专利名称：检测炭疽杆菌的引物、双重lamp检测炭疽杆菌的试剂盒及快速可视化检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于以LAMP法检测炭疽杆菌的引物、含有该引物的试剂盒、采用该试剂盒的检测方法、以及针对该试剂盒的检验方法，属于生物技术领域。
背景技术：
炭疽杆菌是人畜共患致病菌，可通过皮肤接触、呼吸道及消化道感染人和动物，具有高度致病性，其中肺炭疽被列为中国国家法定甲类传染病(最高级别)。炭疽杆菌可通过空气飞沫传播，可形成气溶胶，易引发突发公共卫生事件；而炭疽杆菌芽孢可存活十年以上，可构成公共卫生隐患。炭疽杆菌严重威胁人类健康和生命安全，其检测和预防一直倍受 重视。然而，目前的检测方法面临两个主要问题一是如何在条件较简陋的事发现场快速确定是否存在炭疽杆菌；二是如何快速诊断出炭疽强毒株，以挽救吸入性感染炭疽强毒株的病人生命，同时确定针对目标人群的强制性隔离防疫措施等。传统炭疽杆菌的检测诊断都是基于形态学特征或表型特征，如革兰氏阳性染色试验、噬菌体试验、串珠和青霉素抑制试验、拉丝试验〈粘型菌落〉、溶血试验、芽孢形成试验等，这些方法在一定程度上都存在着费时、操作繁琐、灵敏度低等缺点，均不适合早期快速侦检。现有技术中，免疫胶体金技术、常规PCR及DNA探针杂交技术，均存在特异性和敏感性的问题；实时荧光定量PCR技术灵敏度高，可靠性好，是全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，无法在很多中小医院和基层防疫机构普及，且为了保证高特异性往往需要荧光标记探针，检测成本较高。此外，精密贵重仪器对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，难以在疫情现场使用。2000年，日本学者Notomi等开发出一种新技术——LAMP法(环介导等温扩增法)，扩增反应全过程均在同一温度下进行，不须像PCR反应那样需要经历几十个温度变化的循环过程，因此对扩增所需仪器的要求大大简化，仅需水浴锅或其它小型恒温加热器即可，并且反应时间缩短。LAMP法的基本原理是针对靶基因的6个区域设计4飞条引物(包括2条内引物和2条外引物，可另加2条非必需的环引物)，在具有链置换特性的Bst DNA聚合酶作用下，外引物的延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，然后进入循环扩增阶段，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。LAMP法具有以下优点(I)较高特异性和抗干扰能力，只有当2对引物与目的片段的6个区域都匹配上时才能进行扩增；(2)反应体系稳定可靠，在室温下放置2周后仍然稳定，并且对于样品中原有或污染的无关、干扰片段仍然不敏感，而其他类似技术则无法做到这一点；(3)敏感性较高，扩增快速、高效，I小时内产物量可达约IOltl倍，约为普通PCR的1000倍。因此，LAMP法为病原微生物的核酸检测提供了一个更简便、更快速、更有效的手段，尤其适用于疫情现场、野外工作、基层单位等条件相对简陋的环境。但是，目前应用于病原体检测的LAMP法，几乎都存在一个关键问题LAMP扩增产物的检测手段主要是扩增结束后开盖加入荧光染料SYBR Green I等显色液，但在此过程中，很难避免核酸气溶胶污染所致的后续假阳性结果。出现假阳性的主要原因是由于扩增结束后核酸片段产物量过于巨大，往往又是同一片段的重复序列，加热后会形成气溶胶，开盖后即挥散在空气、尘埃中以及器皿、衣物、工作台和耗材试剂等表面，而LAMP方法又过于灵敏，气溶胶污染后将造成后续检测的高假阳性率。日本荣研公司的LA-320实时浊度仪专用于LAMP法，可实时监测浊度变化，无需开盖，可避免前述假阳性现象，但该仪器价格昂贵约60万元，限制了其推广应用。此外，值得注意的是，现有利用某单一基因鉴定炭疽杆菌的方法并不完全可靠炭疽杆菌与枯草芽孢杆菌等其它蜡样菌群有很高的同源性，重要区别在于炭疽杆菌含有2个与毒力密切相关的特异性质粒(pXOl和pX02) ;pX01质粒上包含分别编码致死因子、保护性抗原、水肿因子的lef、PA和cya基因，pX02质粒上则包含与芽孢形成有关的基因如 capA、capB、capC基因。目前已有的炭疽杆菌核酸检测方法基本上都会检测这些质粒上的特异致病因子，但是炭疽杆菌的质粒并不稳定，容易缺失而使炭疽杆菌成为弱毒株或无毒株，而且自然环境下这些质粒可被导入其它菌株，即在普通蜡状芽胞杆菌群间水平转移。相较之下，炭疽杆菌的染色体表达相对稳定，可在准确鉴定中发挥重要作用。经检索发现，申请号201110044466. 8、公布号为CN102146470A的中国发明专利申请提供一种炭疽芽孢杆菌检测试剂盒及其使用方法，包括以炭疽芽孢杆菌PA基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。但是，该试剂盒仅能检测到核酸来源是否含有炭疽杆菌质粒PX01，也就是说，有可能会误检到含有毒性质粒PXOl的蜡状芽胞杆菌。此外，该专利为了避免气溶胶污染，必须使用特制反应管，但这样一来，使用者必须额外购买这种反应管，增加使用成本，很不方便。
