专利名称：一株海洋真菌分枝孢子菌属真菌球孢枝孢及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌一分枝孢子菌属真菌球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A 及其应用。
背景技术：
癌症一直都是人类难以攻克的一个难题，寻找生理活性强的物质成为人类攻克疾病的主要工作之一。海洋微生物代谢产物研究是近年来国际上新兴的研究课题。由于对陆生动植物的药源发现越来越稀少，海洋已成为人类开垦新药的处女地。海洋约占地球总面积71%，蕴藏着极其丰富的生物资源，是有机物质的最大生产者。在各种天然生物活性分子的来源中，海洋微生物是最有潜能的。不像陆生植物，海洋微生物能够产生卤代次生代谢产物。自1928年青霉素的首次发现使之在细菌感染的治疗中有一很大突·破，真菌便成为治疗疾病的药物的重要来源之一。随之在1971年分离得到的环孢霉素推动了其在免疫药理学方面的进一步发展。海洋真菌的代谢产物不仅对于药物的开发必不可少，同时它在植物保护方面也非常重要，使海洋真菌的研究前景更加广泛。目前研究较多的抗肿瘤、抑制乙酰胆碱酯酶、抗细菌和抗氧化等海洋真菌次级代谢产物已成为具有生物医学意义的天然化合物丰富来源，均具有广阔的药用前景。故从海洋真菌的次级代谢产物中发现高活性的物质对于发现先导化合物非常的重要，对疾病的攻克也具有着重要的意义。
发明内容
本发明目的是一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌——分枝孢子菌属真菌球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A,及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明采用的技术方案是—株具有抗肿瘤活性的海洋真菌-球孢枝孢菌(Cladosporium
sphaerospermum) 100102A,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号=CCTCC No M 2012290，保藏日期2012年7月18日。所述球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A的菌落特征如下涂布或划线接种于平板培养基上生长迅速，28°C培养48 h后长出圆形、墨绿色、直径约
0.3^0. 5 cm的菌落；该菌株菌体生长特征如下在液体培养基中，28°C培养48 h后呈颗粒状贴壁生长；该菌株生理生化特性如下革兰氏染色阳性。本发明所述球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A由浙江省东海海域采集的海水中分离和筛选得到的菌株。菌株的筛选纯化方法为将采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上，28 V培养至菌落数量不再增加，挑取单菌落至斜面培养基上。28°C培养2d，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株，并对该菌株进行菌种鉴定。所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同，组成为土豆15(T350g/L，葡萄糖10 30g/L，琼脂15 35g/L，溶剂为水，ρΗ7· 2 8. O。本发明经筛选获得的球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A,涂布或划线接种在平板培养基上生长迅速，28°C培养48 h后长出圆形、墨绿色、直径约O. fO. 3 cm的菌落。将所述的球抱枝抱菌(Cladosporiumsphaerospermum) 100102A 的 16sRNA 部分核苷酸序列与美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology InformationUSA, NCBI)的基因库中的微生物16sRNA序列比对，将其命名球孢枝孢菌(Cladosporiumsphaerospermum) 100102A。该菌株的16s rRNA的部分核苷酸序列如下TCCGTAGGGGTAACCTGCGGAGGGATCATTACAAGTTGACCCCGGCCCTCGGGCCGGGATGTTCACAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTCCGGGCGGGGGCCCCGGGTGGACATTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAATTTAATTAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCGACGCGGTCCGCCGCGCGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTTCGTCCCCTCAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGCCGCGGGAGGCCACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA 本发明还涉及所述的菌球孢枝孢菌100102A在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤药物为治疗肝癌或神经癌的药物。