专利名称：阪崎肠杆菌的高特异性基因片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域。更具体地，涉及一种基于阪崎肠杆菌(Cronobacterspp. ) 16S rDNA特异性基因序列的检测方法，还涉及基于此序列并应用磁珠与巢式PCR技术的检测方法。
背景技术：
阪崎肠杆菌是一种食源性条件致病菌，可引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性结肠炎和菌血症等疾病，甚至能导致较高的致死率和严重的神经系统损伤后遗症，及发育障碍(Nazarowecwhite M. , J. M. Farber.Enterobacter sakazakii:A review[J]. InternationalJournal of Food Microbiology, 1997, 34 (2) : 103-113.)。根据临床病例显示，阪崎肠杆菌主要的感染人群为新生儿和免疫力低下的婴幼儿，以及免疫力受损的成年人及老人，其感染致死率高达409Γ80%。目前，尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，然而，根据流行病学研究表 明，临床病例中的大多数病例感染源都是配方奶粉。奶粉中的阪崎肠杆菌的污染问题的严重性引起了世界卫生组织(WHO)及各国对婴幼儿配方奶粉及食品中阪崎肠杆菌的污染情况的高度重视。2002年国际食品微生物标准委员会(ICMSF)将阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症”的一种致病菌。FAO和WHO认为阪崎肠杆菌的所有种都是致病的(Organization World Health. Enterobacter sakazakii and other microorganisms inpowdered infant formula:meeting report. [J]. Microbiological risk assessmentseries,no.6. ΓΟηΙinelhttp ://www.who, int/foodsafety/pubIications/micro/enterobacter sakazakii/en/. 2004.)。2004年，我国在安徽阜阳发生的“大头娃娃”事件中的奶粉样品首次检出阪崎肠杆菌后，制定了针对阪崎肠杆菌在婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中的检测国家标准，同时在出入境检验检疫中也制定了“奶粉中阪崎肠杆菌的检测方法”的行业标准。之后，在我国对境内生产的奶制品以及进口奶制品的检查中，多次检测出多个品牌的奶制品中含有阪崎肠杆菌，其中不乏美赞臣、惠氏、美素等深受中国消费者信赖的国际知名品牌。不只是在我国，在欧美等发达地区，奶粉中含有阪崎肠杆菌的事件也层出不穷，2004年美赞臣就曾因阪崎肠杆菌不合格而召回配方奶粉产品。可见，阪崎肠杆菌并没有特定的区域局限性，这也为预防阪崎肠杆菌感染带来了困难，因此，对阪崎肠杆菌进行灵敏而准确的检测也显得尤为重要。目前，国内外针对奶粉样品中阪崎肠杆菌的检测方法仍以常规培养方法作为标准，由于其检测周期长达5-7天，操作复杂，检测效率低，难以应付现在对于检测过程高通量、高灵敏度、高效率的要求。尽管后期陆续开发出了 PCR和荧光PCR技术的检测手段，并且也被我国的“奶粉中阪崎肠杆菌的检测方法”的行业标准中所采用，但是这两种方法有着较高的假阳性率，最终仍需要采用培养计数的方法加以确认。在细菌基因组中，编码16S rRNA的rDNA基因具有适宜分析的长度(约为15kb)，并且同时具有良好的进化保守性和与进化距离相匹配的良好变异性，即由可变区和恒定区组成，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。在过去的研究中，已经有了一些以阪崎肠杆菌的16S rDNA基因的为目的基因进行的PCR检测技术(Lehner A等人，Gene based analysis of Enterobacter sakazakii strains from differentsource and development of a PCR assay for identification. [J]Molecular andCellular Probes, 2006. 