专利名称：慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于血液肿瘤免疫治疗技术领域，特别涉及一种慢性粒细胞白血病DNA疫 苗BCR/ABL-p IRES-SEA及其制备方法和应用。
背景技术：
目前，对于慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia, CML)的治疗 主要有传统化疗、IFN-α和酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗等。虽然这些治疗方法已经能够 在很大程度上提高患者的生存质量，患者的预后也有了较大改善，但肿瘤的微小残留病变 (minimal residual disease,MRD)却很难被现行治疗方案根除。造血干细胞移植虽然能够 根除MRD，但骨髓来源少，配型成功率低，高昂的移植费用以及严重的移植相关并发症限制 了该疗法的推广。由于许多白血病患者体内都存在由于染色体易位所形成的融合基因，利 用融合基因作为诱导产生特异性抗白血病治疗的靶点已经成为众多研究人员追求的目标。 由于体外表达的蛋白不一定具有与体内蛋白一致的天然构象，而且外源蛋白进入体内后以 诱导体液免疫反应为主，而DNA疫苗则能够有效地克服这些缺陷，同时诱导体液免疫和细 胞免疫。在常规治疗结束后辅以CML特异的DNA疫苗治疗是有希望根除MRD的方法之一。BCR/ABL融合基因是CML发病以及应用酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼治疗有 效的分子基础，是一个特异的白血病抗原。表达BCR/ABL融合基因的细胞可诱导T细胞克隆 性增殖，提示该细胞内的融合蛋白可以被MHC分子加工和提呈到细胞表面，因此可以利用 BCR/ABL融合蛋白或融合基因诱导机体产生特异性免疫应答，或者诱导机体产生针对BCR/ ABL的特异性CTL，达到免疫治疗的目的。Ji等研究发现利用跨越BCR/ABL融合基因的融合 点的基因片段构建的DNA疫苗能够在小鼠体内诱导产生特异性免疫保护作用。利用BCR/ ABL融合基因制备DNA疫苗是有希望根除CML的MRD的方法之一。但单独的多肽疫苗所产生的免疫效应较弱，寻找合适的免疫佐剂成为临床实际 应用必须要解决的重点所在。超抗原可与抗原提呈细胞表面的MHC-II类分子及TCRVii 区⑶R3外侧区域结合，而不涉及TCRV β区⑶R3及TCR α的识别，这种激活T细胞的独特 方式可产生极强的免疫应答。目前较有研究基础的超抗原主要是金黄色葡萄球菌肠毒素 A (Staphylococcal Enterotoxin A, SEA)等，SEA强大的T细胞激活功能使其成为CML免疫 治疗的佐剂。目前对于制备BCR/ABL基因疫苗特异性目的基因的选择尚无定论，如何筛选出具 有最佳免疫原性的BCR/ABL基因片段仍是此类研究所面临的核心问题。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种慢性粒细胞白血病 DNA疫苗BCR/ABL-p I RES-SEA。该DNA疫苗BCR/ABL-p IRES-SEA是能够在真核细胞内同时 表达BCR/ABL和SEA蛋白的质粒。
本发明的另一目的在于提供上述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA 的制备方法。本发明的再一目的在于提供上述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA 的应用。所述用于慢性粒细胞白血病特异免疫治疗的DNA疫苗是一种能够在真核细胞中同 时表达BCR/ABL蛋白和SEA蛋白的DNA疫苗，它能够诱导CML患者机体产生针对CML细胞 的特异性CTL，从而清除患者体内的微小残留病变，达到治愈CML的目的。 本发明的目的通过下述技术方案来实现一种慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ ABL-pIRES-SEA，含有pIRES质粒、BCR/ABL基因和SEA基因，BCR/ABL基因和SEA基因分别 位于PlRES质粒上的IRES元件两侧的多克隆位点上；其中，pIRES质粒为商业性的质粒，含 有多克隆位点A(MCS Α)、多克隆位点B(MCS B)和IRES元件，MCS A和MCS B分别位于IRES 元件的两侧，BCR/ABL基因可以位于MCS A或MCS B上，SEA基因可以位于MCS A或MCS B 上；所述BCR/ABL基因(大小为336bp)的核苷酸序列如下
ATGGGGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAA
TGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCTAGATG为启始密码子，TAG为终止密码子；所述SEA基因(大小为774bp)的核苷酸序列如下
