专利名称：一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法
技术领域：
本发明属于微藻生物能源技术领域，涉及ー种产油微藻胁迫培养快速积累大量藻油和微藻采收耦合的方法。
(ニ)
背景技术：
随着工业和经济的快速发展，能源短缺和环境污染问题日益严重，寻求可以替代石油的可再生清洁能源成为世界能源エ业的发展方·向。藻类具有光合作用效率高、生长周期短，环境适应能力强、藻油含量丰富的特点，是富有前景的生产生物能源的原料之一。目前，微藻生物能源的关键问题在于培养成本高、微藻采收困难。培养成本高的原因主要有两个方面，其一是未能找到协调好微藻高生物产量和高藻油含量矛盾的微藻自养培养方法；其ニ是未能找到协调好培养盐的重复利用和采收成本之间矛盾的微藻采收方法。为了提高微藻的生物量和藻油含量，目前常用的培养方式是异养培养，即在培养过程中加入大量的葡萄糖等有机物质促使微藻的生长和藻油积累。由于加入了大量的有机物，异养培养的成本高。微藻的自养是在自然光照下，利用大气中的CO2及培养液中的N、P等无机盐培养微藻，相对于异养，自养的培养成本较低，但藻的脂质含量也较低。在自养培养微藻产油的过程中，常通过培养液营养成分特别是一些必须营养盐的缺陷，来诱导微藻产生藻油，但是在营养盐缺乏的情况下，大部分微藻不能实现高密度生长，因此，尽管提高了脂质含量，但藻油的产量不高。微藻的采收一般采用离心或絮凝的方法。离心采收的设备投资大和采收能耗高。絮凝采收常采用在藻液中加入絮凝剂促使藻细胞絮凝沉降的方法，由于加入了絮凝齐U，微藻采收后的上清液不能循环用于微藻的培养，造成培养盐和水的浪费，増加了培养成本，同时，絮凝后的上清液中富含有絮凝剂、营养盐以及藻细胞，直接排放会污染环境，浄化处理又増加了成本。在此背景下，本发明提出了ー种通过调节pH值促进微藻大量积累藻油的同时采收微藻的耦合方法在微藻生长的前期，通过调节培养液中氮、磷的浓度及比例提高微藻的生物质产量；在微藻生长的后期，通过调节培养液的PH值，形成强碱或强酸的环境，胁迫微藻快速积累大量藻油，同时使微藻絮凝脱水，采收微藻。采收微藻后的培养液调节PH后循环用于微藻的培养。
发明内容
本发明目的是提供一种增产、促油培养微藻和采收微藻的方法。本发明采用的技术方案是一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，所述方法为(I)将新鲜微藻细胞以体积分数5%的接种量接种在相应的微藻培养液(所述微藻培养液为本领域公知技术，不同的微藻种类对应不同的微藻培养液，海水微藻可以采用基础F/2培养液或调整氮磷比后的改良F/2培养液，淡水微藻可以采用CHU培养液)中，通入空气，在自然光照下，5 40°C培养至对数生长期后，再在同样条件下培养f 33d，获得藻液；(2)在步骤(I)获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为1(Γ13，或在步骤(I)获得的藻液中加入酸性水溶液调节pH值为f 5，室温静置f5d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤，取滤饼即获得藻泥，将藻泥采用有机溶剂A浸提、索氏抽提或酸法提取处理，获得所述藻油；所述有机溶剂A为下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；(3)将步骤(2)的上层清液调节pH至7 8，获得调节pH值后的上层清液并检测上层清液组成，将调节PH值后的上层清液各个组成补足至相应微藻培养液组分，获得再生微藻培养液，循环用于微藻培养。进ー步，步骤(I)所述微藻优选为淡水微藻或海洋微藻。更进一歩，步骤(I)所述微藻优选为下列之一眼拟点微绿球藻、杜氏盐藻、葡萄藻或小球藻，所述眼拟点微绿球藻、杜氏盐藻为海洋微藻，葡萄藻或小球藻为淡水微藻。 进ー步，所述ー种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法推荐按如下步骤进行(I)将新鲜微藻细胞以体积分数5%的接种量接种在相应微藻培养液中，通入空气，在自然光照下，5 40°C (优选2(T25°C)培养至对数生长期后，再在同样条件下培养fl5d (优选15d),获得藻液；所述微藻为海洋微藻；所述相应微藻培养液为改良F/2培养液,终浓度组成为NaN0325 1350mg/L、NaH2PO4 ·2Η20 5 270mg/L、Na2SiO3 · 9H2020mg/L、Na2EDTA 4. 