专利名称：一株醋杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是微生物和果醋酿造技术，特别是一株醋杆菌及其在沙棘果醋生产中的应用。
背景技术：
在果醋酿造中，醋酸菌是发酵的原动力，要取得发酵的高效率，就要有优良的生产菌种。当前我国果醋厂家使用的菌种都是食醋菌种，其产酸能力，产酯能力都有待提高，其发酵产生的果醋风味一般也不佳。因此，需选育优良的果醋专用菌种，而有关果醋专用醋酸菌的研究报道不多，并且绝大多数都是以食醋醪液为菌源，进行分离筛选，或直接将食醋菌种ASl. 41 (A. rancens L.)恶臭醋酸杆菌浑池变种和沪酿I. 01醋酸杆菌Cl Iovaniense L.)进行高酸驯化，诱变选育，转而将它们直接应用在果醋酿造的生产过程中。目前尚无沙棘果醋发酵的优良醋酸菌，由于沙棘果酒酸度较高，在以沙棘果酒为原料进行的果醋发酵中，目前的ASl. 41和沪酿I. 01，存在着发酵不彻底，醋酸转化率低、容易发生醋酸过氧化反应等缺点。因此，在沙棘果醋生产过程中，只有重点解决优良醋酸菌的选育、最佳发酵工艺参数的确定等技术问题，才能从根本上解决醋酸转化率低、产品质量稳定性差的问题。这无疑会全面推动沙棘果醋深加工产品的开发，提高沙棘果醋及果醋饮料的生产水平，为沙棘果醋企业的生产提供巨大的原动力，会带动和提升沙棘产业的发展，经济效益、社会效益显著，具有广阔的市场前景和发展潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一株醋杆菌，这株菌能有效适应沙棘果醋发酵，用于克服目前果醋酿造中常用的ASl. 41和沪酿I. 01在沙棘醋发酵中醋酸转化率低、容易发生醋酸过氧化反应的缺陷，醋杆菌deioAacier sp. SJA-I)已于2009年10年20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 3347。醋杆菌Uce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的分离源为自然发酵的沙棘醋醪；该菌在分离培养基(酵母膏1%，葡萄糖1%，CaC032%，琼脂2%，无水乙醇4%(v/v)，pH5. 5)上生长良好，最适生长温度在30°C 34°C ;菌落形态规则，呈圆形突起，颜色为乳白色，表面有光泽，平板培养5d，菌落直径在O. Γ0. 2mm，透明圈直径O. 5^1. Ocm ;革兰氏染色呈阴性，菌体大小为(O. 6 1· O) X (I. 0" . 8) μ m,短杆状，无芽孢；醋杆菌(JceioAaciersp. SJA-1) CGMCC No. 3347的个体形态特征及革兰氏染色结果见说明书附图I、图2。使用Blast 对醋杆菌(JceioAacier sp. SJA-I )CGMCC No. 3347 的 16S rDNA基因序列，和 GenBank中已登录细菌进行同源性比对，鉴定为醋杆菌Xceio如cier sp.。醋杆菌
sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的系统进化树见说明书附图3。本发明的另一个目的是将上述醋杆菌(Acetobacter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347，用于以沙棘酒为原料的沙棘果醋的制备，生产优质沙棘果醋的方法。
具体的应用方法将醋杆菌Uce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347接种至下述种子培养基中葡萄糖I. 32%，酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5. O ;在接种量10%，装液量100mL/500mL，摇床转速150r/min下，于32°C下培养24h ;然后以7°/Γ Ο%的接种量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度59T7% (vol，20°C)，初始pH3. 5^4. 5，装液量 75mL/500mL 125mL/500mL，摇床转速 9(Tl50r/min，于 30 34°C下发酵5d 6d。本发明具有的积极效果本发明中的醋杆菌(Acetobacter sp. SJA-1) CGMCCNo. 3347的分离源为自然发酵的沙棘醋醪，经培养、筛选、优化后分离得到的全新菌株，安全性优越；该菌株能充分适应沙棘酒较高的酸度，发酵速度快，醋酸转化率高，不容易发生醋酸过氧化反应。用该醋杆菌生产的沙棘果醋，残糖低，酸度高，果香浓郁，酸味突出，具有独特的沙棘果醋风格。
图I 为醋杆菌 Uce ο如cier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347 个体形态特征(X400)； 图2为醋杆菌Mce ο如cier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的革兰氏染色结果(X 400)； 图3为醋杆菌Mce ο如cier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的系统进化树。保藏信息
菌株名称醋杆菌 deioAacier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347 ；
保藏日期2009年10年20日；
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所菌种保藏中
心；
保藏编号CGMCC No. 3347。