发明内容
本发明的第一目的是针对现有技术存在的问题，提供一种用于以LAMP法检测炭疽杆菌的引物，可用于确证是否存在炭疽杆菌。本发明的第二目的是提供含有上述引物的试剂盒，可确证是否存在炭疽杆菌。本发明的第三目的是提供采用前述试剂盒的检测方法，可不用开盖即实现可视化检测，避免出现假阳性现象，无需使用昂贵的实时浊度仪。本发明的第四目的是提供针对前述试剂盒的检验方法，确保使用正常的试剂盒来得到可靠的结果。申请人:经研究发现炭疽杆菌染色体中的gyrB基因高度保守，若作为鉴定目标，则可确保炭疽杆菌鉴定的准确性；与PA基因相比，炭疽杆菌质粒pXOl上编码致死因子的Ief基因与炭疽杆菌致病性的关联度更高，更具有代表性，更适宜作为鉴定目标。通常认为，在扩增前就将显色剂加入反应体系应能避免扩增后开盖导致的气溶胶污染，然而实际研究表明，采用现有反应体系时，扩增前加入显色剂会导致显色剂不稳定、失效或严重抑制扩增反应进行，无法进行检测。申请人经反复深入地实验研究后，终于得出在扩增前加入显色剂仍能正常检测的炭疽杆菌核酸恒温扩增反应体系，反应结束时即显示出结果且重复性良好，不存在扩增后开盖操作，从而彻底解决了气溶胶污染问题。同时，该反应体系使用普通反应管即可实现，非常方便。结合上述发现，实现本发明第一目的的技术方案如下一种用于LAMP检测炭疽杆菌的引物，其特征是，包括Ief引物序列集和gyrB引物序列集；其中，Ief引物序列集包括外引物对LF-F3和LF-B3，以及内引物对LF-FIP和LF-BIP ；LF-F3的序列如SEQ ID NO: I所示，LF-B3的序列如SEQ ID NO: 2所示，LF-FIP的序列如SEQ ID NO:3 所示，LF-BIP 的序列如 SEQ ID NO:4 所示；gyrB引物序列集包括外引物对gy_F3和gy_B3,内引物对gy-FIP和gy-BIP,以及环引物对gy-LF和gy-LB ;gy-F3的序列如SEQ ID NO: 5所示，gy_B3的序列如SEQ ID NO: 6所示，gy-FIP的序列如SEQ ID NO: 7所示,gy-BIP的序列如SEQ ID NO: 8所示,gy-LF的序列如SEQ ID NO:9所示，gy-LB的序列如SEQ ID NO: 10所示。采用该引物后，既检测炭疽杆菌质粒pXOl，又检测炭疽杆菌染色体，可用于确证是否存在炭疽杆菌。结合上述发现，实现本发明第二目的的技术方案如下一种双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，包括前述用于以LAMP法检测炭疽杆菌的引物。采用该试剂盒后，可确证是否存在炭疽杆菌。实现本发明第三目的的技术方案如下一种双重LAMP检测炭疽杆菌的快速可视化检测方法，其特征是，采用前述以LAMP法检测炭疽杆菌的试剂盒，该方法包括以下步骤第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B ;其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入II管的引物混合液；试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水的体积比为(8-12)(I. 5-3. 5) (0. 5-1. 5) (0. 3-0. 9) (3. 1-4. 7)；第二步、向反应管A、B中分别加入体积相同的待测核酸样品，盖好反应管A、B后混匀；第三步、将反应管A、B先分别在60°C _64°C恒温条件下放置45_80min进行LAMP扩增，再置于80°C -95°C 5-10min灭活BstDNA聚合酶；第四步、观察反应液A、B的颜色，若两者颜色均为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有炭疽杆菌强毒株或弱毒株；若两者颜色均为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源不含炭疽杆菌；若反应液A颜色为紫罗兰色，且反应液B颜色为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有炭疽杆菌弱毒株或无毒株；若反应液A颜色为天蓝色，且反应液B颜色为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源含有具有毒性质粒PXOl的蜡样芽胞杆菌。