ATGAAAAAAACAGCATTTACATTACTTTTATTCATTGCCCTAACGTTGACAACAAGTCCACTTGTAAATGGTAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTAAAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCTTTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTGTTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATAATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATACAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATCTTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATGGGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCTTCGGTTAATTACGATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGATAATAAAACGATTAACTCTGAAAACATGCATA
TTGATATATATTTATATACAAGTTAA；所述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA的制备方法，包括如下步 骤 (1)将BCR/ABL基因插入pIRES质粒的多克隆位点A或多克隆位点B中，得到BCR/ABL-p IRES 质粒；(2)将SEA基因插入BCR/ABL-pIRES质粒的多克隆位点中，SEA基因与BCR/ABL基因分别位于IRES元件的两侧，得到慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA ；所述的制备方法，更优选包括如下步骤(1)提取白血病细胞株K562细胞的RNA通过逆转录合成cDNA ；将得到的cDNA为 模板，通过引物Bl和B2 PCR扩增出大小为354bp的BCR/ABL片段所述的引物Bl 5ATTlCTCGA^TGGGGCTCTATGGGTTTCTG-3‘；所述的引物B2 :5,-GCC0AATTCK:TAGATGTAGTTGCTTGGGAC-3,；所述的BCR/ABL片段(354bp)如下所示
att|ctcgag|atggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACA
τοταφααττφ ο；其中，粗体ATG为起始密码子；粗体TAG为终止密码子；方框内所述的CTCGAG为XhoI酶切位点；方框内所述的GAATTC为EcoRI酶切位点；(2)以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，通过引物Sl和S2 PCR扩增出大小为 827bp的SEA片段；所述的引物Sl :5’-GC[TCTAdX|AATTATGCTTTAGAGGTGAG-3，;所述的引物S2 :5'-CG^TCGAC|TCAACTACCATGTTTAACTTG-3'；所述SEA片段(大小为827bp)序列如下
gcfrctaga|aattatgctttagaggtgagcaaaatgaaaaaaacagcatttacattacttttattcattGCCCTAACGTTGACAACAAGTCCACTTGTAAATGGTAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTAAAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCTTTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTGTTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATAATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATACAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATCTTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATGGGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCT
TCGGTTAATTACGATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGA
