一种山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR₃₈₄标记的制作方法

专利名称：一种山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR₃₈₄标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特异TRAP-SCAR384标记。
背景技术：
小麦是世界上重要的粮食作物之一。在中国它是仅次于水稻的第二大农作物，小麦生产对国民经济发展有着十分重要的战略意义。由于小麦栽培品种单一化，使其遗传基础日益狭窄，抗源匮乏，极大地限制了其产量和品质的进一步改良。小麦的近缘物种中存在着大量的遗传变异，是小麦改良可以利用的有益基因资源，将这些有益基因导入小麦一直是遗传学家和育种学家经久不衰的研究课题。创制易位系是把外源有益基因导入小麦的一种有效途径。常用的创制易位系的方法有自发易位、辐射诱发、利用Wi基因、染色体错分裂与着丝点再融合、组织培养以及利用杀配子染色体等。国内外的研究都已证明，利用杀配子染色体诱导产生易位的频率要远远高于其它方法。山羊草属植物中的一些杀配子染色体，当单体附加到不同基因型普通小麦中时，具有完全或不完全的杀配子作用，在不完全杀配子作用下，可高频诱导各种类型的染色体结构变异，变异频率可达10%以上，远远高于自发易位、辐射诱发、Wi基因等其他方法的诱导效率。这些杀配子染色体是经长期自然选择保留下来的，有的与小麦有部分同源关系，在诱导染色体结构变异中有特殊的意义。杀配子染色体不仅可诱导普通小麦染色体结构变异，而且对附加或代换到普通小麦中的外源染色体也具有同样的功能，这就为小麦的诱变育种开辟了一条新途径。杀配子染色体起源于不同的基因组(C， S或M)，就同祖性来说，现已识别出三种类型的山羊草杀配子染色体同祖群2中的杀配子染色体 Ae. Iongissima (2)、Ae. sharonensis、Ae. cylindrica、Ae. speltoides (1) 和Ae. speltoides O)；同袓群3中的杀配子染色体Ae. triuncialis (1)和 Ae. triuncialis(2)；同袓群 4 中的杀配子染色体 Ae. Iongissima(I)、Ae. Iongissima (3)、 Ae.sharonensis(2)禾口 Ae. sharonensis(3)0杀配子染色体效应的强度是多样的，从致死到半致死，而且也受不同小麦的遗传背景的影响，其作用特点、方式也各不相同。染色体2S1()，2Ssh，T2B-2Ssp'au,4Sl0,4Ssh,4Ssh#2, 在“中国春”小麦中引起不带这些染色体的配子完全不育，因此无法传递给下一代。3C染色体在“中国春”中发挥很强的杀配子效应，但在其它品种中却产生温和的、半致死效应，暗示在这些栽培品种中仍存在阻遏基因。染色体T2B-2SSP "，2C，3(fAT*4Mg，在中国春中诱导半致死效应的染色体断裂，而且结构重排的染色体可以被保留和分离。染色体3C和3Csat都起源于离果山羊草，但是它们的杀配子效应强度在“中国春”中却不相同；其中3C的效应是致死的，而3CSAT则是半致死的。杀配子染色体2C在普通小麦“中国春”等遗传背景下可诱导半致死效应的染色体断裂，使后代产生易位、缺失等染色体结构畸变。利用杀配子染色体2C在构建大麦染色体缺失图谱，诱导小麦-偃麦草、小麦-冰草易位等方面取得了很好的成效。在杀配子染色体 2C的利用过程中，杂种后代中2C染色体的鉴定是非常重要的环节。有很多学者利用分带的方法对后代进行鉴定，但该方法非常繁琐，而且需要结合相关的细胞学技术。与之相比，利用DNA分子标记进行鉴定则是十分方便快捷的途径。靶位区域扩增多态性(TRAP)是一种新型的基于PCR的分子标记，由美国农业部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出，它借助大规模测序技术产生的许多生物的大量序列信息，利用生物信息学工具和表达序列标签(expressed sequence tag, EST)数据库信息设计引物，对目标候选基因序列区进行扩增产生多态性分子标记，该标记技术已广泛应用于动植物的研究中，主要在种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、绘制基因组转录图谱、重要的性状标记、比较基因组学、亲缘关系和遗传多样性等方面取得了进展。

发明内容
本发明的目的在于提供一种山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记。山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记为SCAR384，其序列为SEQ IDNo. 6 ；扩增 SCAR384 的引物为 2C_F384 和 2C_R384，分别具有 SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 5 的核苷酸序列。山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记的获取方法按以下步骤进行一、采用CTAB法从山羊草幼嫩叶片中提取基因组DNA作为模板，采用引物1和2 进行PCR扩增，获得W55 ARBI1-883片段；二、W55 ARBI1-883片段纯化后连接到pMD18_T载体，所得产物连接转化大肠杆菌 JM109感受态细胞，然后涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆， 提取质粒进行酶切鉴定后测序，长度为88;3bp ；三、根据设计SCAR引物的要求利用软件Primer Premier 5. 0和DNAMAN5. 0软件进行W55 ARBI1-883片段的特异SCAR引物设计，所得引物为2C_F384和2C_R384，扩增后获得 384bp的特异片段，SCAR384，即为山羊草属杀配子染色体2C特异TRAp-SCAR384标记；其中步骤一中引物1的核苷酸序列为5，-GCTTCCCTACAACAAACC-3’，引物2的核苷酸序列为5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3，；步骤三中引物2C-F384的核苷酸序列为5，-TGAAGCCGTCAAAGTAGAAT-3，，引物 2C-R384 的核苷酸序列为5，-CGGAACAAGCCAAAGCAC-3，；步骤二中W55ARBI1-883片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。本发明应用的分子标记是TRAP，具有简单、稳定、效率高的特点，且PCR产物只用琼脂糖电泳就可以检测各品系间的多态性。本发明使用的PCR反应体系，不需要特殊的PCR反应仪器和特殊的反应试剂，与其它普通PCR反应要求一样。本发明获得山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记，为快速鉴定小麦遗传背景下的杀配子染色体2C外源染色质或染色体奠定了良好的基础，同时也为分子标记辅助育种提供了十分方便快捷的途径。通过本发明的实验证明，该TRAP-SCAR384标记的开发对于鉴定普通小麦中导入的杀配子染色体2C是极其有价值的，为大量杂交后代的筛选和鉴定工作提供了十分方便快捷的途径。