36mg/L、FeCl3 · 6H20 3. 16mg/L、CuSO4 · 5H200. 01mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 023mg/L、CoCl2 · 6H200. 012mg/L、MnCl2 · 4H200. 18mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 07mg/L、VB1O. I μ g/L、VB2O. 5 μ g/L、生物素0. 5 μ g/L，溶剂为水，pH值为；(2)在步骤(I)获得的藻液中加入碱性水溶液调节PH值为1(Γ13，或在步骤(I)获得的藻液中加入酸性水溶液调节pH值为f 5，室温静置f 5d(即pH胁迫f5d，同时使微藻絮凝采收)使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤，取滤饼即获得藻泥，将藻泥采用有机溶剂B浸提、索氏抽提或酸法提取处理，获得所述藻油；所述有机溶剂B为下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；(3)将步骤(2)的上层清液调节PH至7 8(上层清液的pH在1(Γ13时，用磷酸调节pH至7 8 ;上层清液的pH在3飞时，用氢氧化钾或氢氧化钠水溶液调节pH至7 8)，获得调节pH值后的上层清液，在调节PH值后的上层清液中加入硝酸钠(NaNO3)和磷酸ニ氢钠(NaH2PO4 · 2H20),使NaNO3的终浓度为25 1350mg/L，NaH2PO4 · 2H20的终浓度为5 270mg/L，获得再生后的改良F/2培养液，循环用于微藻培养。进ー步，步骤(I)所述微藻更优选为眼拟点微绿球藻。进ー步，步骤(I)所述培养温度优选为25 30°C。进ー步，步骤(I)所述改良F/2培养液中NaNO3的终浓度优选为225 1350mg/L，相应氮磷质量比为4:1，最优选NaNO3的终浓度225mg/L，NaH2PO4 ·2Η20的终浓度优选为45mg/L,相应氮磷质量比为4:1。进ー步，步骤(2)所述碱性水溶液优选为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，更优选质量浓度5 10%的氢氧化钠水溶液或质量浓度5 10%的氢氧化钾水溶液，所述酸性水溶液优选为硫酸水溶液或盐酸水溶液，更优选体积浓度5 10%的硫酸水溶液或体积浓度I (Tl 5%的盐酸水溶液。进ー步，优选步骤(2)所述在步骤(I)获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为11，室温静置3d (pH胁迫3d)使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀。进ー步，所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法中所述微藻藻油的提取方法为本领域公知方法，通常步骤(2)藻泥按下列方法之一进行处理提取藻油①有机溶剂浸提将步骤(2)获得的藻泥在70°C下干燥12小时，获得干藻粉a，在干藻粉a中以质量比2:1加入石英砂a，碾磨30min，再加入有机溶剂C，在室温下浸提12小吋，过滤，获得滤液和滤饼，将滤饼用相同有机溶剂C在同样条件下浸提3次，合并所有滤液，将滤液减压浓缩脱除溶剂，得到藻油；所述有机溶剂C为下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酷或石油醚；所述有机溶剂C的体积用量以干藻粉a质量计为5ml/g 索氏抽提将步骤