采用该检测方法后，可不用开盖即实现可视化检测，避免出现假阳性现象，无需使用昂贵的实时浊度仪。实现本发明第四目的的技术方案如下一种针对前述双重LAMP检测炭疽杆菌试剂盒的检验方法，其特征是，包括以下步骤第一步、制备两套含反应液A的反应管A、含反应液B的反应管B:向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B ;其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入II管的引物混合液；试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水的体积比为(8-12) :(1. 5-3. 5) :(0. 5-1. 5)(O. 3-0. 9) (3. 1-4. 7)；第二步、向第一套反应管A、B中分别加入体积相同的蒸馏水，盖好反应管A、B后混匀，作为阴性对照；向第二套反应管A、B中分别加入体积相同的阳性对照品，盖好反应管A、B后混匀，作为阳性对照；蒸馏水、阳性对照品的加入体积相同；第三步、将反应管A、B先分别在60°C _64°C恒温条件下放置45_80min进行LAMP扩增，再置于80°C -95°C 5-10min灭活BstDNA聚合酶；第四步、观察阴性对照反应液A、B和阳性对照反应液A、B的颜色，若阴性对照反应液A、B颜色均为紫罗兰色，且阳性对照反应液A、B颜色均为天蓝色，则第一步所用试剂盒是正常的；若各反应液颜色与前述情况不完全相符或完全不相符，则第一步所用试剂盒不正
堂
巾O采用该验证方法后，可确保使用正常的试剂盒来得到可靠的结果。本发明结果可靠，成本相对较低，尤其适用于条件简陋的卫生事件现场。
图I为本发明实施例2阳性对照品质粒PGEM-Ief-gyrb的示意图。图2为图I实施例PGEM-T easy载体的示意图。图3为本发明实施例5检测结果图。图4为本发明实施例6电泳结果图。
具体实施例方式下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。以下内容中涉及的实验操作，如未注明具体实验条件，则按照常规条件进行，例如，可参照SAMBR00K. J等编著的《分子克隆实验指南》第3版(Molecular Cloning:ALaboratory Manual; NEW York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中述及的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下内容中涉及的实验材料和试剂，如未特别说明则为市售品。实施例I :lef、gyrB引物序列集首先，在NCBI (美国国立生物技术信息中心)GenBank数据库中检索获得炭疽杆菌质粒PXOl的Ief基因序列和炭疽杆菌染色体的gyrB基因序列，并通过ClustalX软件进行序列比对，得到两种基因的特异性保守序列；然后，通过LAMP引物设计软件(PrimerExplorer software, version 4. 0),针对上述特异性保守序列分别进行LAMP引物设计,得到可应用于同一反应体系的lef、gyrB引物序列集。Ief引物序列集包括外引物对LF-F3和LF-B3，以及内引物对LF-FIP和LF-BIP。LF-F3的序列如SEQ ID NO: I所示;LF_B3的序列如SEQ ID NO: 2所示；LF-FIP的序列如SEQ ID NO: 3 所示；LF-BIP 的序列如 SEQ ID NO:4 所示。gyrB引物序列集包括外引物对gy_F3和gy_B3,内引物对gy_FIP和gy-BIP,以及环引物对gy-LF和gy-LB。gy-F3的序列如SEQ ID NO: 5所示；gy_B3的序列如SEQ ID NO: 6所示；gy-FIP的序列如SEQ ID NO: 7所示；gy-BIP的序列如SEQ ID NO: 8所示；gy-LF的序列如SEQ ID NO:9所示；gy-LB的序列如SEQ ID NO: 10所示。实施例2 以LAMP法检测炭疽杆菌的试剂盒本实施例试剂盒包括实施例I的Ief引物序列集和gyrB引物序列集。其中，由Ief引物序列集构成的引物混合液放置于I管中，外引物对LF-F3和LF-B3与内引物对LF-FIP和LF-BIP的摩尔比为I: (5-10)，优选1:8 ;由gyrB引物序列集构成的引物混合液放置于II管中，外引物对gy_F3和gy_B3、内引物对gy-FIP和gy-BIP、及环引物对gy-LF和gy-LB的摩尔比为I: (5-10) : (2-6)，优选1:8:4。例如1管中，每2· 5μ I弓丨物混合液含有4pmol LF_F3、4pmol LF-B3、32pmolLF-FIP、及 32pmol LF-BIP ； II管中，每 2· 5μ I 引物混合液含有 4pmol gy_F3、4pmolgy-B3、32pmol gy-FIP>32pmoI gy-BIP、16pmol gy-LB、及 16pmol gy-LF。
