色体非整倍体检测的技术。它的原理是设计两对引物和标记不同荧光基团的探针分别针对待检测的染色体上的序列和对照染色体上的序列(通常为看家基因序列，发生数目异常的概率极小)。通过对扩增后两个探针指示的Ct值进行比较从而判断染色体数目异常情况。此方法简单、快速，但也存在一些缺点。由于不同引物扩增效率不可能完全相同并且会相互影响，因此表现在Ct值上的误差较大。以三体为例，异常染色体的数目仅为正常染色体数目的1. 5倍，理论上Ct值仅相差0. 6， 这样小的差别对于误差极为敏感。同时，因为波长范围的影响，同一反应中共存的荧光基团的种类有限，使得该方法一般只能针对染色体上的单一序列。而拷贝数变异(Copy number variation, CNV)是近年来发现的人类基因组中普遍存在的现象，它指的是基因组DNA中大于11Λ的片段缺失或重复现象，保守估计至少10%的人类基因组序列存在这样的现象。这样就可能存在这样的情况某个正常胎儿的相关染色体检测区域恰好多一拷贝重复或某个患病胎儿多余的染色体恰好缺失这么一个检测区域，这样就造成了错误的诊断结果。综上所述原因，此方法快速廉价，但准确性不高，容易出现假阳性或假阴性的诊断结果。发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、特异，用于临床染色体非整倍体疾病检测的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒。
本发明的技术方案是采用多重杂交探针与对应待检染色体上的DNA序列杂交，再经连接酶连接后，对连接产物进行PCR扩增。并且通过检测探针和实时荧光PCR仪指示对应染色体的相对数量变化情况，从而实现对非整倍体的检测。
本发明设有盒体、杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂；所述杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂设在盒体内；
所述杂交连接试剂包括LDR混合液、CA连接缓冲液和CA连接酶；所述LDR混合液即96条杂交探针混合液，每条杂交探针5fmol ；所述CA连接缓冲液即商品化的1 X Taq DNA 连接酶缓冲液；所述CA连接酶即IU Taq DNA连接酶。
所述96条杂交探针序列为
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所述扩增试剂包括CA PCR混合液A、CA PCR混合液B和CA酶混合液；所述CA PCR 混合液 A 包括商品化的 IXPCR 缓冲液，3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTPO. 4mM, ΙμΜ 引物-Fl，lyM 引物-R，0. 2 μ M 探针 _A，0. 2 μ M 探针-B，0. 2 μ M 探针-C，0. M μ M 探针-D，0. ΜμΜ探针-Ε，0. ΜμΜ探针-F ；所述CAPCR混合液B包括IXPCR缓冲液， 3. OmMMgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 1 μ M 弓|物-F2，1 μ M 弓|物-R，0. 2 μ M 探针-八，0.2口] 探针-8，0力]\1探针-C，0. 24 μ M探针 _D，0. 24 μ M探针 _Ε，0· 24 μ M探针-F ； 所述CA酶混合液包括IU TaqHS, 0. OlU UNG。
所述引物及探针序列为
引物-Fl 5'-gggttccctaagggttgga-3‘
引物-F2 5'-tgctgggacgcattgttgata-3‘
引物-R 5'-gtgccagcaagatccaatctaga-3‘
探针-A 5'-hex-acgggagcctcaccggg-nh2-3 ‘
探针-B 5'-fam-cggccactccgagggca-nh2-3 ‘
探针-C 5'-Cy5-GATGGCAGCCTCACAGGT—P04-3
探针-D 5'-CCGGTGAGGCTCCCGT-dabcyl-3‘
探针-E 5'-GCCCTCGGAGTGGCCG-dabcyl-3‘
探针-F 5'-CCTGTGAGGCTGCCATC-dabcyl-3‘
所述参照试剂包括ca正常对照和ca阴性对照所述CA阴性对照可选自H20、Tris-HCl缓冲液、生理盐水等中的一种。
所述检测探针可以是目前用于实时PCR检测的各类探针，可选自TaqMan探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针等中的一种。
所述针对每条染色体可以设计8对杂交探针，也可以是其他重数的杂交探针。
所述连接酶可以是Ligase-65，也可以是T4-DNALigase 或E. coli DNA Ligase 等其他DNA连接酶。
