一种纤维二糖水解酶Tccel7A及其编码基因及应用的制作方法

专利名称：一种纤维二糖水解酶Tccel7A及其编码基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种纤维ニ糖水解酶Tccel7A及其编码基因及应用。
背景技术：
纤维素主要是植物利用ニ氧化碳和水在太阳光能作用下通过光合作用合成的地球上最丰富的可再生的生物质(biomass)资源。纤维素是多个葡萄糖残基以β_1，4-糖苷键连接而成的多聚物，其基本重复单位为纤维ニ糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由15-40根有结晶区和非结晶区构成的纤维素分子长链所组成。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折迭排列形成。在天然纤维素中，木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧密地包围纤维 ^(Zhang PYH, Lynd LR. 2004. Toward an aggregated understanding οι enzymatichydrolysis of cellulose:noncomplexed cellulase systems.Biotechnology andBioengineering, 88:797-824)。纤维素的降解通过纤维素酶的作用实现。纤维素酶是能将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，主要包括内切-1，4-β -D-葡聚糖酶(endo-Ι，4_β -D-glucanase，EC3. 2.I. 4)、纤维ニ糖水解酶[cellobiohydrolase, EC3. 2. I. 91;又叫外切 _1，4-β -D-葡聚糖酶(exo-1, 4- β -D-glucanase)]和 β-葡萄糖音酶(β -glucosidase, EC3. 2. I. 21) (ZhangPYHj Himmel ME, Mielenz JR. 2006. Outlook for ceilulase improvement: screening andselection strategies. Biotechnol Advan，24:452-481)。内切-1，4-β-D-葡聚糖酶(以下简称内切葡聚糖酶)作用于纤维素分子内部，随机水解纤维素分子内的β_1，4-糖苷键，产生短的纤维素链，暴露出新的纤维素末端。纤维ニ糖水解酶以有序方式(processive manner),沿着纤维素末端(还原端或非还原端)由外向内水解β_1，4-糖苷键，释放纤维ニ糖；此外，纤维ニ糖水解酶也作用于结晶纤维素，将纤维素长链从结晶区中剥离出来(Teeri TT. 1997. Crystallinecellulose degradation:new insight into tne function of cellobiohydrolase.Trends Biotechnol，1997，15:160-167)。β -葡萄糖苷酶将纤维ニ糖或其它可溶性的纤维寡糖水解成葡萄糖分子，可消除纤维ニ糖对内切葡聚糖酶和纤维ニ糖水解酶的反馈抑制。在这三类酶的协同作用下，纤维素最终被水解为葡萄糖(Lynd LR，Weimer PJj WillemH Zj et al. 2002. Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology.Microbiol Mol Biol Rev，66 :506-577 ;Zhang YHj Lynd LR. 2004. Toward an aggregatedunderstanding of enzymatic hydrolysis of cellulose:noncompIexed cellulasesystems. Biotechnology andBioengineering，88:797-824)。微生物是纤维素酶最主要的来源。目前，用于生产纤维素酶较多和研究最透彻的微生物是丝状真菌(孟雷，陈冠军，王怡等.2002，纤维素酶的多型性.纤维素科学与技术，10:47-55)。其中纤维素酶活力较强的主要为来自曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus )、木霉(Trichoderma)和青霉(Pinicielium)属的菌株，尤以木霉属菌株居多、活力最高，较为典型的有瑞氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichodermaviride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)，其中瑞氏木霉Rut_C30是目前公认的最好的纤维素酶生产菌株(Martins LFj Rolling D，Camassola M，et al. 2008. Comparisonof Penicillium echinulatum and Trichoderma reesei ceilulases in relation totheir activity against various cellulosic substrates. Bioresource Technology,99:1217-1224;Gusakov AV.2011. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuelproduction. Trends Biotechnology，29:419—425;Le Crom Sj Schackwitz W，PennacchioL，et al. 2009. Tracking the roots of cellulase hyperproduction by the fungusTrichoderma reesei using massively parallel DNA sequencing. Proc NatlAcad SciUSA,106:16151-16156)o在木霉的天然纤维素酶系中，纤维ニ糖水解酶占的比重很大，占到60% 80%。其中纤维ニ糖水解酶I (cellobiohydrolase I，CBH I )占50 60%，纤维ニ糖水解酶II(cel lobiohydrolase II，CBH II)占 20% 左右(Markov AV, Gusakov AV, Kondratyeva EG，et al.2005. New effective methoa ior analysis of the component composition oi enzyme complexes from Trichoderma reesei. Biochemistry，70:657-663)。纤维ニ糖水角军酶在纤维素酶对结晶纤维素的水解过程中起非常重要的作用(Lynd LR, Weimer PJ, WillemH Z, et al. 2002. Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology.Microbiol Mol Biol Rev,66:506-577)。对纤维ニ糖水解酶I的研究，对于高效地降解天然纤维素中的结晶纤维素具有重要意义。