20 (I) : 11—17)、荧光定量 PCR 检测技术 Malorny B 等人，Detection of Enterobacter sakazakii strains by real-time PCR[J]. Journal ofFood Protection. 2005,68(8) :1623-1627)以及荧光探针检测技术(Almeida C 等人，Development and application of a novel peptide nucleic acid oribe for thespecific detection of Cronobacter genomospecies(Enterobacter sakazakii)inpowered infant formula [J]. AppI. Environ. Microbiol, 2009, 75 (9) : 2925-2930),但是目前普遍认为阪崎肠杆菌各菌株之间序列差异较大，16SrDNA基因特异性相对较差，仍存在特异性不高或灵敏度低等问题。因此，为了满足检测要求，急需建立一套更加高效、实用并且准确的阪崎肠杆菌检测手段和方法。
发明内容
本发明提供了阪崎肠杆菌特异性基因片段一 16S rDNA基因的序列片段，并通过制备用于所述特异性基因片段捕获的核酸探针磁珠，结合巢式PCR方法对所捕获富集的目的序列进行检测验证，实现对阪崎肠杆菌的快速检测，为食品安全的监控提供了一种高效、准确的检测手段和方法。本发明的技术方案如下在本发明的第一方面，提供了高特异性的阪崎肠杆菌(Cronobacter spp. ) 16SrDNA基因片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。在本发明的第二方面，提供了以如第一方面所述的核苷酸序列为目的序列的检测方法，优选地，所述方法为以如第一方面所述的核苷酸序列为目的序列的核酸探针磁珠与巢式PCR方法相结合的检测方法。本发明的检测方法可以包括下列步骤(I)以如第一方面所述的核苷酸序列作为目的序列，设计核酸探针与两对引物，并将所述核酸探针的5,末端进行氨基化修饰，其中所述第二对引物的扩增片段的序列包含于所述第一对引物的扩增片段的序列之中；(2)将表面羧基化的磁珠与5'末端氨基化的所述核酸探针进行偶联，制备获得表面包被有核酸探针的核酸探针磁珠；(3)将检测样本进行沸水浴处理，裂解所述检测样本中的阪崎肠杆菌，释放基因组DNA ；(4)将所述核酸探针磁珠加入处理后的所述检测样本中以捕获包含如第一方面所述的核苷酸序列的目的基因，之后通过磁分离将所述核酸探针磁珠所捕获的目的基因从所述检测样本中分离出来；和
(5)以分离出的目的基因为模板，利用所述第一对引物和所述第二对引物进行巢式PCR检测，确定所述检测样品中是否含有阪崎肠杆菌16S rDNA基因。在本发明的检测的方法中，所述核酸探针的序列可以为PB :5' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:2)。在本发明的检测方法中，所述第一对引物可以为CsppFl :5 ' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3 ' (SEQ ID NO:3)和 CsppRl :5 ' -CCTCGCGTGCTCACACA G-3 ' (SEQ IDN0:4)。在本发明的检测方法中，所述第二对引物可以为CsppF2 5' -AGAGACTCTGACACACCGCG-3 ' (SEQ ID NO:5)和 CsppR2 :5 ' -AATGAGTGAAAGGCGTTACCG-3' (SEQ ID N0:6)。在本发明的检测方法中，所述方法可包括下列步骤
(a)制备权利要求2中的所述核酸探针、所述第一对引物和所述第二对引物，并将所述核酸探针的5,末端进行氨基化修饰；(b)将表面羧基化的磁珠与将5'末端氨基化的所述核酸探针进行偶联，制备获得表面包被有所述核酸探针的磁珠；(c)将检测样本进行沸水浴5-15分钟，优选地8-12分钟，更优选地10分钟，裂解所述检测样本中的阪崎肠杆菌，释放基因组DNA序列；Cd)在90-10(TC，优选地92_98°C，更优选地95°C水浴条件下，将表面包被有所述核酸探针的磁珠加入所述检测样本中，混匀后自然冷却至室温，将所获得的混合物在磁力架上进行磁分离，弃上清，并用ddH20洗涤磁珠3-5次后，用20 μ L ddH20重悬磁珠并转移到PCR管中，沸水浴5分钟后立即进行磁珠分离并获取上清作为检测模板；和(e)以所述检测模版为模板，用所述第一对引物和所述第二对引物进行巢式PCR检测，确定检测样品中是否含有阪崎肠杆菌16S rDNA基因。