所述buffer可以是IX PCRbuffer，也可以是其它类型的PCR缓冲液(buffer)。
本发明所述试剂盒的具体操作步骤如下
本发明所述试剂盒的具体操作步骤包括杂交连接反应阶段、实时PCR反应阶段和结果判读阶段。
I.第一阶段——杂交连接反应阶段1)试剂准备——配液区①首先将杂交连接试剂和参照试剂从冰箱取出并平衡至室温。杂交连接反应液 配液标准为取nXO. 5 ii L LDR混合液、nX4uL CA连接缓冲液和0. 5 u LCA连接酶加入 到1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒。配好的杂交连接反应液必须贮存 在-20°C并在4h内使用。②将配制好的杂交连接反应管装入凹凸袋转移至模板间。贮存在-20°C直至样品 变性处理完毕。2)样品DNA变性及加样——杂交连接区①用微量加液器向每支200 ii L离心管(Axygen)中加入相应20ng/y L的样品DNA 5iiL。立即盖严管盖，于98°C变性5min。②加入杂交连接反应液。样品DNA变性完毕后，杂交连接反应液以每管5 y L分装 于步骤①的反应管中，并用加液器反复吹吸混勻。③杂交连接程序可为片段化及变性98°C5min;中止(加入杂交连接反应液)25°C预变性95 °C 2min ；杂交连接循环程序(6个循环)70°C 2min ；68 °C 2min ；66 °C 2min ；64°C 2min ；62 °C 2min ；终止60°Cn .第二阶段一实时PCR反应阶段1)试剂准备——配液区①首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为取 nX19.8u LCAPCR混合液A和n X 0. 2 y L CA酶混合液加入到1. 5mL离心管中，振荡混勻数 秒，3000rpm离心数秒；另取nX 19. 8 y LCAPCR混合液B和nXO. 2 y L CA酶混合液加入到另 一 1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒。配好的PCR反应液必须贮存在_20°C 并在4h内使用。②PCR反应液的分装。PCR反应液A/B分别以每管20 y L分装于PCR薄壁反应管。③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至模板间。贮存在-20°C直至样品杂交 连接完毕。2)样品的加样——模板间①杂交连接后的产物需稀释5倍，即用微量加液器向每支已杂交连接的200 y L离 心管(Axygen)中加入40 y L超纯水，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒。②用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的已稀释的杂交连接产物 5iiL。立即盖严管盖。③将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。
3) PCR扩增-扩增区
①PCR扩增程序可为
第一步50°C2min，95°C 3min ；
第二步95°C15s，55°C 20s，72°C 20s，45 个循环，55°C 20s 处收集荧光信号，荧光通道选用FAM、HEX和Cy5。
②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。
III 第三阶段——数据分析阶段
数据分析阈值应处于检测标本荧光值的对数上升区，采集该阈值对应的Ct值并按以下公式计算出Δ Δ Ct值
A 管检测目标 Δ CtFAM = Ct應-(CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3
正常参照Δ CtFAM = CtFAM- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3
Δ Δ CtFAM =目标 Δ CtFAM"参照 Δ CtFAM
同理，ΔΔ CtHEX =目标 Δ CtHEX-参照 Δ CtHEX
Δ Δ Ctcy5 =目标 Δ Ctcy5-参照 Δ Ctcy5
B 管检测目标 Δ CtFAM = CtFAM"CtCY5
正常参照Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5
Δ Δ CtFAM =目标 Δ CtFAM-参照 Δ CtFAM
同理，ΔΔ CtHEX =目标 Δ CtHEX-参照 Δ CtHEX
每个反应设立2 3个平行管，取平均值进行分析。
正常标本即野生型在各体系及各通道中的Δ ACt值范围如下
反应体系A和B中Δ Δ Ct值的正常参照范围均为士0. 3。