发明内容
本发明的ー个目的是提供一种纤维ニ糖水解酶Tccel7A及其编码基因。本发明提供的蛋白，为纤维ニ糖水解酶，命名为Tccel7A，来源于奶油木霉(Trichoderma cremeum)菌株 BM48-3,是如下 Ca)或(b)或(c)的蛋白质(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列3自N末端第18-509位氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列表中序列3的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维ニ糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列3由509个氨基酸残基组成，为了便于蛋白质的分泌表达，还可在蛋白的氨基末端添加上信号肽序列。该蛋白自氨基末端(N端)第1-17位氨基酸残基为信号肽(signal peptide)序列。上述蛋白中，所述ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。为了使(a)中的TcCel7A便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表I所示的标签。表I.为标签的序列标签残基序列
Poly-Arg__5-6 (通常为5个)RRRRR_
Poly-His2-10 (通常为 6HHHHHH个、
—FLAG_ 8_ DYKDDDDK _
Strep-tag _11 — 8 _ WSHPQFEK _
c-myc10EQKLISEEDL
上述(b)或(c)中的Tccel7A可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的Tccel7A的编码基因可通过将序列表中序列2的自5端第I至1527位碱基所示的DNA序列中缺失ー个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行ー个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。编码上述蛋白的基因TCCe17A/CTCCel7A也属于本发明的保护范围。上述基因可为如下I) -5)中任一所示的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列2自5'末端第52-1527位核苷酸所示的DNA分子；4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有纤维ニ糖水解酶活性蛋白的DNA分子；5)与I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有纤维ニ糖水解酶活性蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在O. I X SSPE (或O. I X SSC)，O. 1%SDS的溶液中，在65° C下杂交并洗膜。上述序列表中的序列I由1653个脱氧核糖核苷酸组成，为Tccel7A的基因组基因，含有3个外显子和2个内含子，自5'端的第I至451位核苷酸为Tccel7A的外显子1，自Y端的第452至512位核苷酸为Tccel7A的内含子1，自Y端的第513至1207位核苷酸为Tccel7A的外显子2，自5'端的第1208至1269位核苷酸为Tccel7A的内含子2，自5'端的第1270至1651位核苷酸为Tccel7A的外显子3，自5'端的第1651至1653位核苷酸为Tccel7A的终止密码子TAA。上述序列表中的序列2由1530个脱氧核糖核苷酸组成，为Tccel7A的cDNA基因(cTccel7A),自5 '端的第I至1530位核苷酸为cTccel7A的开放阅读框(Open ReadingFrame, ORF),自5'端的第1-3位核苷酸为CTCCe17A的起始密码子ATG，自5'端的第1528-1530位核苷酸为cTccel7A的终止密码子TAA，自5^端的第1_51位核苷酸为编码信号肽的核苷酸。含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。上述重组表达载体为将编码上述蛋白的基因插入表达载体，得到表达所述蛋白的重组表达载体；上述表达载体可为在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9、pPIC3、pHIL-Dl、pA0804、pA0815、pPSC3K 或 pPIC9K。重组表达载体具体为在 pPIC9K 的Avr II和Not I酶切位点间插入序列表中的序列2的自5'端第52至1527位脱氧核苷酸得到的重组表达载体PGXN9K4831。上述重组菌为将所述重组表达载体导入宿主菌中，得到的重组菌；所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为酵母菌；所述酵母菌具体可为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GSl 15, KM71 (可购自美国Invitrogen公司)或SMDl 168 (可购自美国Invitrogen公司)。本实施例为GXN9K4831-16，宿主菌为巴氏毕赤酵母GS115。扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。上述蛋白在作为纤维ニ糖水解酶中的应用也是本发明保护的范围。
上述基因或上述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备纤维ニ糖水解酶中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另ー个目的是提供一种制备纤维ニ糖水解酶的方法。本发明提供方法，为发酵上述的重组菌，即得到纤维ニ糖水解酶。上述方法中，所述发酵的培养基为BMMY培养基；所述发酵为在甲醇诱导下进行，甲醇在发酵体系中的终浓度可为O. 5-1. 0% (体积