taataaaacgattaactctgaaaacatgcatattgatatatatttatatacaagttaaacatggtagt
tga|gtcgac^g；其中，粗体ATG为启始密码子；粗体TAA为终止密码子；方框内所述的TCTAGA为XbaI酶切位点；
方框内所述的GTCGAC为SalI酶切位点；(3)用XhoI酶和EcoRI酶分别将pIRES质粒和步骤(1)所述的BCR/ABL片段进 行双酶切，再通过T4 DNA连接酶将双酶切后的BCR/ABL片段和pIRES质粒进行连接，BCR/ ABL片段插入至pIRES质粒的多克隆位点A中，得到BCR/ABL-pIRES质粒；(4)用XbaI酶和Sal I酶分别将步骤⑵得到的SEA片段和步骤(3)得到的 BCR/ABL-pIRES质粒进行双酶切，然后通过T4 DNA连接酶将双酶切后的SEA片段和BCR/ ABL-pIRES质粒进行连接，SEA片段插入到BCR/ABL-pIRES质粒的多克隆位点B中，得到慢 性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-p I RES-SEA。所述步骤(I)PCR扩增反应条件为预变性94°C 30sec，退火60°C 30sec ；延伸 72°C 30sec，共进行30个循环；首次预变性为94°C 4min，末次延伸为72°C IOmin ； 所述步骤⑵PCR扩增反应条件为首先94 V预变性4min，然后94 °C lmin, 50°C lmin，72°C Imin 循环 30 次，最后 72°C总延伸 IOmin0所述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA可应用于制备治疗慢性粒细 胞白血病的基因药物。本发明与现有技术的相比，具有如下优点和有益效果(1)本发明所述的慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA是一个能够在 真核细胞内同时表达BCR/ABL和SEA蛋白的质粒，将该DNA疫苗注射到小鼠体内能够表达 BCR/ABL和SEA蛋白，激发机体产生针对CML细胞的特异性CD8+T细胞，并伴有细胞因子分 泌增加，可以达到根除患者体内的微小残留病变的目的。本实验结果表明本发明所克隆的 BCR/ABL片段是有效的免疫片段，且SEA基因能有效地增强BCR/ABL片段的免疫效应，BCR/ ABL-pIRES-SEA双基因DNA疫苗可应用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物。(2)本发明提供了 一个可以诱导产生特异性抗CML免疫效应的BCR/ ABL-pIRES-SEA双基因DNA疫苗，为治疗CML的DNA疫苗的研发提供重要的数据和资料。(3)本发明利用肿瘤相关抗原或肿瘤特异抗原与超抗原基因共同构建DNA疫苗) 还可以为其他治疗性肿瘤DNA疫苗的研究所借鉴。(4)本发明的DNA疫苗能通过促进机体的特异细胞免疫和体液免疫功能而清除 CML患者体内的微小残留病变，最终达到治愈CML的目的。
图1为BCR/ABL-pIRES-SEA双表达质粒构建流程图。图2为PCR扩增获得的BCR/ABL片段图；其中泳道1 为 150bp DNA Marker ；
泳道2和3为PCR扩增得到的BCR/ABL片段。图3为PCR扩增获得的SEA片段的电泳检测图；其中泳道1 为 150bp DNAMarker ；泳道2和3为PCR扩增得到的SEA片段。图4为BCR/ABL-pIRES重组质粒酶切鉴定结果图；其中，泳道1 为 Ikb DNA marker ；泳道2为pIRES空质粒单酶切； 泳道3为BCR/ABL-pIRES重组质粒单酶切；泳道4为BCR/ABL-pIRES重组质粒双酶切；泳道5为BCR/ABL的PCR产物；泳道 6 为 150bp DNAmarker。图5为BCR/ABL-pIRES-SEA重组质粒酶切鉴定结果图；其中，泳道1 为 Ikb DNA marker ；泳道2为BCR/ABL-p IRES-SEA重组质粒单酶切；泳道3 为 BCR/ABL-p IRES-SEA 用 XhoI 酶和 EcoRI 酶双酶切；泳道4 为 BCR/ABL-p IRES-SEA 用 XbaI 酶和 SalI 酶双酶切；泳道5为pIRES空质粒单酶切；泳道6为BCR/ABL的PCR产物；泳道7为SEA的PCR产物；泳道 8 为 150bp DNA marker。图6为SEA-pIRES重组质粒双酶切鉴定结果图；其中，泳道1 为 Ikb DNA marker ；泳道2为pIRES空质粒单酶切；泳道3为SEA-pIRES重组质粒单酶切；泳道4为SEA-pIRES重组质粒用XhoI酶和EcoRI酶双酶切；泳道5为SEA的PCR产物；泳道 6 为 150bp DNA marker。图7为BCR/ABL-p IRES-SEA重组质粒转染K293细胞后进行RT-PCR得到的产物电 泳图；其中，泳道1为以空白组K562细胞cDNA为模板，Sl和S2为引物进行的扩增；泳道2为以转染pIRES空质粒的K562细胞cDNA为模板，Sl和S2为引物进行的 扩增；泳道3 4为转染BCR/ABL-p IRES-SEA的K562细胞cDNA为模板，Sl和S2为引 物进行的扩增；泳道5为以空白组K562细胞cDNA为模板，Bl和B2为引物进行的扩增；泳道6为以pIRES空质粒转染的K562细胞cDNA为模板，Bl和B2为引物进行的 扩增；泳道7 8为以转染BCR/ABL-p IRES-SEA的K562细胞cDNA为模板，Bl和B2为 引物进行的扩增。