图1为具体实施方式
二中TRAP弓丨物在普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系、柱穗山羊草三种材料中的扩增结果的电泳图，其中泳道1表示普通小麦“中国春”，泳道2表示杀配子染色体2C 二体附加系，泳道3表示柱穗山羊草，Marker DL2000 ；图2为具体实施方式
二中SCAR384标记在柱穗山羊草、“中国春”_杀配子染色体2C 二体附加系、普通小麦“中国春”、二倍体长穗偃麦草中的扩增结果的电泳图，其中泳道1表示“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系，泳道2表示柱穗山羊草，泳道3表示普通小麦 “中国春”，泳道4表示二倍体长穗偃麦草，Marker :DL2000 ；图3为具体实施方式
二中SCAR384 标记在“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂种后代FpF2中的扩增结果的电泳图，其中泳道1表示普通小麦-“中国春”，泳道2表示二倍体长穗偃麦草，泳道3 13表示“中国春”-长穗偃麦草7E 二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系杂交获得的F1代材料，泳道14 M表示F1代自交获得的F2代材料，Marker :DL2000。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记为 SCAR384，其序列为SEQ ID No. 6 ；扩增SCAR384的引物为2C_F384和2C_R384，分别具有SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列。
具体实施方式
二 本实施方式山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记的获取方法按以下步骤进行一、采用CTAB法从山羊草幼嫩叶片中提取基因组DNA作为模板，采用引物1和2 进行PCR扩增，获得W55 ARBI1-883片段；二、W55 ARBI1-883片段纯化后连接到pMD18_T载体，所得产物连接转化大肠杆菌 JM109感受态细胞，然后涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆， 提取质粒进行酶切鉴定后测序，长度为88;3bp ；三、根据设计SCAR引物的要求利用软件Primer Premier 5. 0和DNAMAN5. 0软件进行W55 ARBI1-883片段的特异SCAR引物设计，所得引物为2C_F384和2C_R384，扩增后获得 384bp的特异片段，SCAR384，即为山羊草属杀配子染色体2C特异TRAp-SCAR384标记；其中步骤一中引物1的核苷酸序列为5’ -GCTTCCCTACAACAAACC-3’，引物2的核苷酸序列为5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3，；步骤三中引物2C-F384的核苷酸序列为5，-TGAAGCCGTCAAAGTAGAAT-3，，引物 2C-R384 的核苷酸序列为5，-CGGAACAAGCCAAAGCAC-3，；步骤二中W55 ARBI1-883片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。本实施方式中步骤一中山羊草为柱穗山羊草，由日本国家生物资源计划小麦中心 (http://www. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp)提供。本实施方式中pMD18-T载体和大肠杆菌JM109感受态细胞均为购买得到本实施方式中涉及引物合成与基因合成的部分由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；本实施方式在具体操作中涉及使用的各种反应试剂均为购买得到(宝生物工程 有限公司，大连，中国)；本实施方式在具体操作中涉及使用的试剂盒均按说明书操作(宝 生物工程有限公司，大连，中国)。本实施方式中W55 ARBI1-883片段在NCBI中进行Blast搜索，利用软件！3rimer Premier 5. 0和DNAMAN5. 0进行序列比对及分析，结果显示，未找到与其具有同源性的序 列。本实施方式中所得引物为2C_F384和2C_R384，扩增后获得384bp的特异片段，即为 山羊草属杀配子染色体2C特异TRAp-SCAR384标记，其PCR扩增产物片段大小为384bp，命名 为 SCAR384 ；山羊草属杀配子染色体2C特异SCAR384分子标记验证利用普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C ニ体附加系、柱穗山羊草和 二倍体长穗偃麦草材料进行了 SCAR384标记验证，在“中国春”-杀配子染色体2C ニ体附加 系、柱穗山羊草中扩增出了 384bp的片段，而在普通小麦“中国春”、二倍体长穗偃麦草中没 有该产物，初歩证明此TRAP-SCAR384标记可以用于杀配子染色体2C的检测；(其中图1为 TRAP引物在普通小麦“中国春”、杀配子染色体2C ニ体附加系、柱穗山羊草三种材料中的扩 增结果；图2为SCAR384标记在柱穗山羊草、“中国春”-杀配子染色体2C ニ体附加系、二倍 体长穗偃麦草中的扩增結果)。山羊草属杀配子染色体2C特异SCAR384分子标记应用用该对SCAR384引物对“中国春”-杀配子染色体2C ニ体附加系与“中国春”-长穗 偃麦草7E ニ体附加系的杂种F1代、F2代进行了分析，结果在全部F1代以及部分F2代材料 中扩增出了目的片段，进ー步证明了此TRAP-SCAR384标记可以用来检测小麦背景下的杀配 子染色体2C，为小麦背景中杀配子染色体2C的快速跟踪检测提供了新途径；(其中图3为 SCAR384标记在“中国春”-长穗偃麦草7E ニ体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C ニ体 附加系杂种后代F1. F2中的扩增結果)。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