百分含量)。所述发酵具体为将重组菌GXN9K4831-16在BMMY培养基中28°C、250rpm振荡培养；且每12h向培养产物中加入甲醇，前24h加入甲醇至终浓度1% (体积百分含量)，24h以后加入甲醇至终浓度I. 5%(体积百分含量);共振荡培养60h，得到纤维ニ糖水解酶Tccel7A。本发明的实验证明，本发明从奶油木霉(Trichoderma cremeum)菌株BM48-3中克隆得到了一个新的纤维ニ糖水解酶基因TCCe17A/CTCCel7A，可在宿主细胞中表达该基因以生产纤维ニ糖水解酶Tccel7A，用于纤维素的降解。对该纤维ニ糖水解酶Tccel7A进行酶活相关分析，其酶促反应的最适PH为5. O、最适温度为45°C;在最适pH和最适温度下，该酶对底物对硝基苯基-β-D-纤维ニ糖苷(p-nitrophenyl β -D-cellobioside, pNPC)的比活力为O. 62U/mg ;而且ImMol/L的Ca2+可以把纤维ニ糖水解酶Tccel7A的活性提高16. 08%,达到 0.72U/mg。


图I为提取的木霉BM48-3基因组DNA电泳图。图2为含有木霉BM48-3的全长Tccel7A基因的PCR产物电泳图。图3为提取的木霉BM48-3的总RNA电泳图。图4为含有木霉BM48-3的全长Tccel7A cDNA基因(cTccel7A)的PCR产物的电泳图。图5为重组质粒pGXN9K4831的Sal I酶切线性化产物的电泳图。图6为重组毕赤酵母GXN9K4831鉴定的菌落PCR产物电泳图。图7为重组毕赤酵母GXN9K4831在含800 μ g/mL抗生素G418的YPD培养基平板上长出的单菌落。
图8为纯化的纤维ニ糖水解酶TcCel7A的SDS-PAGE分析和酶谱分析。图9为纤维ニ糖水解酶TcCe17A的最适作用pH曲线。图10为纤维ニ糖水解酶TcCel7A的最适作用温度曲线图11为纤维ニ糖水解酶TcCe17A的pH耐受性曲线图12为纤维ニ糖水解酶TcCe17A的温度耐受性曲线图13为纤维ニ糖水解酶TcCel7A的酶反应动力学常数Km和Vmax的确定。图14为纤维ニ糖水解酶TcCel7A水解滤纸的产物的HPLC分析图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的百分比％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值或平均值土标准差。以下实施例中的转速，均为在半径为4. 5-5. 5cm的离心半径下的转速。下述实施例中所用到的材料包括表达载体pPIC9K(购自Invitrogen公司，产品目录号为V17520);巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115 (购自Invitrogen公司，产品目录号为C18100);限制性内切酶Avr II、Not I和Sal I , DNA聚合酶，PrimerStar等试剂购自Takara公司。下述实施例中BMMY培养基每升含有胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，IOOmLlM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，IOOmL 10XYNB，2mL 500X 生物素，5mL 甲醇。IM 磷酸钾缓冲液(K2HPO4-KH2PO4 缓冲液，pH 6. 0)132mL IM K2HPO4 溶液与 868mLlM KH2PO4溶液混合，调节pH至6. O。配制好后高压灭菌。10XYNB 即 13. 4%YNB :100m L 水中加入 13. 4gYNB。500X 生物素即 O. 002% 生物素IOOmL水中加入20mg生物素。10XYNB、500X生物素需单独配制并过滤除菌并4°C保存。配制BMMY时先将20g胰蛋白胨和IOg酵母提取物溶于700mL去离子水井高压灭菌，待用之前添加其它成分。下述实施例中纤维ニ糖水解酶的酶活检测方法如下以对硝基苯基-β -D-纤维ニ糖苷(p-nitrophenyl-β -D-cellobioside, pNPC)为底物测定纤维ニ糖水解酶的活力，參照 Odoux 等所描述的方法(Odoux E, Escoute J, Verdeil L, et al. 2003. Localizationof β -glucosidase activity and glucovanil丄in in vanilla bean. Ann Botany,92:437-444)。具体步骤如下I)、用去离子水配制IOmM的对硝基苯酹(p-NP, p-Nitrophenol)标准液，进行5个梯度稀释(KT1-KT5);取140 μ I每个稀释度的ρ-ΝΡ溶液，分别加入70μ I 0. 4Μ的Na2CO3溶液，用移液器小心吸打混匀，避免出现气泡。取200 μ I混合液，加入96孔酶标板，410nm处测定光吸收值；得到光吸收值和p_NP浓度的标准曲线，标准曲线的函数式为y=9. 363x+0. 0271 (R2=O. 9988), y 为光吸收值(OD410)，x 为 p-NP 浓度(mM)。2)、用去离子水配制25mM的p-NPC溶液作为底物，用小管分装，管外用铝箔包裹避光，保存于_20°C冰箱。3)、向L5ml EP管中加入58 μ I特定pH值的缓冲液和14 μ I 25mM的p_NPC溶液，放置于一定温度的水浴锅中预热5min,加入68 μ I酶液,一定温度下保温反应一段时间,カロ入70 μ I O. 4Μ的Na2CO3溶液以终止酶促反应，取200 μ I反应液，加入到96孔酶标板，用酶标仪于410nm处测定光吸收值；根据制作的p_NP标准曲线和光吸收值，计算反应体系中产生P-NP的量和酶活力。纤维ニ糖水解酶活力単位(U)的定义一定条件下，酶水解pNPC，每min催化产生Ιμπιο ρ_ΝΡ所需的酶量为ー个酶活力单位(U)。比酶活定义姆mg蛋白质所含的酶活力(U/mg)。实施例I、蛋白Tccel7A的基因组DNA和cDNA的获得一、奶油木霉(Trichoderma cremeum)菌株 BM48-3 的获得I、土壤样品的采集采集中国云南省迪庆藏族自治州白马雪山国家自然保护区奔子栏辖区约5-20cm浅土层的土壌。
2、菌株的分离筛选(I)用蒸馏水配制分离培养基；每升分离培养基中含有=KH2PO4 2. 0g、(NH4)2SO4I. 4g、尿素 O. 3g、MgSO4 · 7H20 O. 3g、CaCl2 O. 3g、FeSO4 · 7H20 5. Omg、MnSO4 .H2Ol. 56mg、ZnSO4 · 7H20 I. 4mg、CoCl2 2. Omg,Avicel (Sigma PH101) 10g、琼月旨 15g ；pH5. 0 ;121°C湿热灭菌20min ;灭菌后冷却至45_50°C时倒平板。(2)取IOg 土样放入250ml三角烧瓶，加入90ml无菌水并加入适量的玻璃珠，于磁力搅拌器上搅拌30min,使土样与水充分混合,将细胞分散。取Iml 土壤悬液加入盛有9ml无菌水的指形瓶中充分混匀，然后从中取Iml至另一盛有9ml无菌水的指形瓶中，混匀，以此类推制成10'10_2、10_3不同稀释度的土壌溶液，各取100 μ I涂布在分离培养基平板上，28°C培养。(3) 3-5天后，观察真菌菌落生长情况，挑选单菌落，转接到新的分离培养基上，划线分离纯化。(4)配制pH 5. O的基本培养基(液体)。每升基本培养基中含有KH2PO4 2. Og,(NH4)2SO4 I. 4g、尿素 0. 3g、MgSO4 · 7H20 0. 3g、CaCl2 0. 