图8为BCR/ABL-pIRES-SEA重组质粒转染K293细胞后蛋白表达的SDS-PAGE图；其中，泳道1为阳性对照SEA蛋白；泳道 2 为蛋白 marker (Blue Plus II Protein Marker)；泳道3为空质粒转染组； 泳道4为转染BCR/ABL-p IRES-SEA重组质粒组。图9为流式细胞仪检测所构建质粒免疫小鼠后对CD4+、CDS+T细胞亚群的影响的 图其中A为pIRES质粒免疫小鼠组；B为BCR/ABL-pIRES质粒免疫小鼠组；C 为 BCR/ABL-p IRES-SEA 质粒免疫小鼠组；D为SEA-pIRES质粒免疫小鼠组；E为空白对照组，注射生理盐水小鼠组。图10为ELISA法检测免疫后小鼠血清中INF- γ含量变化情况图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1 慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-p IRES-SEA重组质粒的构建，如图1所示利用RT-PCR扩增BCR/ABL片段，将该片段插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构 建出BCR/ABL-pIRES，然后通过PCR从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出SEA基因，将该 基因插入到BCR/ABL-pIRES的多克隆位点B中构建BCR/ABL_pIRES_SEA，经过测序正确后， 成功构建了 BCR/ABL-p IRES-SEA 质粒。具体步骤如下1 BCR/ABL-pIRES重组质粒的构建1. 1 BCR/ABL 片段的扩增从白血病细胞株K562细胞(购自上海中科院细胞库)中提取RNA，逆转录得到的 cDNA作为模板(K562细胞的RNA提取和cDNA合成均按常规方法进行)，用上游引物Bi、 下游引物B2进行PCR扩增BCR/ABL片段，总反应体积为50 μ L，其中含1 μ L cDNA, 0. 5 μ L starDNA 聚合酶，上下游引物各 1 μ L，dNTP8 μ L, 5xPCR BufferlO μ L，超纯水 32. 5 μ L。反 应在PCR扩增仪中进行，共进行30个循环，94°C 30sec (首次为4min)；退火60°C 30sec ；延 伸72°C 30sec(末次为lOmin)，扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶在100伏电压下电泳。电泳结 果如图2所示，产物片段大小与预期结果相符，其大小为354bp，实际有效片段为336bp。扩 增的PCR产物标记为BCR/ABL。Bl :5'- att|ctcgag|atggggctctatgggtttctg- 3'；方框内IctcgX^为Xh01酶切位点；B2 :5'- gcc|gaattc|ctagatgtagttgcttgggac -3‘；方框内IGAATf^I为EcoRI酶切位点。
1.2 PCR 扩增 SEA 片段细菌基因组提取试剂盒(天根有限公司)提取金黄色葡萄球菌株(ATCC13565，购 自中国药品生物制品检定所)基因组DNA，以金黄色葡萄球菌基因组DNA作为模板，用上游 引物Sl和下游引物S2 PCR扩增SEA片段，扩增的目的片段长度为827bp，实际有效的片段 为774bp。总反应体积为50 μ L，其中含IyL cDNA,0. 5yL starDNA聚合酶，上下游引物各 1口1^，(1^138口1^，5\卩0 吐作1~1(^1^，超纯水32.5口1^反应在PCR扩增仪中进行。反应条 件首先94°C预变性4min，然后94°C lmin,50°C lmin,72°C Imin循环30次，最后72°C总延 伸lOmin。扩增产物在100伏特电压下，用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。si 5' -GCfTCTAG^ATTATGCTTTAGAGGTGAG -3'；方框内Itctac^I为xbai酶切位点；