Ct值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出的Ct值不在检测标本荧光值的对数上升区时，可通过调整基线方法获得Ct值。
以下给出结果判读
1)Α 管
CY5通道的Δ Δ CT值小于等于_0. 4的标本可判断为21三体；
FAM通道的Δ Δ CT值小于等于-0. 4的标本可判断为18三体；
HEX通道的Δ Δ CT值小于等于-0. 4的标本可判断为13三体；
各通道的Δ ACT值介于-0.3和0.3之间的标本可判断为正常，如果各通道的 Δ ACT值介于-0. 3和-0. 4或大于0. 3之间的标本需要重新检测。
2) B 管
首先通过FAM通道的信号判断标本性别有信号升起且CT值小于等于30的为男性，无信号升起或有微弱信号(CT值为0或大于等于35的为女性)；
其次，针对男性标本，结果判断如下
FAM通道的Δ Δ CT值小于等于_0. 4标本可判断为47，XYY ；
HEX通道的Δ Δ CT值小于等于-0. 4的标本可判断为47，XXY ；
两通道的Δ ACT值介于-0.3和0.3之间的标本可判断为ΧΥ，如果两通道的 Δ Δ CT值介于-0. 3和-0. 4之间或者大于0. 3的标本需要重新检测。
针对女性标本，结果判断如下
HEX通道的Δ Δ CT值小于等于-0. 4的标本可判断为47，XXX ；
HEX通道的Δ Δ CT值大于等于0. 6的标本可判断为45，XO ；
HEX通道的Δ Δ CT值介于_0. 3禾Π 0. 3之间的标本可判断为XX，如果HEX通道的 Δ Δ CT值介于0. 3和0. 6之间或-0. 3和-0. 4之间的标本需要重新检测。
实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输、保存不当或试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测不准确的结果。
图1为本发明的结构组成示意图。
图2为实时荧光多重探针连接再扩增技术原理图。A 杂交探针分别与对应的染色体上序列杂交。B 充分杂交后利用连接酶使左侧探针与右侧探针连接成完整的可扩增的杂交探针。C 利用一对通用引物扩增杂交探针，采用不同荧光标记的检测探针指示不同染色体序列的扩增情况，由实时荧光PCR仪记录扩增曲线。
图3为唐氏综合征与正常对照区分图。横坐标为阈值(％)，纵坐标为ACt值。空心正方形代表32份唐氏综合征标本，实心三角形代表100份正常对照。
图4为200例正常人和47例染色体异常标本(包括23例21三体，3例13三体， 3例18三体，8例ΧΧΥ，1例XYY和9例X)的检测对照区分图。横坐标为标本类型，纵坐标为Δ Δ Ct值。
具体实施方式
参见图1，本发明实施例设有盒体1、杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂；所述杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂设在盒体1内。
所述杂交连接试剂包括LDR混合液21、CA连接Buffer混合液22和CA连接酶23 ； 所述LDR混合液21即96条杂交探针混合液，每种杂交探针均为5fmol，所述CA连接缓冲液 22 即为商品化的 IXTaq DNALigase Buffer ；所述 CA 连接酶 23 即 IU Taq DNALigase ；
所述扩增试剂包括CA PCR混合液A 31、CA PCR混合液B 32和CA酶混合液33 ；所述 CAPCR 混合液 A31 包括商品化的 1 XPCRbuffer，3. OmMMgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4πιΜ，1μΜ引物-Fl，lyM引物-R，0. 2μΜ探针-Α，0. 2μΜ探针-Β，0. 2μΜ探针-C， 0. 24μΜ探针-D，0. 24μΜ探针_Ε，0. 24 μ M探针-F ；所述CAPCR混合液B 32包括商品化的 IXPCR buffer, 3. OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 1 μ M 弓|物-F2，1 μ M 引物-札0.2 4] 探针-六，0.2 4]\1探针-8，0.2 4]\1探针-C，0. ΜμΜ探针_D，0. ΜμΜ探针-Ε， 0. 24 μ M探针-F ；所述CA酶混合液33包括IU TaqHS，0. OlU UNG。
所述参照试剂包括CA正常对照41和CA阴性对照42 ；所述CA正常对照41为正常人DNA，所述CA阴性对照42可选自H20、Tris-HCl缓冲液、生理盐水等中的一种。
所述检测探针可以是目前用于实时PCR检测的各类探针，如TaqMan探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针等。
