专利名称：墨兰光周期相关基因CsCOL1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种在墨兰中表达的，与光周期相关的CONSTANS-Iike基因-CsCOLl基因及其编码蛋白、含有该基因的重组植物表达载体和CsCOLl基因在促进植物生长发育上的应用。
背景技术：
日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要因素之一。拟南芥是一种典型的长日照植物，长日照能促进拟南芥开花，而短日照则会抑制开花。目前的研究发现，光周期途径中的主要调控基因有CONSTANS(CO)，CRY2/FHA, GIGANTEA (GI)，FT和FWA，它们的突变体在长日照(LD)条件下延迟开花，但在短日照(SD)条件下开花时间与野生型相似。CO是植物光周期信号传导途径中的关键基因，在光受体和生物钟的共同调控下， 基因表达量在一天之内呈节律性变化。Putterill等最早于1995年在拟南芥中找到一个比野生型开花延迟的突变体，然后采用图位克隆的方法分离到了 CO基因，该基因在根和叶中表达，在长日照下CO促使拟南芥开花，但是短日照条件下不起作用。后来，Yano等在水稻中克隆到拟南芥的CO同源基因HD1，HDl突变后水稻对光周期的敏感性降低。CO蛋白是一个转录因子，它不是决定植物开花的最终产物，而是通过调控下游基因FT和SOCl的表达控制开花时间。超表达CO基因后，FT和SOCl的表达量增加，开花时间提前，但是在FT突变体中超表达CO基因效果并不明显，说明CO是依赖于FT来调控植物开花时间。CO位于生物钟输出途径，在生物钟和开花时间之间起着纽带作用。墨兰(Cymbidium.sinense)是兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)中的小花型地生种，其花香馥郁，色泽淡雅，花姿秀美，叶态飘逸，备受欢迎，为我国传统铭花之一，具有很好的市场价值，是产业化最大的国兰。我国对花卉的传统消费期主要集中在春节和其它重要节假日，墨兰的花期自10月至翌年3月，墨兰的消费也主要集中在春节，在其它时间， 由于其不能开花，市场消费也比较有限。要扩大墨兰的产业化还要能够开花应节上市，其商品价值才会更高。影响墨兰生长发育与开花的因子有肥料、基质、温度、光照、激素等，目前生产上还没有墨兰花期调控的技术体系。目前，墨兰花期调控方面的研究比较少，潘瑞炽和叶庆生发现低温可促进墨兰的花芽分化和发育。光照也是影响墨兰花芽分化、花梗生长乃至开花的重要因素。在秋季， 如果光照不足，其花芽分化会推迟，且分化的花芽数量减少；光照的强弱对墨兰的花色也有明显的影响，若光线不足，则花色黯淡；光线较强时，则花色鲜艳，但光照过强也会使花色变淡，而且会使花期缩短(朱根发和郭振飞，2004)。因此，在墨兰的花期调节中应适时的给予适当的光照才能保证正常花芽分化和开花，甚至提早开花。但光照影响墨兰开花的分子机理尚无报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种在墨兰中表达的、与光周期相关的CONSTANS-Iike基因-CsCOLl基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第40位到1020位碱基所示，及其编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示和含有CsCOLl基因的重组植物表达载体。本发明以墨兰“企剑白墨”(Cymbidium.sinense ‘Qi Jian Bai Mo，)的花芽为材料，提取其总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA第一链，以该cDNA第一链模板，根据 CONSTANS-Iike的同源基因保守区域设计引物，利用RT-PCR和RACE的方法扩增拼接获得全长cDNA序列，该cDNA序列长度为1186bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，其开放阅读框为自 5，端第40位至第1020位碱基，共981bp，将此开放阅读框命名为CsCOLl基因，其编码3 个氨基酸，其序列如SEQ ID NO. 2所示，将该蛋白命名为CsCOLl蛋白。将墨兰的CsCOLl编码的蛋白质序列用ClustalW2分析其同源性，结果如图1所示，图1显示CsCOLl蛋白具有两个保守的B-box-type锌指域和一个CCT域，它与蝴蝶兰的 PhalCOL同源性最高，为84 85%;与水稻Hdl、拟南芥AtCO的同源性分别为42%和38%。 