S2 5' -CGlGTCGA^CAACTACCATGTTTAACTTG -3‘；方框内丨GTCG^I为SalI酶切位点；1.3 酶切Ε. Ζ. N. A.凝胶回收试剂盒纯化BCR/ABL片段的PCR产物。将纯化后的BCR/ABL片 段和pIRES质粒用XhoI和EcoRI进行双酶切处理，具体反应体系见表1。反应体系旋涡振 荡混勻后置于PCR仪中，37°C反应5小时。表1BCR/ABL和SEA PCR产物与pIRES质粒双酶切反应体系 1.4 连接纯化上述酶切反应产物，酶切后的BCR/ABL基因与经过同样酶切处理的pIRES质 粒利用T4DNA连接酶进行连接反应。体系配好混勻后16°C过夜，连接产物4°C保存，尽量 24h内进行转化。连接反应体系共10yL，包括lyL10XBuffer，6yL PCR产物，IyL载 体，1 μ L T4DNA连接酶和1 μ L灭菌水。经过上述步骤将扩增的基因BCR/ABL插入到pIRES质粒的多克隆位点A中构建出 BCR/ABL-pIRES 重组质粒。1. 5转化、筛选鉴定阳性克隆将构建好的BCR/ABL-pIRES重组质粒常规转化大肠杆菌TOPlO感受态(天根有限 公司)后，16小时左右长出菌落。每个培养皿随机挑选数个单菌落，分别置于100 μ L LB培 养液(Amp 100yg/mL)中，旋涡震荡混勻。取溶解单菌落的培养液1 μ L作为模板以相应的 引物Bi、Β2进行PCR(扩增体系和方法同1. 1)。扩增产物用1. 5%的琼脂糖凝胶在100伏 特电压下进行电泳。1.6提取质粒及酶切鉴定
收集扩增的大肠杆菌利用质粒提取试剂盒提取BCR/ABL-pIRES重组质粒；将提 取的重组质粒分别用XhoI和EcoRI进行双酶切鉴定，酶切反应体系共10 μ L，包括2yL 10XBuffer,luL XhoI,luL EcoRI和6 μ L DNA。体系配好后旋涡振荡混勻，然后置于PCR 仪中37°C反应12小时，酶切产物100伏电压下用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。从BCR/ ABL-pIRES中切下来的BCR/ABL基因片段，大小为354bp，与预期结果相符(电泳结果如图 4)。1. 7重组质粒序列分析鉴定构建的BCR/ABL-pIRES重组质粒经过双酶切鉴定正确后，还需要进行测序以验证 插入多克隆位点A(MCS Α)序列的正确性，从插入片段的上游开始延顺时针方向采用双脱氧 链末端终止法进行单向测序，引物序列为上海英俊有限公司通用引物。测序结果与Genbank 中BCR/ABL-pIRES融合基因序列比对，可知重组质粒中的插入的BCR/ABL-pIRES基因序列 完全正确。2BCR/ABL-pIRES-SEA 重组质粒的构建2.1 酶切 Ε. Ζ. N. A.凝胶回收试剂盒纯化SEA片段PCR产物，将纯化后的PCR产物和BCR/ ABL-pIRES重组质粒用Xbal I和Sal I进行双酶切处理，酶切反应体系共30 μ L，包括8 μ L IOXH Buffer,2y L Xba Ι,2μ L Sal I,10uL DNA和8μ L灭菌水。反应体系旋涡振荡混 勻后置于PCR仪中，37°C反应5小时。2. 2 连接纯化上述酶切反应产物。酶切后的SEA PCR产物与经过同样酶切处理的BCR/ ABL-pIRES重组质粒利用T4DNA连接酶行连接反应。体系配好混勻后16°C过夜，连接产物 4°C保存，尽量24h内进行转化。连接反应体系共10 μ L，包括IyL 10XBuffer，6 μ L PCR 产物，1 μ L载体和1 μ L T4DNA连接酶。经过上述步骤将扩增的SEA基因插入到pIRES质粒的多克隆位点B中构建出BCR/ ABL-p IRES-SEA 重组质粒。2. 3转化及筛选鉴定阳性克隆方法同1. 4 ；取溶解单菌落的培养液1 μ L作为模板用Si、S2作为引物进行菌落 PCR扩增体系和方法同2. 1。2. 4常规提取质粒及酶切鉴定将提取的BCR/ABL-pIRES-SEA重组质粒用Xba I和Sal I进行双酶切鉴定，酶切反 应体系共 10μ L，包括2μ L IOXH Buffer, 1 μ L Xba I，1 μ L Sal I 禾口 6 μ L DNA。体系配 好后旋涡振荡混勻，然后置于PCR仪中37°C反应12小时，酶切产物用1. 5%的琼脂糖凝胶 电泳鉴定。电泳结果如图5所示，从各重组质粒中切下来的SEA基因片段大小均为827bp， 与预期结果相符。2. 5重组质粒测序鉴定从插入片段的下游开始延逆时针方向进行单向测序，测序引物序列为上海英俊有 限公司通用引物，测序结果显示插入到BCR/ABL-pIRES-SEA组质粒多克隆位点B (MCS B)中 的SEA片段的序列与Genebank中的SEA序列是完全一致的。3. SEA-pIRES重组质粒的构建
把SEA连在pIRES质粒的多克隆位点A上，所用引物与Si、S2除酶切位点不一样 外完全相同，所扩增SEA片段完全相同。所用的引物S3 :5'-GC^TCGA^AATTATGCTTTAGAGGTGAG-3,；所用的引物S4 :5’-CG|GAATTC|TCAACTACCATGTTTAACTTG-3’ ；方框内所述的CTCGAG为XhoI酶切位点；方框内所述的GAATTC为EcoRI酶切位点；所用方法与构建BCR/ABL-pIRES重组质粒的方法相同，从SEA-pIRES中切下来的 SEA基因片段，大小为827bp，与预期结果相符(电泳结果如图6)。测序鉴定完全正确。实施例2