3g、FeSO4 · 7H20 5. Omg、MnSO4 · H2OI. 56mg>ZnSO4 *7H20 I. 4mg、CoCl2 2. 0mg、Tween_80 2ml、蛋白腺 I. 0g、鉄皮 20g、Avicel (结晶纤维素，Sigma PHlODlOg ;用800ml去离子水溶解，然后调节pH值至5. O (用IM HCl水溶液或IM NaOH水溶液调节)；用去离子水定容至IL ;121°C湿热灭菌20min。(5)将步骤(3)得到的产纤维素酶的真菌菌株接种至基本培养基(液体)中，28°C、ISOrpm培养5-7天，取上清液，以结晶纤维素(Avicel)为底物进行纤维素酶活力測定，从中筛选出产纤维素酶活力较高的菌株BM48-3。3、菌株的鉴定菌株BM48-3的分子鉴定；具体鉴定步骤如下提取菌株BM48-3的总DNA 并作为模板，利用通用引物 ITSl (5 ' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 ')和 ITS4(5' TCCTCCGCTTATTGATATG3' )，PCR扩增得到其ITS，经测序获得一条606bp的核苷酸序列。ITS同源性比对分析表明其与Hypocrea cremea菌株GJS 91-125的ITS(GenBank登录号AY737760)的比对得分最高，序列覆盖度为100%，一致性为99%。根据分子鉴定结果，參照木霉属菌株的无性型和有性型命名，将菌株BM48-3初步鉴定为奶油木霉(Trichodermacremeumノ。
ニ、蛋白Tccel7A的基因组DNA的克隆I、木霉菌株BM48-3的基因组DNA的提取參考周小玲等人的方法(周小玲，沈微，饶志明，等.2004. ー种快速提取真菌染色体DNA的方法.微生物学通报，31:89-92.)。具体步骤如下(I)在PDA平板上活化低温保存的木霉菌株BM48-3，28°C培养3至5天。(2)将活化好的木霉菌株BM48-3转接入液体培养基(每升含有蛋白胨3g、酵母提取物 O. 5g、葡萄糖 10g、K2HP044g、(NH4) 2S042g、CaCl2O. 35g、MgSO4 · 7Η200· 3g)中，28°C、200rpm振荡培养3天。(3)先用八层无菌纱布过滤培养物以收集菌体，冲洗菌丝，再用无菌吸水纸吸取菌丝的水分，尽量使菌体干燥，便于研磨。 (4)将菌丝体倒入已灭菌并用液氮预冷的研钵内，不断迅速加入液氮，快速有力研磨。需始终保持研钵内有少量液氮，使菌丝体一直处于低温环境。(5)待菌丝体被研磨至粉末状，将大约100μ L体积的粉末移至I. 5mL离心管中，立刻加入600 μ L真菌DNA提取液(200mM Tris-HCl, IOmM EDTA, 1%SDS, 500mMNaCl,pH8. 0)，吹打混匀，室温放置IOmin。(6)加入等体积的苯酹/氯仿混合液，用カ振荡混合，10，OOOrpm离心lOmin。(7)吸取400 μ L上清液至新的I. 5mL离心管中，重复步骤(6)。(8)吸取上清液至新的I. 5mL离心管中，加入两倍体积的无水こ醇，轻轻上下颠倒混匀，_20°C放置30min。(9) 12，OOOrpm离心15min,轻轻将液体倒出，加入75%こ醇洗漆沉淀，13，OOOrpm离心2min。再用75%こ醇重复洗涤沉淀一次。(10)室温晾干沉淀至呈半透明色，加入20μ L IXTE溶液溶解沉淀。(11)电泳检测提取的总DNA (图I)。2、扩增蛋白Tcce17Α的基因组DNA的引物分析了 4个已经发表的木霉属菌株的cbh I基因的核苷酸序列緑色木霉(Hypocrea virens)菌株 UKMl 的 cbh I (GenBank 登录号 EU872026)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的 cbh I (GenBank 登录号 AF223252)、木霉属菌株 XSTl 的cbh I (GenBank 登录号 AY368686)和绿色木霉(Trichoderma viride)菌株 AS3. 3711 的cbh I (GenBank 登录号 AB021656),借助网站 http://blocks, fhcrc. org/codehop. html设计出PCR扩增Tccel7A基因(DNA)的简并引物cbh I-3 f和cbhl_3r，引物cbhト3f的序列为5 ' -ATGTATCRGAARTTGGCCGTCA-3 '，引物 cbhl_3r 的序列为5 ' -AGGCACTGAGAGTAGWATGGGTTC-3;。3、蛋白Tccel7A的基因组DNA的克隆以菌株BM48-3基因组DNA为模板，以引物cbhl_3f和cbhl_3r为引物，PCR扩增得到1653bp PCR产物(图2)。将PCR产物与载体pMD18_T连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，涂布在表面涂有X-gal和IPTG的含氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB琼脂培养基平板上，37°C培养过夜，随机挑取平板上长出的白色菌落，提取质粒，用EcoRI和PstI双酶切验证重组质粒，将双酶切验证正确的重组质粒进行DNA序列測定。将酶切验证正确的重组质粒寄送上海生物工程有限公司采用双脱氧核苷酸法对该基因进行双向双链测序。用NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的软件 Blast (nttp: / /www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST)对序列进行分析，该质粒上克隆的PCR广物的基因具有序列表中序列I所示的核苷酸，该基因命名为Tccel7A。序列表中序列I自5'端的第1_3位核苷酸为Tccel7A的起始密码子ATG，自5 ^端的第1651-1653位核苷酸为Tccel7A的终止密码子TAA。Tccel7A基因的完整DNA序列长度为1653bp，其中包含3个外显子和2个内含子。第ー个内含子长度为61bp，第二个内含子长度为62bp。该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列3，该蛋白命名为Tccel7A。也可人工合成序列I。三、蛋白Tccel7A的cDNA的克隆I、木霉菌株BM48-3总RNA的提取用Trizol法提取菌株BM48-3的总RNA。具体步骤如下 (I)将菌株BM48-3接种至RNA提取液体培养基内，该培养基每升含有酵母提取物 lg、Avicel PH-101 30g、(NH4)2SO4 2. 8g,K2HPO4 4g、MgSO4 · 7H20 0. 6g、CaCl2O. 5g、Urea0. 6g、Tween-80 2mL、微量元素 0. ImL, pH 调至 5. 0。微量元素每升含有FeS04 · 7H20 10g、MnSO4 · H2O 3. 2g、ZnSO4 · 7H20 2. 8g、CoCl2 4. 0g。28°C、200rpm 振荡培养 3 天。(2)收集菌体，用DEPC水冲洗菌丝，灭菌纱布过滤。用灭菌的吸水纸吸去菌丝体表面水分，使菌丝团尽量干、薄。(3)将菌丝体倒入已灭菌并用液氮预冷的研钵内，不断迅速加入液氮，快速有力研磨。研磨大约三次左右，按50-100mg菌丝体加入ImL Trizol的量加入60°C预热的Trizol。(4)吹打混匀，室温放置 5min，4°C、12000rpm 离心 lOmin。(5)吸取上清液至新的I. 5mL离心管中，按姆mL Trizol加入200 μ L氯仿,振荡混匀至液体呈乳白色，室温放置lOmin。(6) 4°C、12，OOOrpm离心lOmin，吸取上层水相至新的离心管中。(7)按姆mL Trizol 加入 500 μ L 的异丙醇，混勻，室温放置 lOmin。4°C> 12, OOOrpm离心lOmin,轻轻弃去上清液。(8)加入ImL 75%こ醇，涡旋离心管，使沉淀悬浮。4°C、8000rpm离心5min，尽量吸