由此可见，CsCOLl基因是一个新的光周期关键基因CONSTANS-like。本发明人将上述CsCOLl基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导，将含有 CsCOLl基因的重组植物表达载体转化到烟草中，经组织培养成含有CsCOLl基因的转基因烟草。实验发现，该转基因烟草与野生型烟草相比，转基因烟草比野生型烟草提前开花， 10个转化株的平均开花时间为49天，而野生型的平均开花时间为63天。由此表明，外源 CsCOLl基因为具有功能的结构基因，其在宿主烟草中实现了超量表达，促进了转基因烟草生殖生长，从而缩短了开花时间，因此该基因能影响植株的发育。从上述结果分析可以表明，本发明的CsCOLl基因是一个新的与光周期相关的 CONSTANS-like基因，该基因能促进植物生殖生长，缩短开花时间，从而影响植株的发育。因此本发明的第二个目的是提供CsCOLl基因在缩短植物童期，促进植物开花中的应用。所述的植物优选为烟草或墨兰。本发明的CsCOLl基因与植物表达载体连接，通过农杆菌介导进入植物细胞、组织或器官，通过组织培养成转基因的植物转化体，从而实现缩短植物童期生长期，促进植物开花。所述的植物表达载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如PBI系列载体、pBin系列载体、Gateway 系列载体、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体等，上述载体均为公开销售的商品。本发明首次从墨兰中克隆的CONSTANS-like基因-CsCOLl基因，并且通过实验证明该基因能够影响植物生长发育进程，促使植物提前开花。因此，本发明提供的墨兰CsCOLl 基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。
图1是墨兰CsCOLl基因编码的氨基酸序列与CONSTANS-like同源基因的氨基酸序列比较图，其中拟南芥AtCO (Acc. No. NP_197088)，拟南芥AtCOLl (Acc. No. NP_197089. 1)，拟南芥 AtC0L2(Acc. No. NP_186887. 1)，拟南芥 AtC0L3 (Acc.No. NP_973530. 1)，水稻 Hdl (Acc. No. ABB17664)，大麦 HvCOL (Acc. No. AAM74069)，蝴蝶兰 PhalCOL ((Acc. No. FJ469986)，具有一致性和相似性的氨基酸分别用黑色和灰色阴影表示， CONSTANS-Iike基因的B_box域和CCT域在序列上用横线注明；图2是通过Real-time PCR检测CsCOLl基因在墨兰营养器官根、茎、叶中的表达量，其中横坐标中1为根；2为假鳞茎；3为叶；纵坐标代表相对表达量的高低；图3是通过Real-time PCR检测CsCOLl基因在墨兰花梗、花蕾及花器官花柄、萼片、花瓣、唇瓣、柱头、茎、叶中的表达量，其中横坐标中1为花梗；2为花柄；3为花蕾；4为萼片；5为花瓣；6为唇瓣；7为柱头；纵坐标代表相对表达量的高低；图4是表达载体pBI121-35s_CsC0Ll转化农杆菌的PCR鉴定图，其中M为Marker 2000,1-11为筛选到的阳性克隆、12为连接载体pBI121-3k-CsC0Ll质粒阳性对照；13为空载体质粒PBI121阴性对照；图5是转基因(CsCOLl)烟草的PCR鉴定图，其中M为Marker 2000、2_10为CsCOLl 转基因烟草株系；1为连接载体pBI121-3k-CsC0Ll质粒阳性对照；CK为野生型烟草阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。 如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。实施例1 一、墨兰CsCOLl基因的克隆及其同源性分析。(1)以墨兰品种“企剑白墨”(Cymbidium sinense. ‘Qi Jian Bai Mo，)为试验材料，植物材料在温室正常条件下生长(L/D，14h/10h ；25-28°C )。(2) RNA提取用Trizol reagent (购自hvitrogen公司)进行试验材料的总RNA 提取，整个操作过程严格按照Trizol试剂的RNA提取流程说明。(3)采用M-MLV反转录酶(购自ftOmgra公司)逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明书进行。