研究构建的慢性粒细胞白血病DNA疫苗(即BCR/ABL-pIRES-SEA重组质粒)转染 真核细胞后基因和蛋白表达1 筛选合适的待转染细胞，利用Lipofectamine 2000 Kit (Invitrogen公司) 转染人胚胎肾上皮K293细胞(中科院上海细胞所)。利用Lipofectamine 2000 Kit转染K293细胞，将培养板放入5% CO2培养箱中 (370C )培养，4 6小时后将含转染试剂的0pti-MEM I培养基更换为含有体积百分比为 10%胎牛血清的DMEM培养基，48小时后收集上清液和细胞。2 RT-PCR 检测收集转染后培养48小时的K293细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA作为模板，分别 用引物Bi，B2(用于扩增BCR/ABL片段，354bp)和Si，S2(用于扩增SEA片段，827bp)进行 PCR扩增，PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶在100伏特电压下电泳。确定BCR/ABL和SEA基 因转录情况(结果见图7)。该结果说明了 BCR/ABL和SEA基因转录能在真核细胞中转录水 平表达。3翻译水平检测外源质粒在真核细胞中的表达取细胞裂解液通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测BCR/ABL蛋白和SEA蛋白的表 达情况(结果见图8)。该结果说明了 BCR/ABL和SEA基因转录能在真核细胞中表达蛋白。实施例3研究慢性粒细胞白血病DNA疫苗注射小鼠肌肉(BCR/ABL-pIRES-SEA重 组质粒)后，不同时期的基因和蛋白表达和特异性CTL效应等30只6 8周的健康纯系雄性BALB/c小鼠(SCXK粤20040011，购自中山大学实 验动物中心)随机均分为5组(每组6只)，各小鼠分别于第1周、2周、4周各免疫1次， 共3次。A组(P组)每次于双侧股四头肌肌内分别注射pIRES 200yg;B组(B-P组) 每次于双侧股四头肌肌内分别注射BCR/ABL-pIRES 200 μ g ;C组(B_P_S组)每次于双侧 股四头肌肌内分别注射BCR/ABL-pIRES-SEA 200 μ g ;D组(S_P组)每次于双侧股四头肌 肌内分别注射SEA-pIRES 200yg;E组(N组)每次于双侧股四头肌肌内分别注射生理盐 水200yg。于第六周末眼球取血，将小鼠处死，分离出股四头肌。用反转录聚合酶链反应 (RT-PCR)及免疫组织化学染色法检测目的基因在小鼠骨骼肌中的转录和表达；ELISA法检 测小鼠血清中INF-Y含量；CCK8试剂盒检测小鼠脾细胞特异性CTL活性；流式细胞术检测 T淋巴细胞⑶4、⑶8亚群。结果(1)在小鼠注射部位肌肉组织的常规石蜡切片(HE染色)可见在各组肌肉间隙中发现有不同程度的淋巴细胞浸润，呈散在或不连续性的簇状分布。小鼠肌肉组织提取的RNA中可检测(RT-PCR和实时定量PCR)到BCR/ABL基因及SEA基因的表达；(2)利 用流式细胞术检测各实验组免疫后小鼠⑶4+、⑶8+T细胞增殖情况(流式图见图9)，显示 BCR/ABL-pIRES-SEA免疫组⑶8+T细胞有升高的趋势；(3)小鼠脾细胞为效应细胞K562细 胞为靶细胞，效靶比为40 1，疫苗组经CCK8试剂盒检测显示其对Κ562细胞具有特异性细 胞毒性作用，对Κ562细胞的杀伤率明显高于ΝΒ4细胞对照组；(4) ELISA法检测小鼠血清中 INF-Y含量与其他组比较明显升高，有统计学意义(见图10)。结论本发明所述的慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-p IRES-SEA是一个能够 在真核细胞内同时表达BCR/ABL和SEA蛋白的质粒，将该DNA疫苗注射到老鼠体内能够表 达BCR/ABL和SEA蛋白，激发机体产生针对CML细胞的特异性免疫应答，可以达到根除患者 体内的微小残留病变的目的。