干上清。(9)真空干燥或室温晾干5 lOmin。加入30 50 μ L DEPC处理水溶解RNA。(10)ΤΒΕ琼脂糖凝胶电泳检测RNA，测量OD值判断总RNA的浓度和纯度(0D26CI/28Q)。(11)加入适量无RNase I活性的DNase I (Takara公司)，消化掉溶液中残余的DNA，操作步骤、反应体系按Takara公司说明书进行和配制，得到总RNA (图3)。2、cDNA第一链的合成使用Takara 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA synthesis 试剂盒合成 cDNA的第一链，操作步骤及反应体系按该公司的说明书进行和配制。3、蛋白 Tccel7A 的 cDNA 的克隆根据Tccel7A基因的完整DNA序列，设计引物cbhl_48f(5' -CACATGTATCGGAAGTTGGCC-3')和 cbhl_48r (5 ' -CTATTACAGGCACTGAGAGTAG-3')，以上述合成的cDNA第一链为模板，PCR扩增得到1530bp PCR产物(图4)。
将上述扩增得到PCR产物寄送上海生物工程有限公司采用双脱氧核苷酸法对该PCR产物进行双向双链测序。用NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的软件 Blast (nttp:"www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST)对序列进行分析，该PCR产物的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸，该基因命名为cTCCel7A。序列表中序列2的DNA自5'端的第1_3位核苷酸为CTCCe17A的起始密码子ATG，自5'端的第1528-1530位核苷酸为cTccel7A的终止密码子TAA，自5'端的第1-51位核苷酸为编码信号肽的核苷酸。cTCCel7A基因的完整DNA序列长度为1530bp。该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列3 (509个氨基酸)，其中自N’末端第1-17位为信号肽，该蛋白命名为Tccel7A。序列2可人工合成。实施例2、蛋白Tccel7A及其编码基因CTCCe17A的功能验证

一、含有cTccel7A基因重组质粒pGXN9K4831的构建为了在pPIC9K系统中表达cTccel7A，人工合成cTccel7A基因的除了编码信号肽和終止密码子以外的全部编码序列(即自序列表中序列2的5 '端第52-1527位核苷酸。以人工合成的序列表中序列2的5 '端第52-1527位所示的核苷酸为模板，以48hfl (5; -TACCTAGGCATCATCATCATCATCATCAGTCGGCCTGCACCCTAACA-3')和 48hrl(5' -CCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCAGGCACTGAGAGTAGTATG~3/ )(斜体序列编码组氨酸标签)为引物，得到1479bp PCR产物。该1479bp PCR产物表达的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列3自N’末端第18-509位氨基酸残基。将上述PCR产物用Avr II和Not I酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切的PPIC9K载体骨架连接，得到重组表达质粒pGXN9K4831。经过测序，该pGXN9K4831为将序列表中序列2的5 ^端第52-1527位所示的核苷酸插入pPIC9K的Avr II和Not I位点间得到的重组表达载体；其中起始密码子和终止密码子由表达载体PPIC9K提供。表达产物的N端和C端都有一个由表达载体提供的His标签(6XHis Tag)。ニ、含有cTccel7A基因重组毕赤酵母的构建用Sal I酶线性化含cTccel7A的质粒pGXN9K4831以及对照空载体pPIC9K，用线性化的质粒DNA电击转化毕赤酵母菌株GSl 15，具体如下I、毕赤酵母GS115感受态的制备(I)挑取2个生长良好、直径约为2mm的毕赤酵母GS115单菌落,接种至含5mLYB)培养基(每升培养基中含有胰蛋白胨20g、酵母提取物10g、葡萄糖20g)的指形瓶中。28 V、250rpm振荡培养过夜。(2)吸取500 μ L菌液，接至含IOOmL YI3D培养基的250mL三角瓶中。28°C、250rpm振荡培养IOh左右至0D_=0. 8 I. 3。(3)将菌液移至40mL圆底离心管中，4°C、2500rpm离心3min，轻轻拍打管底，用30mL预冷的无菌水将沉淀重悬。(4) 4°C、2500rpm离心3min，用30mL预冷的IM山梨醇将沉淀重悬。(5)重复步骤(4)。(6)4°C、2500rpm离心3min，轻轻倒掉上清，利用离心管里残余的IM山梨醇重悬沉淀的菌体，制备成毕赤酵母感受态细胞。(7)将毕赤酵母感受态细胞按每管100 μ L分装到预冷的离心管中并尽快用于后续的电击转化。2、重组质粒pGXN9K4831和空载体pPIC9K电击转化毕赤酵母GS115(I)分别用Sal I酶酶切线性化重组质粒PGXN9K4831和空载体pPIC9K，纯化酶切产物(图5，其中I为空载体pPIC9K酶切产物电泳图，2为重组质粒pGXN9K4831酶切产物电泳图)。(2)将10 μ L (约5 μ g)线性化后的质粒与100 μ L毕赤酵母感觉态细胞轻轻混匀，置于冰水混合物中。(3)设置电转仪參数为电压1.5kV、电容25 yF、电阻200 Ω、电击时间为 4 IOmSec,进行电击。(4)电击完毕后，迅速加入900 μ L预冷的IM山梨醇溶液，混匀，将菌悬液均匀涂布于MD平板上(按100 μ L涂布I个平板)。(5)将平板倒置于28°C恒温培养箱中培养，直至2 4天后单菌落出现；得到转PGXN9K4831的单菌落和转空载体pPIC9K的对照单菌落。