一种快速检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因及其剪切突变体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及血液病分子生物学领域，尤其设及一种快速检测慢性粒细胞白血病 BCR/A化融合基因及其剪接突变体的方法。
【背景技术】
[000引慢性粒细胞白血病是造血组织的恶性肿瘤，BCR/A化融合基因及其不同突变体的 检测是该病诊断、病情监测、预后及指导治疗的一个关键指标。目前的检测方式很难同时检 测该基因的不同突变体，大多只能检测其中一个基因，且检出率低，耗费时间较长。
[0003] 因此，现有技术有待于改进。
【发明内容】
[0004] 本发明为了解决现有技术的不足，提供一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL 融合基因的方法，采用多重巢式PCR方法，短时间内快速检测出BCR/A化融合基因及其不同 突变体。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明实施例提供的一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ 融合基因的方法，采用如下技术方案：
[0006] 一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/A化融合基因的方法，其特征在于，包括如 下步骤：
[0007] (1) A液；特异性逆转录引物
[000引 引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀释混匀，浓度为2. 5pmol/ y 1 ;
[0009] B液；巢式第一轮PCR反应液500 y 1 (20测试）；
[0010] 包含引物为；80?-1、80?-3、48心1、624-1、624-3;
[00川 第一轮多重PCR引物lOOpmol/条，缓冲体系为；Tris-肥L (P服.3) 8. 8MM、K化 44MM、dNTPs 0. 16MM/each、Mg化21.32MM。储存于-20°C，备用；
[001引 C液；巢式第二轮PCR反应液500 y 1 (20测试）；
[0013] 包含引物为；80?-2、80?-4、48心2、624-2、624-4;
[0014] 各组第二轮多重PCR引物125pmol/条，反应缓冲体系为；Tris-肥L(PH 8. 3) 9. 6MM、K化 48MM、dNTPs 0. 192MM/each、Mg化2I. 44MM，储存于-20°C，
[00巧]D液：阴性对照（阳性内对照）健康人外周血单个核细胞cDNA溶液，
[0016] E液：阳性对照-BCR/ABL b3a2阳性K562细胞系cDNA溶液，
[0017] F液：阳性对照-BCR/ABL ela2阳性患者cDNA溶液，
[001引 G液：阳性对照-BCR/ABL b2a2阳性患者cDNA溶液；
[0019] (2)采用广泛表达的转录因子增强子结合因子基因（E2A)的mRNA作为阳性内对 昭. y >、、 》
[0020] 做巢式第一轮PCR(25 y 1体系）；各取患者cDNA、阴性对照D液和阳性对照E液 2^1，各取6液22111^39〇臟聚合酶0.5^1(1.25巧，口0?条件为；951：5111111后，951：变性 30s，58°C退火30s，72°C延伸lOmin，共30个循环，结束反应；
[002U (4)巢式第二轮PCR(25ul体系）；各取C液22yl，相应的第1轮PCR产物2yl， Taq DM聚合酶0. 5 y 1 (1. 25U)。PCR反应条件同第一轮。
[0022] 本发明提供的一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/A化融合基因的方法，采用特 异性的反转录引物，提高转录效率，采用多重巢式PCR方式增加PCR效果，较短时间内快速 检测出BCR/A化融合基因及其不同突变体，为疾病的早期诊断及祀向治疗提供依据。
【附图说明】 图1为BCR/A化融合基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳邸染色后紫外灯下成像结果。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合本发明实施例提供的快速检测慢性粒细胞白血病BCR/A化融合基因的 方法进行详细描述。