本实施例试剂盒还包括(I)阳性对照品含有炭疽杆菌Ief基因片段及gyrB基因片段的质粒PGEM-lef-gyrb(按常规分子克隆方法获得)，其浓度为20_100mg/L，优选50mg/L。如图I至图2所示，质粒PGEM-Ief-gyrb由PGEM-T easy载体、Ief基因、gryB基因连接组成，Ief 基因序列如SEQ ID NO: 11所示，gryB基因序列如SEQ ID NO: 12所示。(2) 2X反应缓冲液该反应缓冲液含有30-60mmol/L (优选40mmol/L) ρΗ8· 8的Tris-HCl，16-30mmol/L(优选 20mmol/L)的 KCl，10_30mmol/L(优选 20mmol/L)的(NH4)2SO4,质量浓度为O. 1-0. 3% (优选O. 2%)的Triton X-100,由浓度均为2. 0-3. 6mmol/L (优选
2.8mmol/L)的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 组成的 dNTPs，O. 1-2. OmmoI/L (优选 I. 6mmol/L)的甜菜碱(C5H11NO2),以及 14_18mmol/L (优选 16mmol/L)的 MgCl2。(3)浓度为6_12υ/μ I (优选8U/μ I)的BstDNA聚合酶(大片段，美国NEB公司)。(4)显色液浓度为2_20mmol/L (优选4mmol/L)的金属离子指示剂HNB (hydroxynaphthol blue,羟基萘酚蓝)储存液，在反应前加入反应体系内，从而实现不开盖可视化检测。具体地，指示剂HNB购自美国Sigma-Alorich公司，货号CAS 63451_35_4，规格33936-10G ;该指示剂加入反应体系后的终浓度为120-160 μ mol/L。需要说明的是，以上(2)的配方、(3)的浓度以及(4)的浓度是决定显色剂在扩增前加入反应体系仍能正常显色并且重复性良好的重要因素，是申请人经过反复实验、深入研究才得出的，是申请人付出大量心血的结晶。实施例3 以LAMP法检测炭疽杆菌的快速可视化检测方法本实施例检测方法采用实施例2试剂盒进行检测。本实施例检测方法包括以下步骤第一步、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B ;其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入II管的引物混合液；试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水的体积比为(8-12)(I. 5-3. 5) (0. 5-1. 5) (0. 3-0. 9) (3. 1-4. 7)；例如，反应液A可以按下表得到
权利要求
1.一种用于LAMP检测炭疽杆菌的引物，其特征是，包括Ief引物序列集和gyrB引物序列集；其中， Ief引物序列集包括外引物对LF-F3和LF-B3，以及内引物对LF-FIP和LF-BIP ;LF_F3的序列如SEQ ID NO: I所示，LF-B3的序列如SEQ ID NO: 2所示，LF-FIP的序列如SEQ IDNO: 3所示，LF-BIP的序列如SEQ ID NO:4所示； gyrB引物序列集包括外引物对gy_F3和gy_B3,内引物对gy_FIP和gy-BIP,以及环引物对gy-LF和gy-LB ；gy-F3的序列如SEQ ID NO: 5所示，gy-B3的序列如SEQ ID NO:6所示，gy-FIP的序列如SEQ ID NO: 7所示,gy-BIP的序列如SEQ ID NO: 8所示,gy-LF的序列如SEQ ID N0:9所示，gy-LB的序列如SEQ ID NO: 10所示。
2.一种双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，包括权利要求I所述用于LAMP检测炭疽杆菌的引物。
3.根据权利要求2所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，还包括2X反应缓冲液，所述反应缓冲液含有30-60mmol/L pH8. 8的Tris_HCl，16-30mmol/L的KC1，10-30mmol/L 的(NH4) 2S04，质量浓度为 0· 1-0. 3% 的 TritonX-100，由浓度均为 2· 0-3. 6mmol/L 的 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 组成的 dNTPs，0. 1-2. OmmoI/L 的甜菜碱 C5H11NO2,以及14~1 Hmmol /I,的 MgCl2。