基因的克隆以逆转录的墨兰花芽cDNA第一链为模板，根据CONSTANS-Iike同源基因的保守序列设计两个正向特异引物C0-3A和C0-3B，采用3’-RACE方法扩增获得348bp 的3端序列。引物为C0-3A :GGAGGCNAGGGTBHTGAG ；C0-3B GARVAAGAVBMGGMRGTTYGAG采用Golden DNA polymerase (TIANGEN)进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，第一轮PCR反应程序为94°C预变性^iin ；94°C变性30s，56°C退火45s，72°C延伸lmin， 共进行20个循环；72°C延伸lOmin。第二轮PCR反应程序为94°C预变性^iin ；94°C变性 30s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共进行；35个循环；72°C延伸lOmin，4°C终止反应。根据企剑白墨COL 3’端核苷酸序列，设计两条指向5’端的特异引物C0-5A和 C0-5B，采用5，-RACE方法扩增获得获得目的片段大小为929bp。
引物为C0-5A 5-GAACGACGCCGTAGCCTTGAACTGC-3C0-5B 5-GACTCCACTTCCGTCCGCTTCGCAA-35，端序列 PCR 扩增反应程序为采用 Golden DNA polymerase (TIANGEN)进行 PCR 扩增，加样体系参照酶的说明书，第一轮PCR反应程序为95°C变性lmin，接着5个循环反应 (940C 30s, 72°C 2min)，再接着 5 个循环反应(94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 1. 5min)，最后 25 个循环反应(94°C 30s，68°C 30s，72°C 1. 5min)，72°C延伸 lOmin，4°C终止反应。第二轮 PCR 反应程序为95°C 预变性 lmin，接着 30 个循环反应(94°C 30s, 68 °C 30s, 72 °C 1. 5min),72°C 延伸10min，4°C中止反应。将5，端和3，端序列拼接获得全长cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 该序列长度为1186bp，该序列的开放阅读框为SEQ ID NO. 1的自5，端第40位至第1020位碱基，共981bp，将该开放阅读框命名为CsCOLl基因，该基因编码由3 个氨基酸残基组成的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示，蛋白质的pI/Mw分别为5. 93/34375. 7。利用 SMART程序在线预测，CsCOLl基因编码的蛋白均无跨膜结构与信号肽，为水溶性蛋白。应用 NCBI中的CDD程序对其进行氨基酸结构域分析，结果显示它含有两个B-box型锌指结构域和一个CCT结构域。将墨兰CsCOLl基因编码的氨基酸序列用ClustalW2分析其同源性，结果显示它与蝴蝶兰的WialCOL同源性最高，为84 85% ；其次是大麦的C0L，为49% ；与拟南芥的AtC0L3、水稻的Hdl的同源性分别为43 44^^42% ；与拟南芥AtCO的同源性较低，为38% (见图1)。二、墨兰CsCOLl基因表达模式分析在墨兰的营养生长期和生殖生长期，用Trizol reagent (Invitrogen)分别提取墨兰植株的根、假鳞茎、叶片、花蕾、花梗以及不同的花器官的总RNA，用DNase I (Takara) 处理除去基因组DNA，测定0D260后定量取出2yg RNA。然后再使用oligo-dT引物和 PrimeScript Reverse Transcriptase (购自Takara公司)进行逆转录反应(方法参考说明书)。根据企剑白墨CsCOLl基因序列以及内参ACTIN序列设计跨内含子特异引物，引物序列如下qC0-F 5' -TGGGAGGAAAAGGAGCAGAA-3，；qC0-R 5' -CGCCCGACAGAATAGAACC-3，；qACT-F 5' -TTTATGAGGGTTATGCGCTTCC-3，；qACT-R 5’ -ATTTCCCGTTCCGCAGTAGTT-3’。将所得cDNA稀释5倍后作为模板，进行实时定量RT-PCR反应。反应体系及程序参照SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa)说明书，在ABI 7500 Real-time PCR仪上进行反应。每个反应设四次重复，所得数据使用ABI 7500 Real-time PCR system软件进行处理。分析CsCOLl基因在企剑白墨不同器官中的表达特征，结果如图2所示，图2显示 CsCOLl基因在植株的根、茎、叶中都有表达，但在叶片中的表达强度要明显高于在根和茎中的表达，在根中的表达最弱；植株开花后，CsCOLl基因在花梗、花蕾以及不同的花器官中也都有表达(图3)，其中在花瓣和萼片中的表达强度要明显高于在其它器官中的表达。三、墨兰CsCOLl基因在烟草中的表达及转基因植株的表型鉴定(1)含目的基因CsCOLl表达载体的构建