3、重组毕赤酵母的筛选与鉴定将MD平板上长出的转pGXN9K4831的单菌落和转空载体pPIC9K的对照单菌落(保证单菌落在1000个以上)分别用液体MD培养基全部洗下，通过G418浓度梯度筛选带多拷贝的重组子。将洗下的菌落稀释至一定浓度，均匀地涂在G418浓度为100、200、500、800、1000、1200、1500 μ g/mL 的系列 YPD 平板上。在高浓度G418平板上挑取单菌落和对照单菌落进行菌落PCR鉴定；所用引物为 5 ' AOX (5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ')和 3 ' AOX(5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')。PCR反应体系为:10XEx Taq缓冲液 2. 5 μ L，dNTP (2. 5mM) 2 μ L，两种引物各 I μ L，毕赤酵母细胞适量，Ex Taq DNA聚合酶O. 25 μ L，ddH20 18. 25 μし反应条件为95°C预变性5分钟，92°C变性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸I. 5分钟，35个循环，最后，72°C延伸5分钟。转化pGXN9K4831得到的单菌落的PCR结果见图6，得到2000bp的PCR产物的为阳性重组菌，从G418浓度为800、1000、1200 μ g/mL的YPD平板上长出的多个酵母单菌落中共得到30个阳性重组菌，分别命名为GXN9K4831-1 30。转化空载体pPIC9K得到的对照单菌落得到500bp的PCR产物，其为阴性对照重组菌,命名为GXN9K。转化pGXN9K4831单菌落在含800 μ g/mL抗生素G418的YPD培养基平板上长出的单菌落如图7所示。三、诱导重组毕赤酵母中cTccel7A基因表达纤维ニ糖水解酶I、重组毕赤酵母GXN9K4831-1 30的cTccel7A基因的诱导表达(I)挑取上述验证得到的30个直径约2mm、生长良好的GXN9K4831_f 30，分别接种至含5mL YPG培养基的指形瓶中，28°C、250rpm振荡培养12h。(2)吸取适量菌液接种至含有45mL YPG培养基的500mL三角瓶中，使瓶内培养基OD600 ^ O. 6 O. 8，覆盖八层无菌纱布，28°C、250rpm振荡培养12 16h。(3)待菌液生长至OD6tltl ^ 15 20,移至灭菌50mL圆底离心管中，室温,2500rpm离心3min，收集菌体，加入45mL BMMY培养基，轻轻拍打管底，重悬沉淀的菌体。(4)将重悬的菌液转移至新的灭菌的500mL三角瓶中，覆盖六层无菌纱布，28°C、250rpm振荡培养。每12h向培养液中加入甲醇，前24h加入甲醇至终浓度1%，24h以后加入甲醇至终浓度I. 5%。(5)每12h测定菌液OD6。。井取适量培养液，4°C、12000rpm离心lOmin，吸取上清液即为发酵液。以GXN9K为对照，采用同样的方法，得到对照发酵液。
2、重组毕赤酵母发酵液的纤维ニ糖水解酶活力測定将得到的各个重组毕赤酵母发酵液和对照发酵液分别进行纤维ニ糖水解酶活力检测，以PNPC作为底物，按前述方法进行酶活力測定；纤维ニ糖水解酶活力定义酶水解pNPC，每min释放出Ιμπιο p_NP所需的酶量为ー个酶活力单位(U)。结果是重组毕赤酵母第16号转化子即GXN9K4831-16降解pNPC的酶活力最高，产酶最高的培养时间即最佳收获时间为60h。在最佳收获时间其发酵上清液对底物pNPC酶活カ为O. 035±0. 001U/mL。选取重组毕赤酵母GXN9K4831-16来表达纤维ニ糖水解酶Tccel7A。对照发酵液检测不到酶活力。上述结果说明，cTccel7A基因表达的蛋白Tccel7A为纤维ニ糖水解酶。3、纤维ニ糖水解酶Tccel7A的纯化将上述I得到的GXN9K4831-16发酵液使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，洗涤缓冲液为:洗涤缓冲液 I 50mM NaH2PO4,300mM NaCl、20mM Imidazole、ImMPMSF, ρΗ8· O。洗涤缓冲液II V :除了 Imidazole分别为20、40、60、80、IOOmM以外，其它成分浓度与洗涤缓冲液I 一致。依次用洗涤缓冲液I V对柱子进行洗脱，收集洗脱液并进行測定。测定为采用SDS-PAGE、自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native_PAGE)和酶谱分析；酶谱分析为将酶液进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)，将凝胶置于干净的培养皿中，加入ImL 2. 5mM的pNPC水溶液，用玻棒涂匀，保鲜袋包裹培养皿，37°C放置I至2小时。直接在凝胶上观察条带的颜色变化。结果如图8所示，A为TcCe17A的SDS-PAGE分析，其中M为蛋白质分子量标准；泳道I为纯化的TcCel7A ；B为TcCel7A的自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)图，其中泳道I为纯化的TcCel7A ；C为和B中泳道I相对应的纯化的TcCel7A的酶谱分析；从该图可以看出，经过Ni-NTA柱纯化后的产物在SDS-PAGE上只显示出一条大小约为57kDa的主要的蛋白质条带(图8A泳道I)，在自然PAGE上也只显示出一条主要的蛋白质条带(图SB泳道I);自然PAGE上的纯化的表达产物降解pNPC显示黄色(图8C泳道I)。证实纯化的表达产物Tccel7A具有纤维ニ糖水解酶的活性，得到纯化的纤维ニ糖水解酶Tcce17A。四、纯化的纤维ニ糖水解酶Tccel7A的酶学特性I、最适作用pH值将上述得到的纯化的纤维ニ糖水解酶Tccel7A进行酶活力检测，分别采用0. IM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0),0. IM 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0)，0· IM Tris-HCl 缓冲液(pH 7.0、7. 5、8. 0、8. 5、9. O), O. IM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8. 5、9. 0、9. 5,10. 0)，反应温度采用37°C，以pNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶酶活力定义37°C条件下，酶水解pNPC,每min释放出Ιμπιο p_NP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。以最高酶活力为100%，其它pH值的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以pH值为横坐标,相对酶活力为纵坐标作图,见图9。