专利名称：变性梯度凝胶电泳技术检测黄酒麦曲中细菌群落结构的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测黄酒麦曲细菌群落结构的方法，尤其是一种利用 PCR-DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis,^ ^^!!!) ii^^llJII 酒麦曲细菌群落结构，本发明属于微生物生态技术领域。
背景技术：
变性梯度凝胶电泳技术是一种检测DNA突变的电泳技术。Muzyer等在微生物生态研究中首次采用了该技术，并且证实了该技术在研究微生物多样性方面具有明显的优越性。DGGE能够分离长度相同但是碱基组成不相同的DNA片段混合物，变性剂——尿素和去离子甲酰胺添加到普通的丙烯酰胺凝胶中从而形成从低到高的线性梯度。在一定的温度条件下，不同碱基组成的DNA片段解链温度是不相同的，从而会造成不同的电泳迁移率，故将这些DNA片段在添加变性剂的凝胶中进行电泳时，会迁移到凝胶的不同位置，最终将长度相同但碱基组成不同的DNA片段分离开来。将PCR和DGGE联合起来，在适宜的变性梯度条件下能够分辨出一个碱基对的差异，分辨率高。染色后的凝胶图谱通过条带数的多少在一定程度上可以反应样品中微生物组成的差异，条带的亮度在一定程度上可以反应出样品中微生物的多少。传统的研究微生物多样性的方法主要依赖于培养法，即通过菌株的分离纯化、形态和显微镜观察、生理生化特征的比较后进行菌株的分类鉴定，该方法步骤复杂、工作量大，而且对于生理生化特征相似的菌株难以进行正确的鉴定和分类。黄酒是中国传统的酿造酒之一，“以麦制曲，用曲酿酒”是中国黄酒的特色。麦曲在黄酒的酿造过程中发挥重要的作用，为黄酒的酿造提供多种复合酶、风味物质。目前对于黄酒麦曲微生物群落结构的研究主要集中于传统的分离培养和初步鉴定。应用PCR-DGGE技术分析黄酒麦曲中细菌微生物群落结构的组成，对判断和鉴定麦曲中的优势微生物、功能微生物具有重要的理论和实践
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发明内容
本发明的目的在于针对传统分离培养法存在的问题，利用变性梯度凝胶电泳技术检测黄酒麦曲中细菌微生物群落结构。本发明不依赖传统的分离培养，利用适合DGGE分离的细菌通用引物，结合PCR-DGGE技术分析黄酒麦曲中的优势细菌和功能微生物。本方法具有简便、快捷、重复性好等特点，结合传统的分离方法能够更加全面的反应麦曲中的细菌微生物群落结构组成，为研究黄酒麦曲的功能微生物提供有力的证明。本发明的技术方案利用氯化苄法提取黄酒麦曲样品的基因组DNA，PCR扩增细菌的16S rDNA V3区，DGGE电泳分离DNA片段，切胶回收微生物对应的条带，二次PCR扩增及 T-克隆和挑选阳性克隆子，DGGE电泳条带比对，测序鉴定切胶条带对应的微生物。本发明通过PCR-DGGE技术检测黄酒麦曲中细菌微生物群落结构，可广泛用于分析不同工艺、不同地区的黄酒麦曲样品及同一种黄酒麦曲样品制作过程中细菌微生物群落结构变化的规律，为功能微生物的分离鉴定提供参考。具体实施方法实施例1基因组DNA提取称取l.Og麦曲样品放入IOmL离心管中，同时加入2. 5mL提取液(100mmol/L Tris-HCl, pH8. 0,40mmol/L EDTA, pH8. 0)振荡混勻后，再加入 lmL10% SDS 和 2mL 氯化苄， 50°C保温 Ih (每 IOmin 上下颠倒混勻)，加入 ImL 3mol/L 的 NaAc，冰浴 15min, 12，000r/min 离心15min，取上清，加入等体积的异丙醇，_20°C放置2h，12，000r/min离心15min，弃上清， 加入70%乙醇洗涤，离心15min，弃上清，待乙醇挥发完后加入50 μ L TE溶解。实施例2PCR-DGGE分析设计扩增细菌16S rDNA V3区的引物对，并在正向引物的5，端加上GC夹；引物是=Fl 5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’Rl :5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，。