以前面逆转录得到的cDNA为模板，使用Takara公司的LA Taq酶进行扩增，反应体系按说明书，扩增引物为CsCO-F :5’ -AATGGATCCATGGGAGGAAAAGGAGCAGAAGGC-3，；CsC0-R-5，-CATGGATCCTTAGAAAGATGGAACGACGCCGTA-3，。反应程序为94°C 4min ；94°C 30sec，53°C 45sec，72°C 2min, 35cycles ；72°C 5min。扩增产物经琼脂糖电泳，胶回收测序，确定得到CsCOL 1基因，将扩增得到的 CsCOLl基因与Takara公司的pMD18_T载体连接，转化进入大肠杆菌中(具体流程参见T载体的说明书)。提取含有CsCOLl基因的T载体质粒，利用酶切位点BamH I将CsCOLl基因从T载体上切下并纯化，植物表达载体PBI121用BamH I酶切后磷酸化处理，再与酶切纯化后的 CsCOLl基因连接，连接酶用T4DNA Ligase (购自Takara公司)，具体操作按说明书方法进行，构建获得含有目的基因CsCOLl基因的表达载体pBI121-3k-CsC0Ll。(2)将重组质粒表达载体PBI121-35S-CSC0L1采用电击法转化到根瘤农杆菌 LBA4404 中。>取1 μ 1重组质粒表达载体pBI121-3k-CsC0Ll与刚制好的农杆菌LBA4404感受态细胞混勻，冰上放置lOmin。>将此混合物转移至已预冷的电极杯电击。>向电击杯中加入1000 μ 1的YM液体培养基，重悬细胞后，转移到1. 5ml的离心管中，28°C，220-250rpm复苏2_4小时。所述的YM液体培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。>将转化产物涂布于YM+Kan (卡那霉素)50mg/L+硫酸链霉素25mg/L的平板上，放于28 V培养箱培养48小时。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为CsCO-F和CsCO-R，菌落PCR 鉴定如图4所示，其中1 11为筛选到的阳性克隆、12为连接载体pBI121-3k-CsC0Ll质粒阳性对照；13为空载体质粒pBI121阴性对照。从图4可以看出，阳性克隆1 11都扩增出CsCOLl基因片段，由此说明表达载体pBI121-3k-CsC0Ll转入了阳性克隆1 11根瘤农杆菌LBA4404中。选取转入了表达载体pBI121-3k-CsC0Ll的根瘤农杆菌LBA4404克隆作为阳性克隆。(3)利用叶盘法转化烟草>挑取阳性克隆，接种于含有Kan (卡那霉素)50mg/L和硫酸链霉素25mg/L的YM 液体培养基中，28°C 200rpm振荡培养24_3乩，使OD6tltl = 0. 5左右。>将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，15min离心收集菌种，再用同等体积
的MS液体培养基悬浮菌种，准备浸染叶片。所述的MS培养基是本领域常用培养基，其配方参考(Murashige T and Skoog F，1962)。>于无菌条件下将烟草无菌苗的成熟叶片除去叶边缘，切成0. 5X 1. Ocm的小块， 浸泡在制备好的菌液中。> IOmin后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，放在含有质量分数为3%蔗糖和质量分数为0. 6-0. 7%琼脂的MS培养基中，置于对士 1 ！光照培养箱中，14h光照/IOh黑暗条件下共培养48小时。