(2)获得的藻泥在70°C下干燥12小吋，获得干藻粉b，在干藻粉b中以质量比2:1加入石英砂b，碾磨30min，加入有机溶剂D，在索氏抽提器中(在有机溶剂D的沸点下)抽提10小时，将抽提液减压浓缩脱除溶剂，即得藻油；所述有机溶剂D为下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；所述有机溶剂D的体积用量以干藻粉b质量计为5ml/g 酸性溶液提取将步骤(2)获得的藻泥在70°C下干燥12小时，获得干藻粉C，在干藻粉c中加入蒸馏水和浓盐酸(质量浓度36 38%)，在70°C水浴中放置20min，再加入无水こ醇，冷却，加入こ醚a，振荡lmin,4000rpm离心2min,获得上层こ醚相和下层沉淀,在下层沉淀中加入こ醚b,振荡lmin,4000rpm离心2min,合并所有上层こ醚相,减压浓缩脱除溶剂,获得藻油；所述蒸懼·水、浓盐酸、无水こ醇、こ醚a和こ醚b的体积用量均以干藻粉c质量计分别为4ml/g、5ml/g、5ml/g、10ml/g和 5ml/g。本发明获得的藻油以中性脂为主，甘油三酯的含量约90%。组成甘油三酯的脂肪酸主要是棕榈酸C16:0,约30 35%，十六碳烯酸C16:1，约25 30%，油酸C18:1，约10 15%，二十碳五烯酸(EPA) C20:5，约15 28%。本发明所述生物量是指每升培养液中获得的干藻粉质量，通过生物量及生长曲线可以判断微藻生长状况，还可以通过微藻培养前及培养后藻液中细胞个数来判断生长情况。本发明所述微藻采收率根据公式(I)计算η =⑧650-,原—棚^聰凝社清液uX100%公式(丄)
^^6S0 m '原藻液公式(I)中OD65toliius液是指新鲜微藻细胞接种在改良F/2培养液中，通入空气，在自然光照下，5 40°C培养至对数生长期后，再在同样条件下培养fl5d，获得的藻液(即为原藻液)在650nm处的吸光度，0D65(lnm,pH|s!Wg±i#a是指将原藻液调整pH值静置分层后上层清液在650nm处的吸光度。所述采收率还可以通过微藻pH絮凝采收前及絮凝采收后藻液中细胞个数来判断，计算方法为原藻液中细胞密度减去pH胁迫后上层清液中细胞密度后除以原藻液中细胞密度的百分比。微藻的含油率是指Ig干藻粉中含有的藻油质量(g)，本发明所述微藻的含油率根据公式(2)计算
Ig干藻粉提取得到的藻油质量(g)ハη = —-1 了袖机-—X 100%公式(2 )
Ig十操粉本发明所述有机溶剂有机溶剂D均为有机溶剤，为便于区分不同步骤所用有机溶剂不同而命名；所述干藻粉a、干藻粉b和干藻粉c均为干藻粉，为便于区分不同步骤所得的干藻粉量不同而命名；所述こ醚a和こ醚b均为こ醚，为便于区分不同步骤加入こ醚量不同而命名，所述石英砂a和石英砂b均为石英砂，为便于区分不同步骤所用石英砂不同而命名，字母本身均无含义。与现有技术相比，本发明具有以下优势I)在微藻生长前期，通过调节培养液中氮、磷终浓度，提高微藻生物量，以眼拟点微绿球藻为例，与基础F/2培养液比较，培养液中NaNO3终浓度调整到O. 225g/L，N/P质量比调整到4:1 (对应NaH2PO4 ·2Η20的终浓度为45mg/L)，眼拟点微绿球藻的生物量从O. 42g/L増加到2. 53g/L，生物量提高了 6倍；
2)微藻生长后期，通过调节藻液的pH值，胁迫微藻快速积累藻油，以眼拟点微绿球藻为例，与正常培养相比，藻液的PH调节至11胁迫三天，微藻的藻油含量从6. 89%提高到48. 2% ;藻液的pH调节至3胁迫三天，微藻的藻油含量从6. 89%提高到35. 0% ；3)微藻生长至对数期，通过调节藻液的pH值，在胁迫微藻快速积累藻油的同吋，藻细胞发生絮凝沉降，藻细胞与培养液分离，从而实现培养与采收耦合，简化操作过程，缩短生产时间；4)调节pH絮凝采收微藻后的上层清液，根据上层清液的酸碱性，用磷酸或氢氧化钠调节PH值至7. (Γ8. 0，补加相应培养液组分，可以循环用于微藻的培养，培养液的循环利用既节省了培养成本，又避免了培养液排放对环境造成的污染。
图I本发明的エ艺流程图；图2微藻在新鲜改良F/2培养液及再生的改良F/2培养液中的生长曲线；图3不同NaNO3浓度对微藻生长曲线的影响，图中不同的标记表示曲线表是不同浓度氮(NaNO3)下培养情况实心三角形(+:)表示NaNO3浓度为25mg/L,实心正方形(-*■-)表示NaNO3浓度为75mg/L，空心三角形(★)表示NaNO3浓度为225mg/L，空心正方形(-^)表示NaNO3浓度为450mg/L，空心菱形(+)表示NaNO3浓度为900mg/L，空心圆形(十)表示NaNO3浓度为1350mg/L，实心圆形(+)为对照组的基础F/2培养液，表示NaNO3浓度为i5mg/L。图4改良F/2培养液中不同氮磷质量比对微藻生长曲线的影响，图中的N:P的含义是改良F/2培养液中氮磷质量比，实心三角形()表示氮磷质量比为1: 1，实心正方形(~■-)表示氮磷质量比为4:1,实心无边形(+ )表示氮磷质量比为16:1,实心凌形(+)表示氮磷质量比为32:1,空心正方形(+ )表示对照组中基础F/2培养液中氮磷质量比12:1。图5不同pH值及胁迫时间对微藻含油率的影响。图6实施例4所获得藻油GC-MS分析结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此基础F/2 培养液终浓度组成为NaN0375mg/L、NaH2PO4 · 2H205mg/L、Na2SiO3 · 9H2020mg/L、Na2EDTA 4. 36mg/L、FeCl3 · 6H20 3. 16mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 01mg/L、ZnSO4 · 7H200. 023mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 012mg/L、MnCl2 · 4H20 0. 18mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 07mg/L、VB1O. I μ g/L、VB2O. 5 μ g/L、生物素 O. 5 μ g/L,溶剂为水，pH 值为 7 8。所述改良F/2培养液终浓度组成为NaN0325 1350mg/L、NaH2PO4 · 2H20 5 270mg/L、Na2SiO3 · 9H20 20mg/L、Na2EDTA 4. 36mg/L、FeCl3 · 6H20 3. 16mg/L、CuSO4 · 5H20 0. Olmg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 023mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 012mg/L、MnCl2 · 4H20 0. 18mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 07mg/L、VB1O. I μ g/L、VB2O. 5 μ g/L、生物素 0. 5 μ g/L,溶剂为水，pH 值为 7 8。实施例I改良F/2培养液中氮的浓度及氮磷比的优化在基础F/2培养液中添加NaNO3和调整氮磷质量比来获得改良F/2培养液，将实验分成11个组组I为对照组，培养液为基础F/2培养液，即NaNO3终浓度为75mg/L，NaH2PO4 ·2H20 终浓度为5mg/L，对应的氮磷质量比为12:1 ；组2 组11为实验组，其中组2 组7培养液为改良F/2培养液，NaNO3终浓度分别为 25、75、225、450、900、135011^/1、对应的 NaH2PO4 · 2H20 终浓度分别为 5、15、45、90、180、270mg/L,以保证氮磷质量比为4:1。组8 组11培养液为改良F/2培养液，NaNO3终浓度均为225mg/L，NaH2PO4 · 2H20终浓度分别为180、45、1L 25,5. 63mg/L，对应的氮磷质量比分别为 1:1、4:1、16:1、32:1。将上述各组培养液中分别以体积分数5%的接种量接种新鲜的眼拟点微绿球藻细胞(购自海洋生物种质库)，在室温(25 30°C)、自然光照、连续充空气培养至对数生长期后，再在同样条件下培养15天，获得藻液f藻液11。培养过程中，每隔24小时取200μ I藻液，用O. I μ I鲁戈氏液(所述鲁戈氏液通常的制法为称取6gKI溶于l(T20ml水中，完全溶解后加入4gKI充分摇勻，完全溶解后,加水定容至IOOml,摇勻即可)染色固定后,在显微镜下计数，得到藻液中藻细胞密度，获得眼拟点微绿球藻的生长曲线，组2 组7见图3所示，组8 组11见图4所示；将上述获得的藻液f藻液11分别调节pH值为11，室温静置3d使藻液分层，分别获得上层清液广11和下层沉淀广11，将下层沉淀分别过滤，取滤饼即获得藻泥广11。