具体的，所述应用为所述球孢枝孢菌100102A提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，所述提取物为正丁醇提取物，由如下方法获得球孢枝孢菌100102A(CCTCC No M 2012290)接种至液体发酵培养基，于25 35°C、15(T250r/min振荡条件下培养1Γ30天，得到发酵液，发酵液经细胞破碎，离心取滤液用正丁醇萃取，萃取液浓缩得浸膏，浸膏以乙醇水体积比为2 8^10 0为流动相，进行HP-20大孔树脂层析过柱，梯度洗脱，收集乙醇体积浓度80%以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物；所述液体培养基组成为葡萄糖8 20 g/L，蛋白胨1.5 3 g/L，酵母膏0. 8 2g/L，溶剂为水人工海水体积比I :1 4的混合液，pH 7 8。所述人工海水每100 ml 组成为=NaCl 2.448 g, Na2SO4 0.3917 g，KCl 0. 0664 g,KBr 0.0096 g，SrCl2 0. 0024 g，MgCl ·6Η20 0.4981 g, CaCl2 .H2O 0.1102 g, NaHCO3 0.0192g, H3BO3 0.0026 g, NaF 0.0004 g,蒸馏水 100 ml。所述菌株在培养前，通常需要先经斜面培养活化，然后经种子培养、获得种子菌株再接入液体发酵培养基进行产酶培养。所述的斜面培养基组成为土豆15(T350g/L，葡萄糖l(T30g/L，琼脂15 35g/L，溶剂为水，pH7. 2^8. O。所述的平面种子培养基组成为葡萄糖8 15g/L，蛋白胨1.5 4g/L，酵母膏
0.5^1. 5g/L，琼脂15 20g/L，溶剂为水人工海水体积比I :广4的混合液，pH7. 2^8. O。所述的液体发酵培养基组成为葡萄糖8 15g/L，蛋白胨1.5 3g/L，酵母膏
0.8 2g/L，溶剂为水人工海水体积比I :1 4的混合液，pH7 8. O。具体的，所述提取物可由如下方法获得(I)将海洋真菌球孢枝孢菌CCTCC No M 2012290菌株接种于斜面培养基，于25 35°C培养2Γ48 h，得到活化后的菌种；所述的斜面培养基组成为土豆15(T350g/L，葡萄糖10 30g/L，琼脂15 35g/L，溶剂为水，PH7. 2 8. O ；(2)将步骤(I)活化培养后海洋真菌孢枝孢菌CCTCC No M 2012290菌体接种至液体种子培养基中，于25 35°C条件下培养16 48h，得到种子菌；所述液体种子培养基组成为葡萄糖8 15 g/L，蛋白胨1.5 4 g/L，酵母膏O. 5 1. 5 g/L，溶剂为水人工海水体积比I Γ4的混合液，ρΗ7· 2 8. O ；(3)将步骤(2)种子菌株以19Γ10%的体积比的接种量，移种到液体发酵培养基中，于25 35°C、15(T250 r/min振荡条件下培养14 30天，得到发酵液；所述液体发酵培养基组成为葡萄糖8 20 g/L，蛋白胨1.5 3 g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶剂为水人工海水体积比I Γ4的混合液，pH 7 8 ；(4)将步骤(3)的发酵液于4°C条件下细胞破碎、离心 或者过滤，分离除去菌体，取滤液用正丁醇萃取后收集上层萃取液，浓缩挥干制得的油状提取物总浸膏；(5)将步骤(4)的油状提取物总浸膏进行HP-20大孔树脂柱处理，以乙醇水体积比为2 8^10 0为流动相，梯度洗脱，收集乙醇体积浓度80%以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物。本发明的有益效果主要体现在(1)本发明的海洋真菌菌株一球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A营养要求简单、容易培养；(2)该菌株的代谢产物具有抗肿瘤活性；(3)该菌株的次级代谢产物的抗肿瘤活性高，其培养所得的发酵液总浸膏对肝癌细胞(HepG2)有一定的抗肿瘤活性。对其总浸膏进行过HP-20大孔树脂柱处理，收集得到的小极性部位对H印G2和PC12细胞的抑制活性在浓度200 μ g/ml时抑制率可达95%以上，具有很强的抗肿瘤活性。
图I为平板培养基上球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A的菌落形态；图2为光学显微镜下球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A的菌体形态。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :菌株的筛选、纯化及鉴定( I)将自东海海域采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上，28°C培养至菌落数量不再增加，挑取单菌落至斜面培养基上。28°C培养2d，以菌株形态特征区别进行挑选，即得该菌株。所述土豆平板培养基按如下组成配制土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml ；(2)对筛选获得的菌株100102A进行16sRNA的PCR产物核苷酸序列比对，将其命名为球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A,提交中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No M 2012290，保藏日期2012年7月18日。实施例2 :菌株的活化及大规模培养