在本发明的第三方面，提供了一种以如第一方面所述的核苷酸序列作为目的序列的核酸探针。本发明的核酸探针序列可以为PB :5 ' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG ACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:2)。在本发明的第四方面，提供了一种以如第一方面所述的核苷酸序列作为目的序列的引物。本发明的引物为CsppFl 5 ' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3 ' (SEQ IDNO: 3)和 CsppRl :5 ' -CCTCGCGTGCTCACACAG-3 ' (SEQ ID NO: 4)或 CsppF2 :5' -AGAGACTCTGACACACCGCG-3 ' (SEQ ID NO:5)和 CsppR2 :5 ' -AATGAGTGAAAGGCGTTACCG-3' (SEQ ID NO:6)。在本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括以如第一方面所述的核苷酸序列作为目的序列设计的核酸探针与两对引物，其中第二对引物的扩增片段的序列包含于第一对引物的扩增片段的序列之中并且优选地所述核酸探针的5,末端进行氨基化修饰。在本发明的试剂盒中，所述核酸探针的序列可以为PB :5^ TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:2)。
在本发明的试剂盒中，所述第一对引物可以为CsppFl 5 ' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3 ' (SEQ ID NO:3)和 CsppRl :5 ' -CCTCGCGTGCTCACAC AG-3 ' (SEQ IDN0:4)。在本发明的试剂盒中，所述第二对引物可以为CsppF2 5 ! -AGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:5)和 CsppR2 :5' -AATGAGTGAAAGGCGTTA CCG-3' (SEQ IDN0:6)。在本发明的第六方面，提供了如第一方面所述的核苷酸序列、如第二方面所述的检测方法、如第三方面所述的核酸探针或、如第四方面所述的引物或如第五方面所述的试剂盒在阪崎肠杆菌的检测中的用途。在本发明的在阪崎肠杆菌的检测中的用途中，所述阪崎肠杆菌的检测可以为对食品或保健品中阪崎肠杆菌的检测。
在本发明的在阪崎肠杆菌的检测中的用途中，所述食品可以为乳制品，米制品或调味料。在本发明的在阪崎肠杆菌的检测中的用途中，所述乳制品可以为牛奶、奶粉或奶酪，更优选地为配方奶粉。在本发明的在阪崎肠杆菌的检测中的用途中，所述配方奶粉可以为婴幼儿配方奶粉或老年配方奶粉在本发明的在阪崎肠杆菌的检测中的用途中，所述米制品可以为米粉。在本发明的在阪崎肠杆菌的检测中的用途中，所述调味料可以为酱油。本发明具有如下有益效果I、本发明的高特异性的阪崎肠杆菌(Cronobacter spp. ) 16S rDNA基因片段的核苷酸序列，对阪崎肠杆菌各菌株都有很好的特异性，以该核苷酸序列为目的序列进行的检测特异性高，假阳性率低；2、本发明采用核酸探针磁珠捕获并分离检测样本中的阪崎肠杆菌的特异性目的基因，从而消除了检测样本中可能含有的PCR抑制因子对检测的影响并且由于对目的基因进行了富集，因此同时也提高了之后进行的PCR检测的灵敏度；3、本发明采用了核酸探针磁珠捕获并分离检测样本中的目的基因序列以及与巢式PCR相结合的方法对检测样本中的阪崎肠杆菌的特异性目的基因进行检测，在整个检测过程中，核酸探针捕获，巢式PCR中的第一轮扩增和第二轮扩增都对目的基因有较高的特异性，因此将核酸探针分离与巢式PCR相结合将显著地减少假阳性率，从而大大增加了检测的准确度。
图I核酸探针特异性检测斑点杂交验证图谱，其中1-32均为阪崎肠杆菌，33-55为非阪崎肠杆菌，M:DL2000DNA Marker ；N :阴性对照。图2巢式PCR引物特异性扩增检测验证图谱，其中1-32均为阪崎肠杆菌，33-55为非阪崎肠杆菌，M:DL2000DNAMarker ；N :阴性对照。图3不同菌体浓度纯培养物样本检测图谱。图4不同菌体浓度的奶粉样本检测图谱。