[0024] 如图1所示，本发明实施例提供的一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/A化融合 基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[002引 （1) A液；特异性逆转录引物
[0026] 引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀释混匀，浓度为2. 5pmol/ y 1，
[0027] B液；巢式第一轮PCR反应液500 y 1 (20测试）；
[002引 包含引物为；BCR-1，BCR-3, ABkl，E2A-1，E2A-3，
[0029] 第一轮多重PCR引物lOOpmol/条，缓冲体系为；Tris-肥L(地8. 3)8. 8MM、K化 44MM、dNTPs 0. 16MM/each、Mg化21.32MM。储存于-20°C，备用，
[0030] C液；巢式第二轮PCR反应液500 y 1 (20测试）；
[003U 包含引物为；BCR-2, BCR-4, ABk2, E2A-2, E2A-4，
[003引各组第二轮多重PCR引物125pmol/条，反应缓冲体系为；Tris-肥L(地 8. 3) 9. 6MM、K化 48mm、dNTPs 0. 192MM/each、Mg化21. 44MM，储存于-20°C，
[003引 D液：阴性对照（阳性内对照）健康人外周血单个核细胞cDNA溶液，
[0034] E液：阳性对照-BCR/ABL b3a2阳性K562细胞系cDNA溶液，
[003引 F液：阳性对照-BCR/ABL ela2阳性患者cDNA溶液，
[0036] G液：阳性对照-BCR/ABL b2a2阳性患者cDNA溶液；
[0037] (2)采用广泛表达的转录因子增强子结合因子基因（E2A)的mRNA作为阳性内对 照；
[00測 做巢式第一轮PCR(25 y 1体系）；各取患者cDNA、阴性对照D液和阳性对照E液 2yl，各取 B 液 22yl，Taq DNA 聚合酶 0. 5yl(1.25U)，PCR条件为；95°C 5min 后，95°C 变 性30s，58°C退火30s，72°C延伸lOmin，共30个循环，结束反应；
[0039] (4)巢式第二轮PCR(25y 1体系）；各取C液22y 1，相应的第1轮PCR产物2y 1， Taq DM聚合酶0. 5 y 1 (1. 25U)。PCR反应条件同第一轮。
[0040] 实施例；
[0041] 1.骨髓单个核细胞（MNC)分离；
[0042] (1)取5ml淋己细胞分离液加入干净试管中，将5ml生理盐水稀释骨髓液或患者外 周血小屯、地加到分离液上，勿使界面混合，离屯、15(K)巧mX 20分钟（min),轻轻吸出中间层 的单个核细胞（MNC)。
[004引 （2)加入10ml生理盐水，混匀，离屯、12(K)巧mXlOmin，弃去上清。
[0044] (3)吸尽残留液体，置-70°C保存或直接进行下一步操作。
[0045] 2. RNA 的提取
[0046] (1)从-7〇°C冰箱取出MNC，立即加入Trizol试剂1ml，反复吹打混匀，置室温5分 钟，使细胞溶解。
[0047] 似加S氯甲烧0. 2ml，剧烈振摇30秒钟，置室温3分钟，离屯、12000巧mX 15min
[0048] (3)仔细吸取上层水相，转移至另一 EP管中，加入0. 5ml异丙醇，颠倒混匀3~4 次，置室温10分钟。离屯、120(K)巧mX lOmin，可见针尖大小沉淀即总RNA。
[0049] (4)弃上清，加75%己醇0. 5ml，摇振，充分洗漆沉淀，离屯、12000巧mX5min。
[0050] 妨彻底吸去上清，沉淀置于37°C干燥5min，加入20-40 y 1 DEPC水溶解沉淀。
[(K)川 3.逆转录脚）反应
[0化引 取12yl总RNA，加入lyl A液，混匀后置于PCR仪上，70°C，5分钟。立即置 于-20°C冰箱中，3min 后取出，加入 1 y 1 RNasin(20U/ y 1)、1 y ldNTPs(10mM/each)、4 y 1 5XRT BufferU y 1 M-MLV逆转录酶（200U/ y 1)，总反应体积为20 y 1，混匀，在PCR仪上， 37°C 45分钟，温育结束后进行下一步操作或置于-20°C保存。
