专利名称：一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统及其方法
技术领域：
本发明属于医学基础研究領域，具体的说，涉及一种导致白血病细胞凋亡的系统及其方法。
背景技术：
慢性粒细胞白血病(CML)是ー种发生在早期多能造血干细胞上的恶性骨髓增生性疾病。主要涉及髓系，临床表现为脾肿大、外周血中粒细胞显著增多并出现幼稚粒细胞。在受累的细胞系中，可找到Ph染色体和(或)bcr-abl融合基因。bcr-abl融合基因编码的Bcr-Abl融合蛋白具有组成性激活的酪氨酸激酶活性，通过激活PI3K、STAT5等抗凋亡信号显著地抑制细胞凋亡，诱导细胞的转化，从而引起CML的发生发展。目前临床应用于CML治疗的ー线药物是imatinib，它通过竞争性结合Bcr-Abl蛋白中的ATP结合位点，使Bcr-Abl 不能磷酸化底物从而阻断CML进展。但是，目前临床上仍有1/3的患者对imatinib不耐受或者耐药，对于这些患者需要寻求另外的替代疗法。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供ー种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统及其方法。本发明目的是这样实现的RATS靶向Bcr-Abl入核借酪氨酸激酶活性诱导CML细胞凋亡的立项依据如下I. Bcr-AbI与c_AbI之间显示出明显的细胞内定位和效应的差异，在CML发病中起
着重要作用Bcr-Abl和c_Abl都含有相同的与蛋白定位相关的核定位信号(nuclearlocalization signal, NLS)和核输出信号(nuclear export signal, NES),但 c_Abl 在细胞浆和细胞核都可定位，而Bcr-Abl则只定位于细胞浆。位于核内的c-Abl是ー个重要的凋亡诱导蛋白，它活化后通过磷酸化转录因子P73使其转录活性增强，激活caspase凋亡信号途径，诱导细胞的凋亡；位于胞浆的Bcr-Abl则通过激活抗凋亡信号显著地抑制细胞凋亡，诱导细胞的转化。2.将Bcr-Abl转运到核内，并利用Bcr-Abl的激酶活性，磷酸化p73，激活凋亡信号，从而诱导CML细胞凋亡思路的依据在DNA损伤吋，c-Abl入核并被激活，是DNA损伤应激诱导细胞凋亡所必需的，当缺失c-Abl或c-Abl的激酶活性时细胞就对凋亡诱导不敏感。因此，c-Abl入核和激酶活性被激活是DNA损伤时c-Abl激活凋亡信号的前提。Bcr-Abl在结构上具有和c-Abl —样的效应结构域,更重要的是Bcr-Abl的激酶活性在细胞内是组成性激活的，因此，Bcr-Abl进入核内就可以通过其激酶活性磷酸化P73，诱导细胞凋亡。3.将CML细胞的Bcr-Abl转运到核内的策略①核定位信号(NLS)在蛋白由胞浆向胞核内转运中的作用真核细胞内的蛋白由胞浆向胞核内转运需要通过细胞核和细胞浆间屏障核膜的核孔复合物，这个过程是由核定 位信号(NLS)的引导发生的。②雷帕霉素类似物转运系统(rapamycinanalog transport system, RATS):雷帕 霉素(Rapamycin)是一种天然的小分子化合物,它在细胞内和FKBP蛋白(FK506_binding protein, FKBP)结合形成雷帕霉素-FKBP 二元复合物后,对雷帕霉素祀(mammalian traget of rapamycin,mTOR)的FRB结构域(FKBP-rapamycin binding domain,FRB)具有很高的亲 和性和特异性，形成FRB-雷帕霉素-FKBP三元复合物，从而选择性诱导了 FRB和FKBP的相 互作用。因此，如果将核定位信号与FRB融合，在雷帕霉素诱导的蛋白相互作用下，定位信 号被传递给FKBP，或是与FKBP融合的目标蛋白，通过这种方式，就可以实现蛋白的转运。为 了避免雷帕霉素对正常细胞的影响，可用雷帕霉素类似物(rapamycin analog)即AP21967 来代替雷帕霉素，同时对FRB进行突变修饰，这样AP21967就只结合突变修饰的FRB，而不结 合细胞内的雷帕霉素靶的FRB。综上所述，雷帕霉素类似物AP21967和FKBP、FRB以及与之 融合的核定位信号也就组成了雷帕霉素类似物核转运系统(rapamycin analog transport system, RATS),通过RATS实现的蛋白核转运也在越来越多的研究中得到了应用。③RATS 如何实现对 Bcr-Abl 的靶向转运Grb2 的 SH2 (Src homology 2，SH2)结 构域和Bcr-Abl的Y177特异性结合，在AP21967诱导FRB和FKBP相互作用时，就可以将与 FRB融合的核定位信号传递给与FKBP融合的SH2，进一步传递给Bcr-Abl，从而将Bcr-Abl 转运入核。