将上述藻泥f 11在70°C下干燥12小时，获得干藻粉f 11，根据微藻培养的生物量来判断微藻生长状况，所述微藻培养的生物量是指每升培养液中获得的干藻粉质量。组广组11不同氮浓度和氮磷比下微藻的生物量见表I所示。图3、图4及表I结果显示，改良F/2培养液中较适宜的氮(NaNO3)终浓度为225g"l350mg/L,较适宜的氮磷质量比为4:1，在此氮和磷的浓度范围内，微绿球藻的生物量约是对照组(基础F/2培养液，75mg/LNaN03, 5mg/L NaH2PO4 · 2H20,氮磷质量比为12:1)的6倍。表INaNO3浓度和氮磷比对微藻生物量的影响
N/p2575225 450 900 1350 对照组
1:11.76 g/1
4:10.63 g/1 1.29 g/1 2.53 g/1 2.67 g/1 2.48 g/1 2.48 g/l 0.42 g/1
16:1 1.82 g/1 32:11.33 g/l
实施例2微绿球藻pH胁迫产油与pH絮凝采收耦合过程条件优化调节基础F/2培养液中NaNO3的终浓度为225mg/L，氮磷质量比为4:1 (对应的NaH2PO4 · 2H20终浓度为45mg/L)，得到改良F/2培养液。(I)将新鲜的眼拟点微绿球藻细胞以体积分数5%的接种量接种至上述改良F/2培养液中，培养温度25 30°C，自然光照，连续充空气培养3天至对数期后，再在同样的条件下培养15天，获得藻液。取IOOOmL藻液，将藻液调节pH至11，室温(25 30°C)静置3d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤后取滤饼(即藻泥)在70°C下干燥12h，制成干藻粉，每升培养液获得2. 53g干藻粉。(2)取17份步骤(I)方法获得的藻液，并从中各取I. 5mL藻液用分光光度计测定0D65tol。将17份藻液分成4组，对照组(I份藻液)，组I (7份藻液)，组2 (7份藻液)，组3(2份藻液)，将各组按下述方式进行实验a、对照组将藻液直接通过离心(转速3000rpm)得到藻泥(即离心获得的沉淀);将·藻泥在70°C下干燥12h得到干藻粉；取Ig干藻粉加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸(质量浓度36 38%)，在70°C水浴中放置20min，加入5ml无水こ醇，冷却，加入IOmlこ醚，振荡lmin,4000rpm离心2min,获得上层こ醚相和下层沉淀，取下层沉淀加入5mlこ醚,振荡lmin,4000rpm离心2min，合并所有上层こ醚相，减压浓缩脱除溶剂，即获得藻油，根据公式(2)计算微藻的含油率，结果见图5所示。b、组I (pH胁迫一天产油):7份藻液分别用lmol/L盐酸水溶液调节pH值至1、3、5，用lmol/L氢氧化钠水溶液调节pH值至10、11、12、13。将7份调节pH值后的藻液在室温(25 30°C)下静置I天使微藻分层，获得上层清液和下层沉淀。分别倾倒去上层清液，将下层沉淀分别过滤，分别取滤饼即获得7份藻泥。将上述7份上层清液各取1.5mL用分光光度计测定OD65tlnm,记为pH絮凝后的OD65tol,根据公式(I)计算微藻采收率，结果见表2所示；7份藻泥在70°C下干燥12小时，得到7份干藻粉。7份干藻粉各取Ig加入4ml蒸馏水和5ml浓盐酸(质量浓度36 38%)，在70°C水浴中放置20min，加入5ml无水こ醇，冷却，カロ入IOmlこ醚,振荡lmin,4000rpm离心2min,获得上层こ醚相和下层沉淀,将下层沉淀中加入5mlこ醚,振荡lmin,4000rpm离心2min,合并所有上层こ醚相,减压浓缩脱除溶剂，即获得藻油井称重，根据公式(2)计算微藻的含油率，结果见图5所示。C、组2 (pH胁迫三天产油)7份藻液分别用lmol/L盐酸调节pH值至1、3、5，用lmol/L氢氧化钠水溶液调节pH值至10、11、12、13。将7份调节pH值后的藻液在室温(25 30°C)静置3天，其它操作同组1，根据公式(2)计算微藻的含油率，结果见图5所示。d、组3 (pH胁迫五天产油):将ー份藻液用体积浓度为5%的盐酸水溶液调节pH值至5，将另ー份藻液用质量浓度为5%的氢氧化钠水溶液调节pH值至11。将2份调节pH值后的藻液在室温(25 30°C)静置5天，其它操作同组1，根据公式(2)计算微藻的含油率，结果见图5所示。根据公式(I)计算微藻采收率η = ODe50·厕'0D^,ms mm χ j00%公式(丄)