结果表明，纤维二糖水解酶Tccel7A酶促反应的最适作用PH值为5. O。2.最适作用温度将纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A进行酶活力检测，分别采用不同的反应温度(25 °C、30 0C >35 0C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 °C >65 °C),反应缓冲液采用 ρΗ5· O 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，以PNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶酶活力定义pH5. O条件下，酶水解pNPC，每min释放出I μ mo I p-NP所需的酶量为一个酶活 力单位(U)。以最高酶活力作为100%，其它温度的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图10。结果表明，纤维二糖水解酶Tccel7A酶促反应的最适作用温度为45°C。3. pH 耐受性将纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A进行酶活力检测，分别采用O. IM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0),0. IM 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0)，0· IM Tris-HCl 缓冲液(pH 7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. O), O. IM 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8. 5、9· 0、9· 5,10. 0)，参照 Eckert 和 Schneider所描述的方法(EckertK, Schneider E. 2003. A thermoacidophiIic endoglucanase (CelB)from Alicyclobacillus acidocaldarius displays high sequence similarity toarabinofuranosidases belonging to family 51 of glycoside hydrolases. Eur JBiochem, 270:3593-3602)，将酶保存于不同pH值的缓冲液中，于4°C放置24小时后在最适pH值(pH5. 0)和最适温度(45°C)下测定酶活。以pNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶活力定义pH5. 0、45°C条件下，酶水解pNPC，每min释放出I μ mo I p-NP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。以最高酶活力为100%，其它pH值保存液的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存液的PH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图11。结果表明，纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A在最适pH5. O的条件下,pH耐受性最强,酶活力最高。pH4. 5时酶活力与最适PH5. O条件下接近，pH4. O和5. 5的条件下，能够保持60%以上的酶活力。4.温度耐受性将纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A进行酶活力检测，分别采用不同的保存温度(20 0C >25 0C >30 0C >35 °C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 °C >65 °C >70 °C),参照 Inoue 等所描述的方法(Inoue T, Moriya S，Ohkuma M, et al. 2005. Molecular cloning andcharacterization of a cellulase gene from a symbiotic protist of the lowertermite, Coptotermes formosanus. Gene, 349:67-75),将酶保存于不同温度下，放置 I 小时后在最适pH值(pH5. O)和最适温度(45°C )下测定酶活力。以pNPC作为底物，按前述方法进行酶活力测定；纤维二糖水解酶活力定义pH5. 0、45°C条件下,酶水解pNPC，每min释放出Ιμπιο p-NP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。以最高酶活力为100%，其它保存温度的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以保存温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图12。结果表明，纯化的纤维二糖水解酶Tccel7A在45°C及以下的温度条件下，酶活稳定性较好，能够保持90%以上的酶活。5、TcCel7A的酶反应动力学常数Km、Vmax的测定在该酶的最适作用条件(pH5.0、45°C)下，以pNPC作为底物，在不同底物浓度(O. flmM)、相同酶蛋白质浓度(O. 061μ8/μ I)条件下测定TcCel7A酶活力，图13A为pNPC的浓度对反应速度的影响曲线，看出底物PNPC浓度越大，酶反应速度越快，在底物pNPC浓度为O. 2 O. 8mM范围内，底物pNPC浓度和酶反应速度基本呈线性关系。绘制了底物浓 度和反应速度的双倒数图，见图13B。根据双倒数图得出TcCel7A的Km为2. 43mM, Vmax为I. 32 μ mo I pNP/min.mg。6、TcCel7A的底物特异性检测在该酶的最适作用条件(pH5.0、45°C)下，测定了 TcCel7A对不同底物的酶活力，酶活力定义为在 ρΗ5· 0、45<€条件下，酶水解 pNPC 或 pNPG(p-Nitrophenyl_ β -D-glucopyranoside),每min释放出I μ mol p_NP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。或者,在pH5.0、45°C条件下，酶水解其它纤维素类底物，每min释放出I μ mol还原糖(相当于等量的葡萄糖或木糖)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果见表2，TcCel7A对包括结晶纤维素Avicel的各种底物(木聚糖除外)普遍有酶活力。对人工合成底物PNPC的酶活力最高，酶活力为O. 72±O. 04U/mg ;对结晶纤维素Avicel有相当高的酶活力；对滤纸有较高的酶活力。表2为纤维二糖水解酶TcCel7A的底物特异性检测分析