④外源性FKBP-SH2和NLS-FRB融合肽如何进入靶细胞转运Bcr-Abl入核从而 激活P73 :选用Ad5腺病毒载体作为表达载体，分别构建表达FKBP-SH2和带有核定位信号 的NLS-FRB融合肽，将腺病毒同时感染CML细胞，加入AP21967后，RATS靶向转运Bcr-Abl 入核，既可以减少胞浆中的Bcr-Abl蛋白水平及其介导的致白血病信号，又可以使入核的 Bcr-Abl发挥其激酶活性，磷酸化p73，激活凋亡信号，达到诱导CML细胞凋亡的目的。根据以上依据进行了实际的操作，发现效果明显。实验验证发明效果中，为了检测的方便，在N3R前端加上一段氨基酸序列FLAG标 签构成FN3R，FLAG标签具体为DYKDDDDK ;在F2S前端加上一段氨基酸序列HA标签构成 HF2S, HA 标签具体为YPYDVPDYAVD。I.重组腺病毒Ad5-FN3R、Ad5_HF2S的构建与鉴定FN3R片段通过重叠PCR扩增获得，通过分子克隆方法将FN3R片段插入腺 病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，经菌落PCR筛选、双酶切及测序鉴定，证实构建的质粒 pAdTrack-CMV-FN3R与预期的序列相符。采用分步克隆的方法，将HA，两段FKBP及SH2依次 插入pAdTrack-CMV中，构建含HF2S片段的质粒。经菌落PCR筛选、双酶切及测序鉴定，证 实构建的质粒pAdTrack-CMV-HF2S与预期的序列相符。同样的方法构建含突变片段HF2Sm 的质粒。将穿梭质粒与腺病毒的骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中重组，经琼脂糖凝胶 电泳、Pac I酶切鉴定，筛选出正确重组的腺病毒载体Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5-HF2Sm。将 腺病毒载体Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5-HF2Sm线性化后转染AD-293细胞，在AD-293细胞中 进行腺病毒的包装、扩增，获得高滴度的腺病毒Ad5-FN3R、Ad5-HF2S、Ad5_HF2Sm。2. PCR 及 western blot 鉴定 FN3R、HF2S 及 HF2Sm 在细胞中的表达腺病毒溶液经蛋白酶K处理后，作为模板进行PCR扩增，各病毒均扩增得目的条带(图I中A，B)。而以Ad5空载为模板的阴性对照没有条带。重组腺病毒感染AD-293细胞和K562细胞后，提取总蛋白，Western blot检测到目的蛋白在两种细胞中的表达，而Ad5空载对照组未检测到表达(图I中C，D)。图I 中 A. PCR 鉴定 FN3R mRNA 的表达.M DL2000 标准，1,2 FN3R 病毒液，3 阳性对照，4 阴性对照.图I中B. PCR鉴定HF2S mRNA的表达.M DL2000标准，1,6 :阴性对照，2 :正确重组的Ad5-HF2S腺病毒，3 :阳性对照，4 :正确重组的Ad5_HF2Sm腺病毒，5 :阳性对照 图I中C. Western blot鉴定FN3R、HF2S及HF2Sm在AD-293细胞中的表达 图I中D. Western blot鉴定FN3R、HF2S及HF2Sm在K562细胞中的表达 3.免疫荧光检测FN3R、HF2S及HF2Sm在K562细胞中的定位(參看图2)用Ad5-FN3R、Ad5_HF2S 或 Ad5_HF2Sm 腺病毒感染 K562 细胞，MOI 为 105，48h 收集细胞进行免疫荧光实验，检测FN3R、HF2S及HF2Sm蛋白在K562细胞中的定位。结果如图2·所示FN3R主要定位于细胞核，HF2S、HF2Sm主要定位于细胞浆，与预期相符。4.免疫荧光检测RATS转运Bcr-Abl入核前后Bcr-Abl及目的蛋白在K562细胞中的定位接种合适密度的K562细胞于细胞培养板中，以腺病毒Ad5_FN3R和Ad5_HF2S或(Ad5-HF2Sm)共感染K562细胞，MOI为105。12h后加入AP21967，48h后，收集细胞涂片，进行免疫荧光实验。腺病毒Ad5-FN3R和Ad5-HF2S共感染K562细胞后，在不加入AP21967时，FKBP不能结合FRB，与FRB融合的NLS不能传递给FKBP及与之融合的蛋白，用HA抗体检测到的是位于细胞浆的HF2S，此时，Bcr-Abl仍定位于细胞浆(图3中A)，在加入AP21967后，FKBP与FRB相互作用，与FRB融合的NLS传递给FKBP及与之融合的蛋白，最终传递给Bcr-Abl，用HA抗体检测到的蛋白包括HF2S和FN3R，主要位于细胞核，Bcr-Abl部分转运至细胞核(图3中B)。在Ad5-FN3R和Ad5_HF2Sm共感染对照组，NLS能够传递给FKBP以及与之融合的Sm,但由于Sm不能结合Bcr-Abl,故用HA抗体检测到的蛋白包括FN3R和HF2Sm,主要位于细胞核，Bcr-Abl仍位于细胞浆(图3中C)。