所述针对每条染色体可以设计8对杂交探针，也可以是其他重数的杂交探针。
所述连接酶可以是Ligase-65，也可以是T4-DNALigase 或E. coli DNA Ligase 等其他DNA连接酶。
所述buffer可以是1 XPCR buffer,也可以是其它类型的PCR缓冲液(buffer)。
以下给出具体实施例
实施例1 实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒检测能力的考察
本发明公开一种基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒。该试剂盒采用杂交连接反应结合实时PCR技术，建立了常见染色体非整倍体的快速检测体系。该体系由杂交连接和实时PCR两部分组成。以第一管检测13、18和21号染色体的信号的体系为例对本试剂盒的发明原理做如下说明在杂交连接体系中，杂交探针与基因组模板上互补序列充分杂交并利用连接酶将左侧探针与右侧探针连接为一条完整的可供扩增的杂交探针， 如图2-A和图2-B。后续的实时PCR体系则通过该反应管对连接后的杂交探针进行扩增，并利用不同荧光基团标记的检测探针指示不同组的可供扩增杂交探针数量，即间接指示了对应染色体的数目如图2-C。最后利用一定的数据分析方法对实时荧光PCR仪记录的扩增曲线进行分析即可获得染色体非整倍体的信息。
以唐氏综合征为例考察实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒的检测能力。 唐氏综合征也称先天愚型，主要核型为47，XX(XY), +210据统计新生儿中此病的发病率约 1/500 1/1000。我国目前约有60万以上21三体综合征患儿，并以每年27000例左右的速度增加。智力发育不全是本病最突出的症状，患者智商仅在25 50之间。患者具有特殊的面容，40%的患者具有先天性心脏病，并且其白血病，白内障，呼吸道疾病的发病风险都较正常人要高。男性患者常有隐睾，无生育能力；女性患者通常无月经，偶有生育能力，并有可能将此病遗传给下一代。
为了考察实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒在非整倍体产前诊断的临床应用潜力，我们对唐氏综合征临床标本和正常对照进行了病例-对照试验 (case-control study)。32份非整倍体DNA均提取自唐氏综合征患者的外周血白细胞，为厦门市妇幼保健院所提供。100份正常DNA对照样品提取自正常人外周血白细胞，为厦门市中心血站所提供。样品的使用均获得相关责任人的同意。所有血液样品均使用Qiagen公司的DNeaSyTMBl00d Kit并遵照其说明书的提取方式提取DNA。提取后的DNA采用紫外可见分光光度计进行OD26tl测定并计算浓度。最终DNA以20ng/ μ L浓度分装于_20°C保存待用。
杂交连接反应在热循环仪上进行。
1.5yL全血DNA置于200yL离心管(Axygen)中，98 °C加热变性5min，降温至 25 °C。
2. 0. 5 μ L杂交探针混合液与4μ L Ligase缓冲液、0. 5 μ L Taq连接酶振荡混勻后加入离心管内与5 μ L全血DNA混合组成杂交反应体系，再次振荡混勻。
3.杂交反应体系95°C变性2min，杂交循环程序(6个循环)70°C 2min ；68°C 2min ；66°C 2min ；64°C 2min ；62°C 2min，温度降至 60°C，杂交连接反应完成。
实时荧光PCR反应均在Mx3005P五色实时荧光PCR仪(Stratagene)上进行。 25μ L 反应体系 A 内含 10mmol/L Tris-HCl (ρΗ 8. 6)，50mmol/L KCl, IU TaqHS (Takara), 0. 0IUUNG, 3mmol/L Mg2+，dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 0. 2 μ M 探针 _Α，0. 2 μ M 探针-B，0· 2μ M探针-C，0· 24 μ M 探针 _D，0. 24 μ M 探针 _Ε，0· 24 μ M 探针-F，1 μ M 弓丨物 _F1，ΙμΜ引物-R。5 μ L连接反应的产物作为扩增的模板。反应程序如下50°C温育aiiin，95°C 预变性:3min ；95°C变性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，45个循环，在退火阶段采集FAM、 HEX和Cy5通道的荧光信号。
数据分析将扩增曲线的终点荧光值平均分为十份分别设定为阈值，采集不同阈值对应的Ct值并按以下公式计算出Δ Ct值
Δ Ctcy5 = Ctcy5- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3.