本实验结果表明本发明所克隆的BCR/ABL片段是有效的免疫 片段，且SEA基因能有效地增强BCR/ABL片段的免疫效应，BCR/ABL-pIRES-SEA双基因DNA 疫苗可应用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA，其特征在于所述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA含有pIRES质粒、BCR/ABL基因和SEA基因，BCR/ABL基因和SEA基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件两侧的多克隆位点上；所述BCR/ABL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SEA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA的制备方法，其特 征在于包括如下步骤(1)将BCR/ABL基因插入pIRES质粒的多克隆位点A或多克隆位点B中，得到BCR/ ABL-p IRES 质粒；(2)将SEA基因插入BCR/ABL-pIRES质粒的多克隆位点中，SEA基因与BCR/ABL基因分 别位于IRES元件的两侧，得到慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)提取白血病细胞株K562细胞的RNA通过逆转录合成cDNA；将得到的cDNA为模板， 通过引物Bl和B2进行PCR扩增，得到长度为354bp的BCR/ABL片段；所述的引物 Bl :5，-ATT |CTCGA(j ATGGGGCTCTATGGGTTTCTG-3'；所述的引物 B2 :5，-GCC lGAATTCl CTAGATGTAGTTGCTTGGGAC-3，；所述的BCR/ABL片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；方框内所述的CTCGAG为XhoI酶切位点；方框内所述的GAATTC为EcoRI酶切位点；(2)以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，通过引物Sl和S2进行PCR扩增，得到长度 为827bp的SEA片段；所述的引物 Sl :5，-GC [rCTAGAl AATTATGCTTTAGAGGTGAG-3，；所述的引物 S2 :5，-CG |GTCGAC| TCAACTACCATGTTTAACTTG-3’ ；所述SEA片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；方框内所述的TCTAGA为XbaI酶切位点；方框内所述的GTCGAC为SalI酶切位点；(3)用XhoI酶和EcoRI酶分别将pIRES质粒和步骤(1)所述的BCR/ABL片段进行双酶 切，再通过T4DNA连接酶将双酶切后的BCR/ABL片段和pIRES质粒进行连接，BCR/ABL片段 插入至pIRES质粒的多克隆位点A中，得到BCR/ABL-pIRES质粒；(4)用XbaI酶和SalI酶分别将步骤(2)得到的SEA片段和步骤(3)得到的BCR/ ABL-pIRES质粒进行双酶切，然后通过T4DNA连接酶将双酶切后的SEA片段和BCR/ ABL-pIRES质粒进行连接，SEA片段插入到BCR/ABL-pIRES质粒的多克隆位点B中，得到慢 性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤⑴中所述PCR扩增的反应条 件为预变性94°C 30sec，退火60°C 30sec ；延伸72°C 30sec，共进行30个循环；首次预变 性为94°C 4min，末次延伸为72°C IOmin0
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤⑵中所述PCR扩增的反应条件为首先94°C预变性4min，然后94°C lmin,50°C lmin,72°C lmin循环30次，最后72°C总 延伸lOmin。
6.权利要求1所述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA应用于制备治疗慢 性粒细胞白 血病的基因药物。
全文摘要
本发明公开了一种慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA及其制备方法和应用。该DNA疫苗含有pIRES质粒、BCR/ABL基因和SEA基因，BCR/ABL基因和SEA基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件两侧的多克隆位点上，BCR/ABL基因和SEA基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和No.2所示。该DNA疫苗能够在真核细胞内同时表达BCR/ABL和SEA蛋白，将该DNA疫苗注射到小鼠体内能够表达BCR/ABL和SEA蛋白，激发机体产生针对CML细胞的特异性CD8+T细胞，并伴有细胞因子分泌增加，从而达到根除患者体内的微小残留病变的目的，因此，本发明可应用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物。
文档编号C12N15/12GK101837134SQ20101016042
公开日2010年9月22日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者周羽竝, 李扬秋, 杨力建, 林晨, 田红霞, 陈少华, 高永鹏 申请人:暨南大学