图5含有高浓度杂菌的不同浓度阪崎肠杆菌的奶粉样本的检测图谱。
具体实施例方式下面结合附图并通过具体实施方式
来进一步说明本发明的技术方案。实施例I :特异性基因片段的获取I、利用16S rDNA通用引物，以阪崎肠杆菌基因组DNA作为模板，扩增获得目的序列；2、通过测序得到详细序列信息，将获得的序列利用NCBI的Blast工具比对分析筛选获得保守性高的片段，以阪崎肠杆菌匹配率高达98%以上，而非阪崎肠杆菌的匹配率低于80%为标准；
3、选取两端的序列，并以引物末端的最后碱基只与阪崎肠杆菌序列匹配，而不与非阪崎肠杆菌序列匹配为标准设计特异性扩增引物，并利用设计的引物对阪崎肠杆菌和非阪崎肠杆菌的基因组DNA进行扩增检测验证；4、对选取的不同序列的结果进行比较和选择，最终获得了对不同阪崎肠杆菌菌株均具有高特异性的一段16S rDNA基因片段，其序列为TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCGCATTCCTGATTACGGAGAAATGCAGCAGCATGTCTGTTTCAATTTTCAGCTTGTTCCGGATTGTTAAAGAGCAAATATCTCAAACGTGACTTTACAGTCAGTTTTGAGATATTAATCGGTAACGCCTTTCACTCATTACCAGCAGGTGGCGTCCCTTAGGGGATTCGAACCCCTGTTACCGCCGTGAAAGGGCGGTGTCCTGGGCCTCTAGACGAAAGGGACTTCGCTTTCGCAGACAACCCTGCTTCTTTACTTTCTATCAGACAATCTGTGTGAGCACGCGAGG (SEQ ID NO :1)。实施例2 :核酸探针特异性验证I、设计特异性核酸探针以实施例I中所筛选获得的特异性序列作为模板，设计阪崎肠杆菌特异性捕获探针，探针的序列如下PB 5/ -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:2)。2、探针特异性检测验证采用Southern Blotting杂交印迹实验对核酸探针的特异性识别、捕获进行验证，详细步骤如下分别取32株阪崎肠杆菌和23株非阪崎肠杆菌(其中包括常见肠道致病菌和益生菌)，并提取每株菌的基因组DNA，95°C热变性5min后，迅速置于冰水浴中(将其处理为单链);分别取热变性处理的基因组DNA点样于NC膜，并以ddH20与生物素分别作为阴性和阳性对照，干燥后置于烘箱中68°C处理2h ;将NC膜浸入3%(w/v)的BSA中封闭Ih后，PBS洗涤2遍后，浸入含有用生物素标记的核酸探针PB的杂交液中，42 °C孵育杂交4h后，PBS洗涤3遍；加入(1:5000稀释)辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素溶液中，37°C孵育Ih后，PBS洗涤3遍；将膜放入新鲜配制的DAB显色液中进行显色，37°C避光显色10-15min后进行观察。杂交反应结束见图I。由此可见本发明中的核酸探针对阪崎肠杆菌具有非常好的特异性。实施例3 :PCR引物特异性验证I、引物的设计以实施例I中所筛选获得的特异性序列为目的序列作为模板，设计阪崎肠杆菌特异性扩增引物，引物序列如下
CsppFl :5' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3' (SEQ ID N0:3)CsppRl :5' -CCTCGCGTGCTCACACAG-3' (SEQ ID NO:4)CsppF2 5/ -AGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQ ID NO:5)CsppR2:5' -AATGAGTGAAAGGCGTTACCG-3' (SEQ ID NO:6)2、引物特异性的验证以上述32株阪崎肠杆菌和23株非阪崎肠杆菌的基因组DNA为模板，通过巢式PCR扩增检测验证引物CsppFl/CsppRl和CsppF2/CsppR2的特异性。步骤如下取各菌株基因组DNA模板进行巢式PCR第一轮扩增，PCR反应体系(20 μ L):2XTaqmix 2yL3_CsppFl/CsppRl (I μ M)各取 I μ L，基因组 DNA lyLjjC7yL。PCR 反应条 件为:预变性95°C 5min ;95°C变性30s，63。。退火30s，72。。