每个反应设立2 3个平行管，取平均值进行分析。
结果如图3所示，在很宽的范围内，32份唐氏综合症标本与100份正常对照没有交叠，可以显著区分，说明此项技术可以很好地进行非整倍体检测。
实施例2 染色体非整倍体的检测
目前，在人类常染色体中只发现21三体，18三体和13三体这三种类型的非整倍体活产儿，而其他常染色体非整倍体胎儿均在妊娠早期自发性流产。人类的性染色体较易发生非整倍体变异，如常见的有核型为47，XXX、47，XXY,47, XYY和45，X等情况。为了评估实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒在非整倍体产前诊断的临床应用潜力，我们对以上几种常见的染色体非整倍体临床标本和正常对照进行了病例-对照试验(case-control study)。试验共收集到的47份染色体非整倍体DNA均提取自染色体非整倍体患者的外周血白细胞，200份正常DNA对照样品提取自正常人外周血白细胞。所有血液样品均使用Qiagen 公司的DNeaSyTMBl00d Kit并遵照其说明书的提取方式提取DNA。提取后的DNA采用紫外可见分光光度计进行OD26tl测定并计算浓度。最终DNA以20ng/ μ L浓度分装于_20°C保存待用。
杂交连接反应在热循环仪上进行。
1.5yL全血DNA置于200yL离心管(Axygen)中，98 °C加热变性5min，降温至 25 °C。
2. 0. 5 μ L杂交探针混合液与4 μ L连接酶缓冲液、0. 5 μ L Taq连接酶振荡混勻后加入离心管内与5 μ L全血DNA混合组成杂交反应体系，再次振荡混勻。
3.杂交反应体系95°C变性2min，杂交循环程序(6个循环)70°C 2min ；68°C 2min ；66°C 2min ；64°C 2min ；62°C 2min，温度降至 60°C，杂交连接反应完成。
实时荧光PCR反应均在美国Bio-Rad公司的荧光定量PCR仪(CFX96)上进行。 25μ L 反应体系 A 内含 10mmol/L Tris-HCl (ρΗ 8. 6)，50mmol/L KCl, IU TaqHS (Takara), 0. 0IUUNG, 3mmol/L Mg2+，dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM, 0. 2 μ M 探针 _Α，0. 2 μ M 探针-B，0· 2μ M探针-C，0· 24 μ M 探针 _D，0. 24 μ M 探针 _Ε，0· 24 μ M 探针-F，1 μ M 弓丨物 _F1， 1口皿引物-1 。5μ L连接反应的产物作为扩增的模板。25yL反应体系B内含IOmmol/ L Tris-HCKpH 8. 6)，50mmol/L KCl, IU TaqHS (Takara) ,0. OlU UNG,3mmol/L Mg2+, dATP、 dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM，0. 2 μ M 探针-A, 0. 2 μ M 探针-B，0. 2 μ M 探针-C，0. 24 μ M 探针-D，0. 24 μ M探针-Ε，0. 24 μ M探针-F，1 μ M引物-F2，1 μ M引物-R。5 μ L连接反应的产物作为扩增的模板。反应程序如下50°C温育anin，95°C预变性:3min ；95°C变性15s，55°C 退火20s，72°C延伸20s，45个循环，在退火阶段采集FAM、HEX和Cy5通道的荧光信号。
数据分析阈值应处于检测标本荧光值的对数上升区，采集该阈值对应的Ct值并按以下公式计算出Δ Δ Ct值
A 管检测目标 Δ CtFAM = Ct應-(CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3
正常参照Λ CtFAM = CtFAM- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3
Δ Δ CtFAM =目标 Δ CtFAM_ 参照 Δ CtFAM
同理，ΔΔ CtHEX =目标 Δ CtHEX-参照 Δ CtHEX
Δ Δ Ctcy5 =目标 Δ Ctcy5-参照 Δ Ctcy5
B 管检测目标 Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5
正常参照Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5
Δ Δ CtFAM =目标 Δ CtFAM_ 参照 Δ CtFAM
同理，ΔΔ CtHEX =目标 Δ CtHEX_ 参照 Δ CtHEX
每个反应设立2 3个平行管，取平均值进行分析。
结果如图4所示，47份非整倍体标本与200份正常对照在A体系和B体系均没有交叠，可以显著区分，说明此项技术可以很好地进行非整倍体检测。
权利要求