肌 K(5l液 公式(I)中0D65(lnmigsai指新鲜微藻细胞接种在改良F/2培养液中，经步骤(I)培养后获得的藻液(即为原藻液)在650nm处的吸光度,OD65tlnm,pHI5sugjjfa是指将原藻液调整pH值静置分层后上层清液在650nm处的吸光度。根据公式(2)计算微藻的含油率
权利要求
1.一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于所述方法为 (1)将新鲜微藻细胞以体积分数5%的接种量接种在相应的微藻培养液中，通入空气，在自然光照下，5 40°C培养至对数生长期后，再在同样条件下培养f 33d，获得藻液； (2 )在步骤(I)获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为I(Γ13，或在步骤(I)获得的藻液中加入酸性水溶液调节PH值为f 5，室温静置f 5d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤，取滤饼即获得藻泥，将藻泥采用有机溶剂A浸提、索氏抽提或酸法提取处理，获得所述藻油；所述有机溶剂A为下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚； (3)将步骤(2)的上层清液调节pH至7 8，获得调节pH值后的上层清液，并检测上层清液组成，将调节PH值后的上层清液各个组成补足至相应微藻培养液组成，获得再生微藻培养液，循环用于微藻培养。
2.如权利要求I所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤(I)所述微藻为淡水微藻或海洋微藻。
3.如权利要求I所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤(I)所述微藻为下列之一眼拟点微绿球藻、杜氏盐藻、葡萄藻或小球藻。
4.如权利要求I所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于所述方法为 (O将新鲜微藻细胞以体积分数5%的接种量接种在相应的微藻培养液中，通入空气，在自然光照下，5 40°C培养至对数生长期后，再在同样条件下培养fl5d，获得藻液；所述微藻为海洋微藻；所述相应的微藻培养液为改良F/2培养液，终浓度组成为NaN0325 1350mg/L、NaH2PO4 · 2H205 270mg/L、Na2SiO3 · 9H20 20mg/L、Na2EDTA 4. 36mg/L、FeCl3 ·6Η203· 16mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 01mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 023mg/L、CoCl2 · 6H200. 012mg/L、MnCl2 · 4H20 0. 18mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 07mg/L、VB1O. I μ g/L、VB2O. 5 μ g/L、生物素0. 5 μ g/L,溶剂为水，pH值为7 8 ； (2)在步骤(I)获得的藻液中加入碱性水溶液调节pH值为1(Γ13，或在步骤(I)获得的藻液中加入酸性水溶液调节PH值为f 5，室温静置f5d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀，将下层沉淀过滤，取滤饼即获得藻泥，将藻泥采用有机溶剂B浸提、索氏抽提或酸法提取处理，获得所述藻油；所述有机溶剂B为下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚； (3)将步骤(2)的上层清液调节pH至7 8，获得调节pH值后的上层清液，在调节pH值后的上层清液中加入硝酸钠和磷酸ニ氢钠，使硝酸钠的终浓度为25 1350mg/L、磷酸ニ氢钠的终浓度为5 270mg/L，获得再生后的改良F/2培养液，循环用于微藻培养。