延伸30s ;最后充分延伸IOmin0第二轮PCR扩增，取第一轮PCR产物，稀释100倍后作为第二轮PCR扩增的模板，PCR体系中换用引物CsppF2/CsppR2进行扩增，其他条件不变。PCR完成后，取5 μ L第二轮PCR扩增产物在浓度为I. 5%(w/v)的琼脂糖凝胶中进行电泳(电泳条件为5V/cm)，利用凝胶成像系统成像并分析结果，见图2。由此可见本发明中的引物对对阪崎肠杆菌也具有非常好的特异性。实施例4 :核酸探针与表面羧基化磁珠的偶联将Y末端氨基化修饰的核酸探针与表面羧基化修饰的磁珠进行偶联(磁珠购自上海奥润微纳新材料科技有限公司，ISOnm粒径，其表面活化，以及与探针偶联按照产品说明书进行操作)，制备获得能够特异性捕获、富集阪崎肠杆菌的核酸探针磁珠。实施例5 :核酸探针磁珠的样本检测应用I、对不同浓度的阪崎肠杆菌纯培养物样本进行检测利用核酸探针磁珠捕获不同浓度梯度的阪崎肠杆菌纯培养物样本，结合PCR技术检测该方法在纯培养物样本检测中的灵敏度。用无菌的0.01M PBS梯度稀释阪崎肠杆菌纯培养物菌体，得到菌体浓度梯度为:108, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1, 10°CFU/mL的样本，每个2mL的离心管中各装ImL不同浓度的菌体稀释液作为待检测样本。将离心管置于沸水浴IOmin,以裂解细胞释放基因组DNA ;在951水浴条件下(以保持基因组DNA双链变性状态)，向每个离心管中加入O. 4mg核酸探针磁珠进行序列捕获，混匀后待其自然冷却至室温；将离心管置于磁力架进行磁分离，弃上清，并用ddH20洗涤磁珠3次后，各用20 μ L ddH20重悬磁珠并转移到新的PCR管中，沸水浴5min后立即进行磁分离取上清；以分离得到的上清作为扩增模板，用于巢式PCR检测验证，步骤如上所述，电泳结果见图3。2、对不同浓度阪崎肠杆菌的奶粉样本进行检测奶粉样本的制备按照Ig奶粉(已验证不含阪崎肠杆菌)用9mL无菌水充分溶解混匀；将新鲜培养的阪崎肠杆菌菌体在奶粉样品中进行梯度稀释，分别得到浓度为108，IO7, IO6，IO5, IO4, IO3, IO2, IO1, 10°CFU/mL的奶粉样本，每个2mL的离心管中各装ImL不同浓度的菌体稀释液作为待检测样本。磁珠捕获及PCR检测步骤同上所述，电泳检测结果见图4。3、对含有高浓度杂交的不同浓度阪崎肠杆菌的奶粉样本进行检测为了模拟并考察样本中可能存在的高浓度杂菌是否会影响该方法的检测灵敏度，通过向不同浓度阪崎肠杆菌的奶粉样本中，添加高浓度的杂菌(108CFU/mL的沙门氏菌ATCC13311)，并利用核酸探针磁珠和巢式PCR进行捕获和检测，PCR电泳检测图谱见图5。
4、对调味料样本的检测从市场采集、购买了 50份调味料样本(包括散装销售的样本)，根据上述方法进行样本处理及检测。检测结果数据统计见表I。表I
样本总数阳性样本数阴性样本数阳性率
*>0 1614 32%同时对这50份调味料样本进行了传统的培养计数检测，结果与采用本发明的方法进行检测的结果完全一致。 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细结构特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
权利要求
1.高特异性的阪崎肠杆菌(Cronobacterspp. ) 16S rDNA基因片段的核苷酸序列,所述核苷酸序列为SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。
2.以如权利要求I的核苷酸序列为目的序列的检测方法，所述方法为以如权利要求I的核苷酸序列为目的序列的核酸探针磁珠与巢式PCR方法相结合的检测方法。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于包括下列步骤 (O以如权利要求I所述的核苷酸序列作为目的序列，设计核酸探针与两对引物，并将所述核酸探针的5,末端进行氨基化修饰，其中所述第二对引物的扩增片段的序列包含于所述第一对引物的扩增片段的序列之中； (2)将表面羧基化的磁珠与5,末端氨基化的所述核酸探针进行偶联，制备获得表面包被有核酸探针的核酸探针磁珠； (3)将检测样本进行沸水浴处理，裂解所述检测样本中的阪崎肠杆菌，释放基因组DNA ； (4)将所述核酸探针磁珠加入处理后的所述检测样本中以捕获包含如权利要求I所述的核苷酸序列的目的基因，之后通过磁分离将所述核酸探针磁珠所捕获的目的基因从所述检测样本中分离出来；和， (5)以分离出的目的基因为模板，利用所述第一对引物和所述第二对引物进行巢式PCR检测，确定所述检测样品中是否含有所述目的序列。