具体实施例方式菌株名称醋杆菌Uce ο如ciersp. SJA_1)CGMCC No. 3347，已经于 2009 年 10 年20日在位于中国北京市的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏号为CGMCC No. 3347。下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。在下面的实施例中，所用的菌种均为醋杆菌(Acetobacter sp. SJA-1) CGMCCNo. 3347，实施例中所用的不同培养基配方如下
基础培养基酵母膏1%，葡萄糖I %，pH4. 5，蒸馏水100mL。增殖培养基6°Bx的麦芽汁97mL，酵母膏lg，葡萄糖lg，KH2P04 0. 5g，pH5. 5，95%无水乙醇3mL。分离培养基酵母膏1%，葡萄糖1%，CaC032%,琼脂2%，无水乙醇4mL，蒸馏水96mL。种子培养基葡萄糖I. 32%，酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，无水乙醇3mL，K2HPO4
0.18%, pH 5. 0，蒸馏水 97mL。斜面培养基酵母膏1%，葡萄糖1%，CaCO3L 5%，琼脂2%，pH5. 5，无水乙醇4mL，蒸馏水 96mL。
斜面保藏培养基；酵母膏1%，葡萄糖l%，CaC03l%，琼脂I. 8%，pH4. 5，无水乙醇3mL，蒸懼水97mL。产酸试验培养基酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 4. 5,无水乙醇6mL,蒸懼水94mL。实施例I :醋杆菌deioAacier sp. SJA-1) CGMCC No. 3347的分离筛选与鉴定
I.菌株的分离筛选
(I)菌株分离
取IOg室温下经过自然酒精发酵、自然醋酸发酵后的混匀沙棘醋醪液样品，放入装有IOOmL基础培养基的500mL三角瓶中，加入6%的无水乙醇，在120r/min，30°C的电热气浴摇床中增殖培养，每天补加1%的无水乙醇，取发酵液稀释到10_5，10_6，10_7浓度，涂布于平板分离培养基上，连涂5d，每一稀释度涂布3个平板，每个平板用O. ImL稀释液，涂好后30°C倒置培养48h，挑取钙溶解圈较大，菌落丰富，具有生长优势的单菌落进行纯化培养，然后将纯化后的菌株接于斜面保藏培养基中，编号，在30°C下培养24h后保藏于4°C冰箱中。(2)产酸定性试验
将上述斜面菌株分别接种于产酸试验培养基中，于30°C, 120r/min电热气浴摇床恒温培养箱中培养6d后，取离心除去菌体的培养液5mL，用O. lmol/L的NaOH中和，将中和液煮沸，加入5%的氯化铁溶液2 3滴，形成红褐色沉淀者为产醋酸细菌。(3)产酸定量复筛试验
取选出的菌株的斜面菌体两环，分别接入液体种子培养基中，于30°C、120r/min的恒温摇床培养箱内活化24h，再按10%的接种量转入接种到装有IOOmL产酸试验培养基的500mL三角瓶中，置于30°C、转速为120r/min的恒温摇床培养箱内培养6d，采用碱式滴定法测定产酸量(以醋酸计)。每个处理设3个平行样，取平均值进行比较，选出产酸量较大的菌株。(4)耐底酸性能试验
取初选菌株的斜面菌体两环接入含3%无水乙醇的液体基础培养基中，于30°C、120r/min的恒温摇床培养箱内活化24h，按10%的接种量接入装有IOOmL底酸(乙酸)浓度分别为0、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L的产酸试验培养基的500mL三角瓶中，置于30°C、转速为120r/min的恒温摇床培养箱内振荡培养6d，测定其产酸量，选出耐底酸性能较强的菌株做进一步试验。(5)遗传稳定性试验
将选出的菌株在斜面上传代10次，每代均在平板上培养，观察每代的菌落形态和个体特征。同时，每代均接入产酸培养基中，在相同的条件下培养，测每一代的产酸情况，判断菌株遗传性能的稳定性。由上述分离筛选试验，可以得出醋杆菌SJA-I的各方面性能优于对照菌株ASl. 41和沪酿1.01。2.菌株的分子生物学鉴定
对SJA-I的16S rDNA部分基因序列的测定及对比分析,鉴定为醋杆菌Jceio如ciersp.，经微生物保藏程序的鉴定和保藏，将其分类命名为醋杆菌JceioAacier sp. SJA-1,其保藏登记号为CGMCC No. 3347。醋杆菌JceioAacier 5/7. SJA-I的特征该菌株在分离培养基上生长良好,最适生长温度在30°C 34°C ;菌落形态规则，呈圆形突起，颜色为乳白色，表面有光泽，平板培养5d，菌落直径在O. Γ0. 2mm，透明圈直径O. 5^1. Ocm ;革兰氏染色呈阴性，菌体大小为(O. 6 I. O) X (I. (Tl. 8) μ m，短杆状，无芽孢。实施例2 :醋杆菌Mce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347在沙棘果醋发酵中的应用
将醋杆菌Mceiohcier sp. SJA-1)CGMCC No. 3347接种至种子培养基(葡萄糖I. 32%,酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5· O)中，在接种量10%,装液量100mL/500mL，摇床转速150r/min下，于32°C下培养24h ;然后以7%的接种量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度5% (Vol，20°C)，初始pH4. 5，装液量75mL/500mL，摇床转速90r/min，于30°C下发酵6d。在此条件下，醋酸产量可达4. 82g/100mL。该果醋酸味适宜，清香浓郁，果香与醋香和谐统一，具有鲜明的沙棘果醋特点。实施例3 :醋杆菌Mce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347在沙棘果醋发酵中的 应用