[005引 4.多重巢式PCR
[0化4] 采用广泛表达的转录因子增强子结合因子基因（E2A)的mRNA作为阳性内对照。
[0055] 巢式第一轮PCR(25 y 1体系）；各取患者cDNA、阴性对照D液和阳性对照E液 2yl，各取 B 液 22^1，化9 DNA 聚合酶0. 5yl(1.25U)。PCR条件为；95°C 5min 后，95°C 变 性30s，58°C退火30s，72°C延伸lOmin，共30个循环，结束反应。
[0056] 巢式第二轮PCR(25yl体系）；各取C液22yl，相应的第1轮PCR产物2yl，I'aq DM聚合酶0. 5 y 1 (1. 25U)。PCR反应条件同第一轮。
[0057] 5. PCR扩增产物分析
[0化引 1 %琼脂糖凝胶恒压100伏电泳40min，邸染色，紫外灯下观察并照相。
[0059] 6.结果判读：
[0060] 根据表3,判读患者的BCR/A化融合基因的不同剪接体。图1为阴性对照（阳性内 对照）、阳性对照-BCR/ABL b3a2阳性K562细胞系、BCR/ABL b3a2阳性患者、BCR/ABL ela2 阳性患者、BCR/ABL b2a2阳性患者检测结果。
[0061] 表1.特异性逆转录引物
[0062]
【主权项】
1. 一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因及其不同剪接突变体的方法，其 特征在于，包括如下步骤： (1) A液：特异性逆转录引物 引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀释混匀，浓度为2. 5pmol/ μ 1 (引物序列 见表1); B液：巢式第一轮PCR反应液500 μ 1 (20测试）： 包含引物为出0?-1、80?-3、481^-1324-1324-3;(引物序列见表2) 第一轮多重 PCR 引物 IOOpmol/条，缓冲体系为：Tris-HCL(PH8. 3)8. 8ΜΜ、KCL 44ΜΜ、 dNTPs 0.16MM/each、MgCL2 1.32MM，储存于-20°C，备用。 C液：巢式第二轮PCR反应液500 μ 1 (20测试）： 包含引物为出0?-2、80?-4、六81^-232六-232六-4;(引物序列见表2) 各组第二轮多重？〇?引物125?111〇1/条，反应缓冲体系为：1^8-!0^(?!18.3)9.6丽、1((^ 48mm、dNTPs 0· 192MM/each、MgCL2 I. 44ΜΜ，储存于-20°C，备用。 D液：阴性对照（阳性内对照）健康人外周血单个核细胞cDNA溶液； E液：阳性对照-BCR/ABL b3a2阳性K562细胞系cDNA溶液； F液：阳性对照-BCR/ABL ela2阳性患者cDNA溶液； G液：阳性对照-BCR/ABL b2a2阳性患者cDNA溶液； (2) 采用广泛表达的转录因子增强子结合因子基因（E2A)的mRNA作为阳性内对照； (3) 巢式第一轮PCR(25 μ 1体系）：各取患者cDNA、阴性对照D液和阳性对照E液2 μ 1， 各取8液2241，了39〇嫩聚合酶0.5以1(1.25扔，？0?条件为：95°〇51^11后，95°〇变性3〇8， 58°C退火30s，72°C延伸lOmin，共30个循环，结束反应； (4) 巢式第二轮PCR(25μl体系）：各取C液22μl，相应的第l轮PCR产物2 μl，Taq DNA聚合酶0. 5 μ I (I. 25U)。PCR反应条件同第一轮。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪切突变体的方法，采用特异性的反转录引物，提高反转录效率，采用多重巢式PCR方式增加PCR效果，较短时间内快速检测出BCR/ABL融合基因及其不同剪切突变体，为疾病的早期诊断及靶向治疗提供依据。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104630343
【申请号】CN201410725610
【发明人】高广勋
【申请人】中国人民解放军第四军医大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年12月5日