50μ L 反应体系包括36 μ L双蒸水，5 μ LlO XPCR Buffer, 4 μ L dNTP，2 μ L 的引物，1 μ L 的模板，0. 25 μ L 的 ExTaq 酶(5u/ μ L)。94°C预变性 4min，94°C变性 45S，55°C退火 45S，72°C延伸 45S，35 个循环，最后 72°C延伸 IOmin0 将 PCR 产物在变性梯度凝胶电泳上进行分离；电泳的相关参数是电压150V，60°C下电泳4h，丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性梯度是50% -65% (100%的变性剂由7mol/L尿素和质量分数为 40%的去离子甲酰胺组成，电泳结果如
图1所示，三个泳道为设置的三个重复。实施例3细菌群落分析对DGGE胶上的条带进行切胶回收将10000 X STOR-Green稀释成IXSTOR-Green 进行染色，其染色过程分3次，每次染色15min ；切胶回收的方法用无菌小刀将优势条带切下后放入灭过菌的离心管中，加入200 μ L的灭菌双蒸水4°C冰箱过夜；切胶条带PCR后进行T-克隆PCR扩增采用的引物及扩增程序实施例2 —样。将实施例2中得到的PCR产物与本实施例中阳性克隆子对应的PCR产物进行DGGE比对。把比对正确的阳性克隆子进行测序，在Genbank进行结果比对；获得黄酒麦曲细菌微生物群落的结构。选取图1中A、B条带为例子进行说明，A条带测序结果如SEQ ID N0. 3所示，B条带测序结果如SEQ ID N0. 4 所示。A、B的Genbank部分比对结果分别如图2、图3所示。最终确定A、B最可能的微生物如下表(表1)所示。表1微生物相似度鉴定
权利要求
1.变性梯度凝胶电泳技术检测黄酒麦曲中细菌群落结构的方法，其特征在于提取麦曲样品基因组DNA后，通过特定引物PCR扩增细菌16S rDNA V3区、DGGE电泳进行条带分离， 条带回收后进行二次PCR及T-克隆，挑选阳性克隆子DGGE条带比对，比对正确后测序并到 GenBank获取微生物的相关信息。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述样品为任一种待检测的黄酒麦曲样品，样品采用缩分法取样，最终样品的重量为lg。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述特定引物为Fl5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3，，Rl 5， -ATTACCGCGGCTGCTGG-3，。
4.权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述PCR扩增程序为94°C预变性％iin， 94°C变性45S，55°C退火45S，72°C延伸45S，35个循环，最后72°C延伸IOmin0
5.权利要求1-2所述的方法，其特征在于所述变性梯度凝胶电泳的相关参数是电压 150V，60°C下电泳4h，丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性梯度是50% -65 %，100%的变性剂由 7mol/L尿素和质量分数为40%的去离子甲酰胺组成。
6.权利要求1-2所述的方法，其特征在于所述对DGGE胶上的条带回收过程为将 10000 X SYBR-Green稀释成1 X SYBR-Green进行染色，染色过程分3次，每次染色15min ；用无菌小刀将优势条带切下后放入灭过菌的离心管中，加入200 μ L的灭菌双蒸水4°C冰箱过夜。
全文摘要
本发明公开了一种变性梯度凝胶电泳技术检测黄酒麦曲中细菌群落结构的方法，采用氯化苄法提取麦曲样品基因组DNA，PCR扩增细菌16S rDNA V3区，DGGE电泳条带分离，割胶回收后二次PCR及T-克隆，挑选阳性克隆子DGGE条带比对，比对正确后测序并到GenBank获取微生物的相关信息。本发明简便、快捷、重复性好，对分析黄酒麦曲中的优势细菌和功能微生物具有很好的指导意义。
文档编号C12Q1/04GK102277432SQ201110222810
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者张中华, 管政兵, 陆健, 陈亮亮 申请人:江南大学