(I)将实施例I中筛选获得的菌株接种于斜面培养基，于28°C培养24 48h，得到活化后的菌株，所述斜面培养基按如下组成配制土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水IOOOml。(2)将步骤(I)活化培养后的菌株接种至液体种子培养基中，于28°C、15(T250r/min振荡条件下培养24 48h，得到种子液，所液体种子培养基按如下组成配制葡萄糖IOg,蛋白胨2g，酵母膏Ig,蒸懼水400ml,人工海水600ml, ρΗ7· 5。(3)将步骤(2)种子液以8%的体积比的接种量，移种到大规模液体发酵培养基中，于28°C、15(T250 r/min振荡条件下培养21d，得到发酵液。所述液体发酵培养基按如下组成配制葡萄糖IOg,蛋白胨2g,酵母膏Ig,蒸懼水400ml,人工海水600ml, pH7. 5。实施例3 :海洋真菌球抱枝抱菌(Cladosporium sphaerospermum) 100102A在抗肿 瘤活性中的应用(I)将实施例2中培养所得的发酵液先于超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎20min,然后于4°C条件下离心(9000r/min, 15min)(或者过滤也可)，除去菌体，用等体积正丁醇进行萃取，对萃取相进行旋蒸，所得浸膏即为该菌株的次级代谢产物总浸膏。(2)将实施例2所得的发酵液总浸膏进行粗略的分离，取IOg总浸膏进行上柱(柱高170cm，直径lcm，填料HP-20大孔吸附树脂)，用乙醇水体积比为2 : 8，4 : 6，6 : 4，8 2,10 O的洗脱剂分别进行冲洗，每个梯度冲洗500ml，对冲洗所得液体进行旋蒸处理，最终得5个部位，分别标为A、B、C、D、E。(3)将步骤(I)所得的发酵液总浸膏以及步骤(2)所得的5个部位A、B、C、D、E进行抗肿瘤活性测定。具体步骤如下选取两株肿瘤细胞，分别为肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12细胞)和肝癌细胞(HepG2细胞)，取对数期的细胞株制成细胞悬液，接种于96孔板中，培养48h，待测样品(总浸膏、5个部位A、B、C、D、E)加入O. 1%DMS010 μ L溶解后，用无血清的1640细胞培养基稀释，加100 μ L至试验组中，使得最终发酵液总浸膏的浓度分别为50 μ g/ml、100μ g/ml、200y g/ml、400y g/ml、800y g/ml，5 个部位 A、B、C、D、E 的浓度均为 200 μ g/ml，阴性对照组加等量不含样品的无血清培养基，空白对照组则为无细胞和样品的无血清培养基，依托泊苷(VP-16)作为阳性对照品，每个浓度设5个复孔，肿瘤细胞在C02培养箱(37°C )培养48h，每孔加入5mg/ml的MTT20 μ L，继续培养4h后，小心移去上清，每孔加DMSO150 μ L，振荡lOmin，用酶标仪充分振荡使得MTT紫色产物完全溶解，测490nm的A值，根据公式抑制率=(A阴性对照组-A空白对照组)-(A样品组-A空白对照组)/ (A阴性对照组-A空白对照组)即可求得抑制率。(4)根据步骤(I) - (3)所得的数据见表广3。表I :菌株发酵液浸膏对!fepG2细胞的抑制作用
药物浓度(μ g/ml)I抑制率(％)
5036.30 —
TOO36.78 —
20037.01 —
40045.94 —
800丨51.20 —表2 :菌株发酵液浸膏对PC12细胞的抑制作用
权利要求
1.一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌-球孢枝孢菌(Cladosporium sphaerospermum)100102A,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M 2012290，保藏日期2012年7月18日。
2.如权利要求I所述的球孢枝孢菌100102A在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤药物为治疗肝癌或神经癌的药物。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述球孢枝孢菌100102A提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述提取物为正丁醇提取物，由如下方法获得球孢枝孢菌100102A接种至液体发酵培养基，于25 35°C、15(T250r/min振荡条件下培养1Γ30天，得到发酵液，发酵液经细胞破碎，离心取滤液用正丁醇萃取，萃取液浓缩得浸膏，浸膏以乙醇水体积比为2 8^10 0为流动相，进行HP-20大孔树脂层析过柱，梯度洗脱，收集乙醇体积浓度80%以上的洗脱液，旋蒸浓缩挥干，即得所述正丁醇提取物；所述液体培养基组成为葡萄糖8 20 g/L，蛋白胨I. 5 3 g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶剂为水人工海水体积比I :1 4的混合液，pH 7 8。
全文摘要
本发明提供了一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌——分枝孢子菌属真菌球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)MNP100102A及其应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NoM 2012290，保藏日期2012年7月18日。本发明的有益效果主要体现在(1)本发明菌株营养要求简单、容易培养；(2)该菌株的代谢产物具有抗肿瘤活性；(3)该菌株的次级代谢产物的抗肿瘤活性高，其培养所得的发酵液总浸膏对肝癌细胞(HepG2)有一定的抗肿瘤活性，对其总浸膏进行过HP-20大孔树脂柱处理，收集得到的小极性部位对HepG2和PC12细胞的抑制活性在浓度200μg/ml时抑制率可达95%以上，具有很强的抗肿瘤活性。
文档编号C12P1/02GK102911877SQ20121030828
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者王鸿, 谢燕瑾, 叶建军, 潘超 申请人:浙江工业大学