4.根据权利要求3所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，还包括浓度为6-12U/ μ I的BstDNA聚合酶，以及浓度为2-20mmol/L的金属离子指示剂HNB储存液。
5.根据权利要求4所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，其特征是，还包括阳性对照品:浓度为20-100mg/L的含有炭疽杆菌Ief基因片段及gyrB基因片段的质粒PGEM-lef-gyrb。
6.一种双重LAMP检测炭疽杆菌的快速可视化检测方法，其特征是，采用权利要求5所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒，该方法包括以下步骤 第一歩、向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B ;其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入II管的引物混合液；试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水的体积比为(8-12)(I. 5-3. 5) (0. 5-1. 5) (0. 3-0. 9) (3. 1-4. 7)； 第二步、向反应管A、B中分别加入体积相同的待测核酸样品，盖好反应管A、B后混匀； 第三步、将反应管A、B先分别在60°C _64°C恒温条件下放置45-80min进行LAMP扩增，再置于80°C -95°C 5-10min灭活BstDNA聚合酶； 第四步、观察反应液A、B的顔色，若两者颜色均为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有炭疽杆菌强毒株或弱毒株；若两者颜色均为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源不含炭疽杆菌；若反应液A颜色为紫罗兰色，且反应液B顔色为天蓝色，则待测核酸样品的来源含有炭疽杆菌弱毒株或无毒株；若反应液A顔色为天蓝色，且反应液B颜色为紫罗兰色，则待测核酸样品的来源含有具有毒性质粒PXOl的蜡样芽胞杆菌。
7.ー种针对权利要求5所述双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒的检验方法，其特征是，包括以下步骤 第一歩、制备两套含反应液A的反应管A、含反应液B的反应管B :向透明反应管A、B中分别加入体积相同的试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA聚合酶、显色液、超纯水，然后混合，得到体积相同的反应液A、B ;其中反应管A中加入I管的引物混合液，反应管B中加入II管的引物混合液；试剂盒2X反应缓冲液、I管或II管的引物混合液、BstDNA 聚合酶、显色液、超纯水的体积比为(8-12) (I. 5-3. 5) (O. 5-1. 5) (O. 3-0. 9)(3. 1-4. 7)； 第二步、向第一套反 应管A、B中分别加入体积相同的蒸懼水,盖好反应管A、B后混匀，作为阴性对照；向第二套反应管A、B中分别加入体积相同的阳性对照品，盖好反应管A、B后混匀，作为阳性对照；蒸馏水、阳性对照品的加入体积相同； 第三步、将反应管A、B先分别在60°C _64°C恒温条件下放置45-80min进行LAMP扩增，再置于80°C -95°C 5-10min灭活BstDNA聚合酶； 第四步、观察阴性对照反应液A、B和阳性对照反应液A、B的顔色，若阴性对照反应液A、B顔色均为紫罗兰色，且阳性对照反应液A、B顔色均为天蓝色，则第一歩所用试剂盒是正常的；若各反应液颜色与前述情况不完全相符或完全不相符，则第一歩所用试剂盒不正常。
全文摘要
本发明涉及一种用于以LAMP法检测炭疽杆菌的引物、双重LAMP检测炭疽杆菌的试剂盒、双重LAMP检测炭疽杆菌的快速可视化检测方法、以及针对该试剂盒的检验方法。该引物包括lef引物序列集和gyrB引物序列集，既可以检测炭疽杆菌质粒pX01，又可以检测炭疽杆菌染色体。该试剂盒包括前述引物，可获得准确的检测结果。该检测方法采用前述试剂盒进行，可不用开盖即实现可视化检测，避免出现假阳性现象，无需使用昂贵的实时浊度仪。该检验方法可确保使用正常的试剂盒来得到可靠的结果。本发明结果可靠，成本相对较低，尤其适用于条件简陋的卫生事件现场。
文档编号C12N15/11GK102816849SQ20121030698
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者张锦海, 王长军, 谭维国, 吕恒, 曹勇平 申请人:中国人民解放军南京军区军事医学研究所