1.基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，其特征在于设有盒体、杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂；所述杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂设在盒体内；所述杂交连接试剂包括LDR混合液、CA连接缓冲液和CA连接酶；所述LDR混合液即96 条杂交探针混合液，每条杂交探针5fmol ；所述CA连接缓冲液即商品化的1 X Taq DNA连接酶缓冲液；所述CA连接酶即IU Taq DNA连接酶； 所述96条杂交探针序列为Hyb-I 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggcgaaacaaaggcaacgc gtctttccac-3‘Hyb-2 5 ‘ -agccaggcagtctgtatcttgcaaaaacatccactctgcctctagattggatcttgctggcac-3^Hyb-3 :5‘ -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggccttgctgcatttacag ggtattc attaag-3‘Hyb-4 :5 ‘ -tgaaattgtgccttgcctgagtgagcttcataaagcgtacacttctagattggatcttgctgg cac-3‘Hyb-5 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccgggctggaaggcctcctaag aggactcaaa-3‘Hyb-6 :5‘ -gtgtcacctccccagagaactctcacatcatgccgcattctgtccctctagattggatcttgc tggcac-3‘Hyb-7 5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccggggattctaccagaaagga atgaagaacagaac-3‘Hyb-8 5' -cttcaggaattgagtcacaatgcagacaaatatctagattggatcttgctggcac-3'Hyb-9 -.5' -gggttccctaagggttggacctcactcagacgggagcctcaccggggctagacgagtgctacg agcgct-3'Hyb-10 -.5' 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OmM MgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTPO. 4mM, 1 μ M 引物-Fl，lyM 引物-R，0. 2μΜ探针-Α，0. 2μΜ探针 _Β，0· 2μΜ探针-C，0· 24 μ M 探针-D, 0. 24μΜ探针-Ε, 0. 24μΜ探针-F ；所述CAPCR混合液B包括IXPCR缓冲液，3. OmMMgCl2, dATP、dCTP、dGTP 各 0. 2mM, dUTP 0. 4mM，1 μ M 引物-F2，1 μ M 引物-R，0. 2 μ M探针-A，0. 2 μ M 探针-B，0. 2 μ M探针-C，0. 24μΜ探针_D，0. 24 μ M探针_Ε，0. 24 μ M探针-F ；所述CA酶混合液包括 IU TaqHS, 0. OlU UNG ；所述引物及探针序列为引物-Fl5'-gggttccctaagggttgga-3‘引物-F25'-tgctgggacgcattgttgata-3‘引物-r 5'-gtgccagcaagatccaatctaga-3‘探针-a 5'-hex-acgggagcctcaccggg-nh2-3探针-b 5'-fam-cggccactccgagggca-nh2-3探针-c 5'-Cy5-GATGGCAGCCTCACAGGT—PO4探针-D 5'-CCGGTGAGGCTCCCGT-dabcyl-3‘探针-e 5'-GCCCTCGGAGTGGCCG-dabcyl-3‘探针-f 5'-CCTGTGAGGCTGCCATC-dabcyl-3‘所述参照试剂包括CA正常对照和CA阴性对照；所述CA正常对照为正常人DNA。
2.如权利要求1所述的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，其特征在于所述CA阴性对照选自H20、Tris-HCl缓冲液、生理盐水中的一种。
3.如权利要求1所述的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，其特征在于所述检测探针是目前用于实时PCR检测的各类探针。
4.如权利要求1所述的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，其特征在于所述检测探针选自TaqMan探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、 LightCycler探针中的一种。
5.如权利要求1所述的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，其特征在于每条染色体设计8对杂交探针，或是其他重数的杂交探针。
6.如权利要求1所述的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，其特征在于所述连接酶是 Ligase-65、T4-DNA Ligase、Ε· coli DNA Ligase 中的一种。
7.如权利要求1所述的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，其特征在于所述缓冲液为1XPCR缓冲液，或其它类型的PCR缓冲液。