5.如权利要求4所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤(I)所述微藻为眼拟点微绿球藻。
6.如权利要求4所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤(I)所述培养温度为25 30°C。
7.如权利要求4所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤(I)所述改良F/2培养液中NaNO3的终浓度为225 1350mg/L，相应氮磷质量比为4:1。
8.如权利要求4所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤(2)所述碱性水溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，所述酸性水溶液为硫酸水溶液或盐酸水溶液。
9.如权利要求4所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤(2)所述在步骤(I)获得的藻液中加入碱性水溶液调节PH值为11，室温静置3d使藻液分层，获得上层清液和下层沉淀。
10.如权利要求I或4所述微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法，其特征在于步骤(2)藻泥按下列方法之ー进行处理，提取藻油①有机溶剂浸提将步骤(2)获得的藻泥在70°C下干燥12小时，获得干藻粉a，在干藻粉a中以质量比2:1加入石英砂a，碾磨30min，再加入有机溶剂C，在室温下浸提12小时，过滤，获得滤液和滤饼，将滤饼用相同有机溶剂C在同样条件下浸提3次，合并所有滤液，将滤液减压浓缩脱除溶剂，得到藻油；所述有机溶剂C为下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；所述有机溶剂C的体积用量以干藻粉a质量计为5ml/g 索氏抽提将步骤(2)获得的藻泥在70°C下干燥12小时，获得干藻粉b，在干藻粉b中以质量比2:1加入石英砂b，碾磨30min，加入有机溶剂D，在索氏抽提器中抽提10小时，将抽提液减压浓缩脱除溶剤，即得藻油；所述有机溶剂D为下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；所述有机溶剂D的体积用量以干藻粉b质量计为5ml/g 酸性溶液提取将步骤(2)获得的藻泥在70°C下干燥12小时，获得干藻粉C，在干藻粉c中加入蒸馏水和浓盐酸，在70°C水浴中放置20min，再加入无水こ醇，冷却，加入こ醚a，振荡lmin，4000rpm离心2min,获得上层こ醚相和下层沉淀，在下层沉淀中加入こ醚b,振荡lmin,4000rpm离心2min，合并所有上层こ醚相，减压浓缩脱除溶剂，获得藻油；所述蒸馏水、浓盐酸、无水こ醇、こ醚a和こ醚b的体积用量均以干藻粉c质量计分别为4ml/g、5ml/g、5ml/g、IOml/g和 5ml/g。
全文摘要
本发明公开了一种微藻培养及采收耦合快速积累藻油的方法将新鲜微藻细胞接种在相应的微藻培养液中培养，获得藻液，将藻液调节pH值静置分层，上层清液回收循环用于微藻培养，下层沉淀采用有机溶剂浸提、索氏抽提或酸法提取藻油。本发明方法在微藻生长前期，通过调节培养液中氮、磷浓度，提高微藻生物量；微藻生长后期，通过调节藻液的pH值，形成强碱或强酸环境，胁迫微藻快速积累藻油，同时使微藻絮凝脱水，采收微藻，从而实现培养与采收耦合，简化操作过程，缩短生产时间；培养液的循环利用既节省了培养成本，又避免了培养液排放对环境造成的污染。
文档编号C12R1/89GK102839127SQ201210308939
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者陆向红, 计建炳, 窦晓, 卢美贞 申请人:浙江工业大学