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核酸探针的序列为PB:5'TCGTGCTGCGAGTTTGAGAGACTCTGACACACCGCG-3 ' (SEQ ID NO: 2);所述第一对引物为 CsppFl 5' -TCGTGCTGCGAGTTTGAGAG-3' (SEQ ID NO:3)和 CsppRl :5' -CCTCGCGTGCTCACACAG-3'(SEQ ID N0:4)和 / 或所述第二对引物为 CsppF2 :5' -AGAGACTCTGACACACCGCG-3' (SEQID N0:5)和 CsppR2 :5' -AATGAGTGAAAGGCGTTACCG-3' (SEQ ID NO:6)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (a)制备权利要求2中的所述核酸探针、所述第一对引物和所述第二对引物，并将所述核酸探针的5,末端进行氨基化修饰； (b)将表面羧基化的磁珠与将5,末端氨基化的所述核酸探针进行偶联，制备获得表面包被有所述核酸探针的磁珠； (c)将检测样本进行沸水浴5-15分钟，优选地8-12分钟，更优选地10分钟，裂解所述检测样本中的阪崎肠杆菌，释放基因组DNA序列； Cd)在90-10(TC，优选地92-98°C，更优选地95°C水浴条件下，将表面包被有所述核酸探针的磁珠加入所述检测样本中，混匀后自然冷却至室温，将所获得的混合物在磁力架上进行磁分离，弃上清，并用ddH20洗涤磁珠3-5次后，用20 μ L ddH20重悬磁珠并转移到PCR管中，沸水浴5分钟后立即进行磁珠分离并获取上清作为检测模板；和 Ce)以所述检测模版为模板，用所述所述第一对引物和所述第二对引物进行巢式PCR检测，确定检测样品中是否含有所述目的序列。
6.以如权利要求I所述的核苷酸序列作为目的序列的核酸探针，优选地，所述核酸探针为 SEQ ID NO:2。
7.以如权利要求I所述的核苷酸序列作为目的序列的引物，优选地，所述引物为SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4 或 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6。
8.一种试剂盒，所述试剂盒包括以如权利要求I所述核苷酸序列作为目的序列的核酸探针与两对引物，其中第二对引物的扩增片段的序列包含于第一对引物的扩增片段的序列之中并且优选地所述核酸探针的5'末端进行氨基化修饰，优选地，所述核酸探针的序列为SEQ ID NO:2 ;所述第一对引物为SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4和/或所述第二对引物为SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6。
9.如权利要求I所述的核苷酸序列、如权利要求2-5中任一项所述的检测方法、如权利要求6所述的核酸探针、如权利要求7所述的引物或权利要求8所述的试剂盒在阪崎肠杆菌的检测中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述阪崎肠杆菌的检测为对食品或保健品中的阪崎肠杆菌的检测，优选地，所述食品为乳制品，米制品或调味料，其中所述乳制品优选地为牛奶、奶粉或奶酪，更优选地为配方奶粉，最优选地为婴幼儿配方奶粉或老年配方奶粉，所述米制品优选地为米粉，所述调味料优选地为酱油。
全文摘要
本发明涉及一种基于阪崎肠杆菌(Cronobacter spp.)16S rDNA基因序列，结合磁珠及巢式PCR技术对阪崎肠杆菌进行特异性检测的方法。本发明的优点是利用阪崎肠杆菌16S rDNA基因序列的特异性探针及引物，结合磁珠到达对样本中阪崎肠杆菌目的基因进行快速、特异地捕获和富集，最后通过巢式PCR技术进行扩增检测，提高检测的灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK102816761SQ20121030811
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者李林, 杨晓慧, 许恒毅, 徐锋 申请人:无锡中德伯尔生物技术有限公司