8.如权利要求1所述的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒的具体操作步骤如下所述试剂盒的具体操作步骤包括杂交连接反应阶段、实时PCR反应阶段和结果判读阶段I.第一阶段——杂交连接反应阶段1)试剂准备一配液区①首先将杂交连接试剂和参照试剂从冰箱取出并平衡至室温，杂交连接反应液配液标准为取η X 0. 5 μ L LDR混合液、η X 4 μ L CA连接缓冲液和0. 5 μ LCA连接酶加入到1. 5mL 离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒，配好的杂交连接反应液必须贮存在_20°C并在4h内使用；②将配制好的杂交连接反应管装入凹凸袋转移至模板间，贮存在-20°C直至样品变性处理完毕；2)样品DNA变性及加样——杂交连接区①用微量加液器向每支200μL离心管(Axygen)中加入相应20ng/μ L的样品DNA 5 μ L，立即盖严管盖，于98°C变性5min ；②加入杂交连接反应液，样品DNA变性完毕后，杂交连接反应液以每管5μ L分装于步骤①的反应管中，并用加液器反复吹吸混勻；③杂交连接程序可为片段化及变性98°C 5min ；中止(加入杂交连接反应液)25°C预变性95 °C 2min ；杂交连接循环程序(6个循环)70°C 2min ；.68 °C 2min ； 66 °C 2min ； 64°C 2min ； 62 °C 2min ；终止60°CΠ .第二阶段——实时PCR反应阶段1)试剂准备一配液区①首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温，PCR反应液配液标准为取 nX 19. 8 μ LCAPCR混合液A和ηΧΟ. 2 μ L CA酶混合液加入到1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒；另取ηX 19. 8 μ L CAPCR混合液B和ηΧΟ. 2 μ L CA酶混合液加入到另一 1. 5mL离心管中，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒，配好的PCR反应液必须贮存在-20°C并在4h内使用；②PCR反应液的分装，PCR反应液A/B分别以每管20μ L分装于PCR薄壁反应管；③将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至模板间，贮存在-20°C直至样品杂交连接完毕；2)样品的加样——模板间；①杂交连接后的产物需稀释5倍，即用微量加液器向每支已杂交连接的200μ L离心管中加入40 μ L超纯水，振荡混勻数秒，3000rpm离心数秒；②用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的已稀释的杂交连接产物5μ L ；立即盖严管盖；③将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区；3)PCR扩增-扩增区①PCR扩增程序可为 第一步50°C 2min，95°C 3min ；第二步95°C 15s，55°C 20s, 72°C 20s，45个循环，55°C 20s处收集荧光信号，荧光通道选用FAM、HEX和Cy5 ；②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理；III 第三阶段——数据分析阶段数据分析阈值应处于检测标本荧光值的对数上升区，采集该阈值对应的Ct值并按以下公式计算出Δ Δ Ct值A 管检测目标 Δ CtFAM = CtFAM- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3正常参照 ACtFAM = CtFAM- (CtFAM+CtHEX+CtGy5) /3Δ Δ CtFAM =目标 Δ CtFAM-参照 Δ CtFAM同理，Δ Δ Ct觀=目标ACtHEX-参照ACtHEXΔ Δ Ctcy5 =目标 Δ Ctcy5-参照 Δ Ctcy5B 管检测目标 Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5正常参照 Δ CtFAM = CtFAM-CtCY5Δ Δ CtFAM =目标 Δ CtFAM-参照 Δ CtFAM同理，Δ Δ Ct觀=目标ACtHEX-参照ACtHEX每个反应设立2 3个平行管，取平均值进行分析；正常标本即野生型在各体系及各通道中的Δ Δ Ct值范围如下反应体系A和B中Δ ACt值的正常参照范围均为士0. 3 ；Ct值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出的Ct值不在检测标本荧光值的对数上升区时，通过调整基线方法获得Ct值。
全文摘要
基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒，涉及一种染色体非整倍体的定量检测试剂盒。提供一种快速、灵敏、特异，用于临床染色体非整倍体疾病检测的基于实时荧光PCR的染色体非整倍体检测试剂盒。设有盒体、杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂；所述杂交连接试剂、扩增试剂和参照试剂设在盒体内；所述杂交连接试剂包括LDR混合液、CA连接缓冲液和CA连接酶；所述扩增试剂包括CA PCR混合液A、CA PCR混合液B和CA酶混合液；所述参照试剂包括CA正常对照和CA阴性对照。该体系由杂交连接和实时PCR两部分组成。
文档编号C12Q1/68GK102517390SQ20111043786
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者夏敏, 李庆阁, 王小波, 郭奇伟, 黄秋英 申请人:厦门大学