以上结果证实RATS能够转运Bcr-Abl入核。由于RATS转运K562细胞中Bcr-Abl入核的效应不够强，而据文献报道，来普霉素B (LMB)能够抑制NLS出核，增强入核效应。因此，我们通过加入LMB来增强RATS转运Bcr-Abl入核的效应。免疫荧光证实单独0. 2nM LMB不能诱导Bcr-Abl入核(图3中E)，但是能够显著增强RATS转运Bcr-Abl入核(图3中D)，以上结果证实LMB增强了 RATS转运K562细胞中Bcr-Abl入核。5. RATS抑制K562细胞增殖为了使我们所用浓度的LMB不对K562细胞的生长产生明显的影响，以确保LMB只对RATS起辅助作用，我们用不同浓度(0. 2nM，0. 5nM，InM，2nM和5nM)的LMB处理K562细胞，24和48h的MTS结果证实，LMB浓度为0. 2nM时对K562细胞的生长几乎无影响(图4)。进ー步用0. 2nM和0. 5nM两个浓度的LMB处理K562细胞，第2，4，6天的MTS结果也证实0. 2nM的LMB对K562细胞的生长无影响(图5)。因此我们选定0. 2nM的LMB为后续试验浓度。如图6所示，与正常对照组(曲线a)相比，RATS在一定程度上抑制了 K562细胞的生长(曲线C)，而在LMB辅助下，K562细胞生长明显受到抑制(曲线d)，而突变对照组(曲线e)和空载对照组(曲线b)对K562细胞的生长没有显著的影响。以上结果说明，RATS能抑制K562细胞的生长，0. 2nM LMB显著增强了 RATS对K562细胞的增殖抑制效应。
6. RATS诱导K562细胞凋亡以MOI 为 105，Ad5-FN3R和 Ad5-HF2S 腺病毒共感染 K562 细胞，12h 后加入 AP21967， 24h后加入0. 2nM LMB，72h后收集细胞，瑞氏染色检测K562细胞的形态、DAPI染色检测细 胞核的变化情况。同时实验设立正常对照组(control);未加AP21967组(RATS—) :Ad5_FN3R 和Ad5-HF2S共感染后，不加AP21967，其余处理同实验组；突变对照组(RATSm) :Ad5_FN3R 和Ad5-HF2Sm共感染K562细胞，其余处理与实验组相同。瑞氏染色(图7)发现RATS处 理组细胞大小不一，胞浆紫红色颗粒增多，部分细胞空泡化，部分细胞出现明显的细胞核固 缩、碎裂，说明凋亡细胞增多。而正常对照组、RATS-组和RATS 组，细胞完整，大小均一，凋 亡细胞少见。这说明RATS诱导了 K562细胞凋亡。DAPI染色(图8)发现RATS处理组细胞 核出现固缩、碎裂、溶解等凋亡改变，计数1000个细胞核，凋亡率为22%。而正常对照组、 RATS_组和RATSm组，细胞核均一，圆形或类圆形，偶见固缩或碎裂的细胞核。这进一步证实 RATS诱导了 K562细胞凋亡。我们进一步用western blot检测caspase 3的活化情况。RATS组caspase 3 被活化，切割出17kDa的活化片段；而正常对照组，未加Ap21967组和突变对照组，都未见 caspase活化(图9)。结果说明RATS通过caspase 3诱导了 K562细胞凋亡。有益效果通过实验验证本发明的系统和方法，可以达到和实现诱导CML细胞凋亡，并且效 果非常好，对于治疗白血病的研究及药物的开发具有很大的研究价值。
图I为FN3R、HF2S及HF2Sm的表达鉴定图；图2为免疫荧光检测FN3R、HF2S及HF2Sm蛋白在K562细胞中的定位图；图3为免疫荧光检测RATS转运Bcr-Abl入核前后Bcr-Abl及目的蛋白在K562细 胞中的定位图；图4为不同浓度的LMB对K562细胞生长影响的曲线图；图5为0. 2、0. 5nM LMB在不同时间对K562细胞生长影响的曲线图；图6为RATS抑制K562细胞增殖；图7为瑞氏染色证实RATS诱导K562细胞凋亡图；图8为DAPI染色证实RATS诱导K562细胞凋亡图；图9为RATS激活caspase 3的鉴定图；图10为让慢性粒细胞白血病(CML)细胞凋亡的系统示意图。
具体实施例方式实施例如图10所示，一种让慢性粒细胞白血病(CML)细胞凋亡的系统，由载入腺病毒的 两个融合肽N3R、两个化合物AP21967和载入腺病毒的融合肽F2S连接在一起构成；所述融合肽N3R为3段NLS和FRB连接组成，所述融合肽F2S为2段FKBP和SH2 连接组成，一段FKBP通过一个化合物AP21967与一段FRB结合；一个融合肽F2S通过化合物AP21967同时结合两个融合肽N3R ；所述融合肽N3R的氨基酸序列为PKKKRKVPKKKRKVPKKKRKVELIRVAILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEffCRKYMKSGNVKDLLQAffDLYYHVFRRISKQ ；所述融合肽N3R的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；所述融合肽F2S的氨基酸序列为MGVQVETISP ⑶ GRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEAAAMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGTLEWFFGKIPRAKAEEMLSKQRHDGAFLIRESESAPGDFSLSVKFGNDVQHFKVLRDGAGKYFLWVVKFNSLNE LVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIE ；所述融合肽F2S的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。具体让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的方法将载入腺病毒的融合肽N3R、化合物AP21967和载入腺病毒的融合肽F2S导入慢性粒细胞白血病细胞中，FRB与化合物AP21967结合，该化合物AP21967又与FKBP结合，形成FRB-AP21967-FKBP三元复合物，将N3R和F2S连接在一起构成了让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统，同时SH2会结合Bcr-Abl癌蛋白，FRB将定位信号传递给Bcr-Abl癌蛋白，将Bcr-Abl癌蛋白转运入核，通过Bcr-Abl癌蛋白的酪氨酸激酶活性磷酸化激活p73，诱导CML细胞凋亡。
权利要求
1.一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统，其特征在于由载入腺病毒的两个融合肽N3R、两个化合物AP21967和载入腺病毒的融合肽F2S连接在一起构成； 所述融合肽N3R为3段NLS和FRB连接组成，所述融合肽F2S为2段FKBP和SH2连接组成， 一段FKBP通过一个化合物AP21967与一段FRB结合；一个融合肽F2S通过化合物AP21967同时结合两个融合肽N3R ； 所述融合肽N3R的氨基酸序列为PKKKRKVPKKKRKVPKKKRKVELIRVAILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEffCRKYMKSGNVKDLLQAffDLYYHVFRRISKQ ； 所述融合肽N3R的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示； 所述融合肽F2S的氨基酸序列为MGVQVETISP⑶GRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEAAAMGVQVETISPOTGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGTLEWFFGKIPRAKAEEMLSKQRHDGAFLIRESESAPGDFSLSVKFGNDVQHFKVLRDGAGKYFLWVVKFNSLNELVDYHRSTSVSRNQQIFLRDIE ； 所述融合肽F2S的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.根据权利要求I所述一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统，其特征在于所述融合肽N3R和F2S载入的腺病毒为Ad5腺病毒。
3.一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的方法，其特征在于将载入腺病毒的融合肽N3R、化合物AP21967和载入腺病毒的融合肽F2S导入慢性粒细胞白血病细胞中，FRB与化合物AP21967结合，该化合物AP21967又与FKBP结合，将N3R和F2S连接在一起，同时SH2会结合Bcr-Abl癌蛋白，FRB将核定位信号传递给Bcr-Abl癌蛋白，将Bcr-Abl癌蛋白转运入核，通过Bcr-Abl癌蛋白的酪氨酸激酶活性磷酸化激活p73，诱导CML细胞凋亡。
全文摘要
本发明为一种让慢性粒细胞白血病细胞凋亡的系统，由载入腺病毒的两个融合肽N3R、两个化合物AP21967和载入腺病毒的融合肽F2S连接在一起构成。本发明系统和方法通过实验验证，可以达到和实现诱导CML细胞凋亡，并且效果非常好，对于治疗白血病的研究及药物的开发具有很大的研究价值。
文档编号C12N15/861GK102952825SQ20121030903
公开日2013年3月6日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者冯文莉, 黄峥兰, 高淼, 罗红伟 申请人:重庆医科大学