将醋杆菌Mceiohcier sp. SJA-1)CGMCC No. 3347接种至种子培养基(葡萄糖I. 32%,酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5· O)中，在接种量10%,装液量100mL/500mL，摇床转速150r/min下，于32°C下培养24h ;然后以8%的接种量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度6% (VOl，20°C)，初始pH3. 5，装液量100mL/500mL，摇床转速125r/min，于32°C下发酵5d。在此条件下，醋酸产量可达5. 67g/100mL。该果醋酸味突出，香气浓郁协调，具有独特的沙棘果醋风味。实施例4 :醋杆菌Mce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347在沙棘果醋发酵中的应用
将醋杆菌Mceiohcier sp. SJA-1)CGMCC No. 3347接种至种子培养基(葡萄糖I. 32%,酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5· O)中，在接种量10%,装液量100mL/500mL，摇床转速150r/min下，于32°C下培养24h ;然后以9%的接种量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度6% (VOl，20°C)，初始pH4. 0，装液量125mL/500mL，摇床转速130r/min，于34°C下发酵6d。在此条件下，醋酸产量可达5. 88g/100mL。该果醋酸味突出，果香浓郁，具有独特的沙棘果醋风味。实施例5 :醋杆菌Mce ο如cter sp. SJA-1) CGMCC No. 3347在沙棘果醋发酵中的应用
将醋杆菌Mceiohcier sp. SJA-1)CGMCC No. 3347接种至种子培养基(葡萄糖I. 32%,酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，ρΗ5· O)中，在接种量10%,装液量100mL/500mL，摇床转速150r/min下，于32°C下培养24h ;然后以10%的接种量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度7% (VOl，20°C)，初始pH4. 0，装液量125mL/500mL，摇床转速150r/min，于33°C下发酵5d。在此条件下，醋酸产量可达6. 83g/100mL。该果醋酸味突出，果香浓郁，具有独特的沙棘果醋风格。
权利要求
1.一株醋杆菌sp. SJA_1),其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 3347。
2.根据权利要求I所述的醋杆菌Mceio如ctersp. SJA-1) CGMCC No. 3347，其特征在于所述的醋杆菌Uceio如cter sp. SJA-I )CGMCC No. 3347，该菌株在分离培养基上生长良好，最适生长温度在30°C 34°C;菌落形态规则，呈圆形突起，颜色为乳白色，表面有光泽，平板培养5d，菌落直径在O. Γ0. 2_，透明圈直径O. 5^1. Ocm ;革兰氏染色呈阴性，菌体大小为(O. 6 I. O) X (I. (Tl. 8) μ m，短杆状，无芽孢。
3.一种权利要求I所述的醋杆菌sp. SJA-I) CGMCC No. 3347,其特征在于该株醋杆菌用于以沙棘酒为原料的沙棘果醋的生产。
4.根据权利要求3所述的醋杆菌Mceio如ctersp. SJA-I) CGMCC No. 3347，在发酵生产沙棘果醋中的应用，其特征在于具体方法为将醋杆菌Uceio如cter sp. SJA-1) CGMCCNo. 3347接种至下述种子培养基中葡萄糖I. 32%，酵母浸粉I. 27%，乙酸I. 0%，乙醇3. 0%，K2HPO4 O. 18%，pH5. O ;在接种量 10%，装液量 100mL/500mL，摇床转速 150r/min 下，于 32°C下培养24h ;然后以7°/Γ Ο%的接种量接入到沙棘酒中，在初始沙棘酒的酒精度59T7% (vol,20 °C),初始 pH3. 5 4. 5，装液量 75mL/500mL 125mL/500mL，摇床转速 90 150r/min，于30 34°C下发酵5cT6d。
全文摘要
本发明公开了一株醋杆菌(Acetobactersp.SJA-1)CGMCCNo.3347及其在沙棘果醋生产中的应用，涉及的是一株醋杆菌及利用该菌生产沙棘果醋的方法。该菌株分离源为自然发酵的沙棘醋醪，用于以沙棘酒为原料的沙棘果醋生产。菌落形态规则，呈圆形突起，乳白色，表面有光泽，平板培养5d，菌落直径0.1~0.2mm，透明圈直径0.5~1.0cm。革兰氏染色呈阴性，菌体大小为(0.6~1.0)×(1.0~1.8)μm，短杆状，无芽孢。经分离、筛选后得到的该菌株，能充分适应沙棘酒较高的酸度，发酵速度快，醋酸转化率高，不容易发生醋酸过氧化反应。用该醋杆菌生产的沙棘果醋，酸味突出，果香浓郁，具有独特的沙棘果醋风格。
文档编号C12J1/04GK102925380SQ20121030617
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者牛广财, 朱丹, 魏文毅, 左锋, 王宪青 申请人:黑龙江八一农垦大学, 牛广财