底物特异性酶活力相对酶活力(％)
_(U/mg)_
IOmMpNPC0.72±0.02100.0±0.00
IO mM pNPG0.09士0.0212·14±1·42
1% 结晶纤维素 Avicel 0.16±0.03 22.76±2.891% 酸膨胀纤维素 0.32±0.05 48.30 + 2.471%羧甲基纤维素(低度粘度) 0·34±0·01 47.62 + 2.291%羧甲基纤维素(中度粘度) 0.42±0.02 58.21 ±3.561% 羟乙基纤维素 0.39±0.01 54.08+1.171%桦木木聚糖未检出未检出 % 滤纸(Whatman I )_0.48±0.02_68.00±4 167、TcCel7A水解滤纸的产物鉴定与分析
准备5个无菌EP管，分别加入400 μ L O. IM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ρΗ5. O)、4 μ g滤纸和100 μ L上述纯化制备的TcCel7A，置于45 °C摇床，150rpm振荡，分别反应10min、30min、Ih和2h,沸水煮5min灭活纤维二糖水解酶TcCel7A,冷却；12，OOOrpm离心5min,取上清液，HPLC检测上清液中的糖组分，色谱仪器为岛津CBM-10A系统，检测器型号为RID-10A，色谱柱为Benson公司制造，型号为BP_800Pb，柱温保持在80°C，流动相为水，流速为O. 8mL/min。标样为葡萄糖(glucose, Gl)、纤维二糖(cellobiose, G2)、纤维三糖(cellotriose, G3)、纤维四糖(cellotetraose，G4)。结果见图14所示，A.标准物葡萄糖(Gl)、纤维二糖(G2)、纤维三糖(G3)、纤维四糖(G4)的HPLC分析图谱；B-E :纤维二糖水解酶TcCel7A水解滤纸不同时间后的产物的HPLC分析图谱，B、水解10分钟，C、水解30分钟，D、水解I小时，E、水解2小时；由图中可以看出，最初反应的lOmin，水解产物量非常少；反应30min，可以明显的看出水解产物为纤维二糖和纤维三糖；反应lh，水解产物为纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖，分别占总水解产物量的68. 5%,24. 3%和7. 2% ;反应2h，水解产物同样为纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖，分 别占总水解产物量的77. 3%、21· 5%和I. 2%。随着反应时间的延长，水解产物量不断增加。其中，以纤维二糖产量提高幅度最大，纤维二糖为主要水解产物，纤维三糖和纤维四糖是水解反应的副产物，这与纤维二糖水解酶I主要降解纤维素产生纤维二糖是相符的。水解产物中包含纤维二糖、纤维三塘和纤维四糖，可能是纤维二糖水解酶I反复作用底物滤纸的结果如经过该酶反复作用某一多糖链产生纤维六糖，再次作用又产生纤维二糖和纤维四糖；同理，该酶反复作用某一多糖链产生纤维五糖，再次作用产生纤维二糖和纤维三糖。证实TcCe17A确实具有纤维二糖水解酶I水解纤维素产生纤维二糖的能力。8、金属离子对TcCe17A酶活力的影响在最适作用条件(pH5. 0、45°C)下,在酶反应体系中加入ImM的金属离子,测定以PNPC为底物的TcCel7A酶活力。酶活力定义pH5. 0、45°C条件下，酶水解pNPC，每min释放出Ιμπιο p-NP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。以不加任何金属离子的酶反应体系为对照，比酶活为0. 62±0. 02U/mg，设定该酶活力为100%，计算其它加入金属离子的酶反应体系的相对酶活力，结果见表3。结果显示，终浓度为ImM的Ca2+对该酶的酶活有显著的促进作用。表3为金属离子对TcCel7A酶活力的影响
权利要求
1.ー种蛋白，是如下(a)或(b)或(c)的蛋白质 (a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3自N末端第18-509位氨基酸序列组成的蛋白质； (c)将序列表中序列3的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维ニ糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因为如下I)-5)中任一所示的基因 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)序列表中序列2自5‘末端第52-1527位核苷酸所不的DNA分子； 4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有纤维ニ糖水解酶活性蛋白的DNA分子； 5)与I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有纤维ニ糖水解酶活性蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在干 所述重组表达载体为编码权利要求I所述蛋白的基因插入表达载体，得到表达所述蛋白的重组表达载体。
6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在干 所述重组菌为将权利要求4或5所述重组表达载体导入宿主菌中，得到的重组菌；所述宿主菌具体为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris);所述巴氏毕赤酵母进ー步具体为巴氏毕赤酵母GSl 15。
7.权利要求I所述蛋白在作为纤维ニ糖水解酶中的应用。
8.权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备纤维ニ糖水解酶中的应用。
9.一种制备纤维ニ糖水解酶的方法，为发酵权利要求4或6所述的重组菌，即得到纤维ニ糖水解酶。
全文摘要
本发明公开了一种纤维二糖水解酶Tccel7A及其编码基因及应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有纤维二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明从木霉(Trichoderma sp.)菌株BM48-3中克隆得到了一个新的纤维二糖水解酶基因Tccel7A/cTccel7A，可在宿主细胞中表达该基因以生产纤维二糖水解酶，用于纤维素的降解。
文档编号C12N1/19GK102816752SQ20121030675
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者冯家勋, 周青鸟, 秦秀林, 刘君梁, 张政 申请人:广西大学