>当看到叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时，将叶片转移至不加激素的MS 液体培养基中，于观士 TC恒温摇床上振荡漂洗45-60min，夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基。>将叶片转入生芽筛选培养基，置于光照培养箱中，14h光照/IOh黑暗条件下培养，所述的生芽筛选培养基是每升MS培养基中含有500mg Carbenicillin (羧苄青霉素)、300mg Kanamicine (卡那霉素)、0. ImgNAA ( α-萘乙酸)、1. Omg BA (6-苄基腺嘌呤)、 0. 59g MES [2-(N-吗啉代)乙磺酸]、30g 蔗糖、6_7g 琼脂、pH 5.7-5.8;>约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下并转入生根培养基进行筛选，置于对士 1 ！光照培养箱中，14h光照/IOh黑暗条件下培养筛选，所述的生根培养基为每升MS培养基含有 200mg CarbenicillinUOOmg Kanamicine、15g 蔗糖和 6_7g 琼脂、pH 5. 7-5.8;>待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，温室中培养而得到转基因植株。(4)转基因植株的分子鉴定。DNA 的提取采用 Takara 的 “Universal Genomic DNA Extraction Kit”。以转基因植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，在pBI121载体中CaMV35S区段上设计正向引物P35S GAAACCTCCTCGGATTCCAT, CsCO-R为反向引物进行PCR扩增鉴定，用1 %琼脂糖凝胶电泳进行检测。其中M为Marker 2000,2-10为CsCOLl转基因烟草株系；1为连接载体 pBI121-35s-CsC0Ll质粒阳性对照；CK为野生型烟草阴性对照。由图5可以看出，1_10都有与目的基因(981bp) +490bp大小一致的片段，而野生型植株CK没有检测到相应的片段， 表明携带有外源墨兰CsCOLl基因的表达质粒已经插入到烟草基因组中。(5)转基因植株进行表型鉴定。将上述携带有外源墨兰CsCOLl基因的表达质粒的转基因烟草植株和野生型烟草同等条件下进行培养，与野生型烟草相比，转基因烟草比野生型烟草提前开花，同等培养条件下，野生型烟草需要63天开花，而转入CsCOLl基因的烟草只需要49天开花。根据结果表明，外源CsCOLl基因在宿主烟草中实现了超量表达，从而缩短了开花时间。试验结果表明，墨兰CsCOLl基因为有功能的基因，可以影响植株的发育，具有促进生殖生长，缩短开花时间的作用。由上述结果分析表明，本发明的CsCOLl基因是一个新的与光周期相关的 CONSTANS-Iike基因，该基因能促进植物的生殖生长，缩短开花时间，从而影响植株的发育。
权利要求
1.一种墨兰光周期相关的CsCOLl基因，其特征在于，所述的CsCOLl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第40位到1020位碱基所示。
2.一种由权利要求1所述的CsCOLl基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ IDN0. 2 所示。
3.一种含有权利要求1所述的CsCOLl基因的重组植物表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组植物表达载体，其特征在于，所述的植物表达载体为pBI 系列载体、PBin系列载体、Gateway 系列载体或pCAMBIA系列载体。
5.权利要求1所述的CsCOLl基因在缩短植物童期，促进植物开花中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物为烟草或墨兰。
全文摘要
本发明公开一种墨兰光周期相关基因CsCOL1及其应用。CsCOL1基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第40位到1020位碱基所示，及其编码蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示和含有CsCOL1基因的重组植物表达载体，还有CsCOL1基因在缩短植物童期，促进植物开花中的应用。本发明首次从墨兰中克隆的CONSTANS-like基因-CsCOL1基因，并且通过实验证明该基因能够影响植物生长发育进程，促使植物提前开花。因此，本发明提供的墨兰CsCOL1基因为基因工程改良植物的生长进程，对植物的花期进行调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。
文档编号C12N15/82GK102559699SQ20111043899
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者吴坤林, 张建霞, 曾宋君, 段俊, 田瑞雪 申请人:中国科学院华南植物园