ニ不同的是步骤一中PCR扩增的反 应体系为20 y L反应体系，由下列成分組成
成分用量
山羊草幼嫩叶片中基因组DNA50 ng
0.3pmol 引物 1luL 5，-GCTTCCCTAC AAC AAACC-3 ‘
IOpmol 引物 2luL5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3，
10 X扩增缓冲液2|iL
2.5mM dNTP Mix1.5|iL
5υ/μ DNA 聚合酶0.2|iL
ddH20余量PCR 扩增条件为94°C预变性 2min，94°C变性 45s，35°C退火 45s，72°C延伸 lmin， 共5个循环，94°C变性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin，共；35个循环，再72°C延伸7min， 4°C保温。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中连接的体系如下
成分用量
0.2 pmol W55 ARBI1-883 片段2|iL
pMD18-T 载体l|iL
Solution I5 μι
ddH20余量连接条件为16°C连接过夜。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤二中氨苄抗性的 LB固体培养基每IOOOmL由50 μ g的氨苄青霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、IOg NaCl的和余量的水组成，pH值为6. 0 8. 0。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤三中设计SCAR引物的要求①引物长度为20 22bp ；②退火温度为52 58°C;③GC含量为40 55%;④ 产物片段大小为400 800bp。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
权利要求
1.一种山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAIi384标记，其特征在于，山羊草属杀配子染色体2C特异TRAp-SCAR384标记为SCAR384，其序列为SEQ ID No. 6。
2.根据权利要求1所述一种山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记，其特征在于扩增SCAR384的引物为2C-F384和2C-R384，分别具有SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列。
3.获取如权利要求1所述一种山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记的方法，其特征在于获取山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记的方法按以下步骤进行一、采用CTAB法从山羊草幼嫩叶片中提取基因组DNA作为模板，采用引物1和2进行 PCR扩增，获得W55ARBI1-883片段；二、W55ARBI1-883片段纯化后连接到pMD18_T载体，所得产物连接转化大肠杆菌 JM109感受态细胞，然后涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基中进行培养，挑取阳性克隆， 提取质粒进行酶切鉴定后测序，长度为88;3bp ；三、根据设计SCAR引物的要求利用软件PrimerPremier 5. 0和DNAMAN5. 0软件进行 W55 ARBI1-883片段的特异SCAR引物设计，所得引物为2C_F384和2C_R384，扩增后获得384bp 的特异片段，SCAR384，即为山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记；其中步骤一中引物1的核苷酸序列为5’ -GCTTCCCTACAACAAACC-3’，引物2的核苷酸序列为5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3，；步骤三中引物2C-F384的核苷酸序列为5’-TGAAGCCGTCAAAGTAGAAT-3’，引物2C_R384的核苷酸序列为5，-CGGAACAAGCCAAAGCAC-3’ ；步骤二中W55 ARBI1-883片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
4.根据权利要求3所述的获取山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记的方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为20 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量山羊草幼嫩叶片中基因组DNA50 ng0.3 pmol 引物 1Ιμ 5，-GCTTCCCTAC AAC AAACC-3 ‘IOpmol 引物 2Ιμ 5，-GACTGCGTACGAATTAAT-3 ‘10 X扩增缓冲液2μL2.5 mM dNTP Mix1.5jiL5U~L DNA聚合酶0.2|_iLddH20余量PCR扩增条件为94°C预变性anin，94°C变性45s，35°C退火45s，72°C延伸lmin，共5个循环，94°C变性45s，50°C退火45s，72°C延伸lmin，共；35个循环，再72°C延伸7min，4°C保
5.根据权利要求3所述的获取山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记的方法，其特征在于步骤二中连接的体系如下成分用量 .0.2 pmol W55 ARBI1-883 片段2|iLpMD18-T 载体l|iLSolution I5 μιddH20余量连接条件为16°C连接过夜。
6.根据权利要求3所述的获取山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记的方法，其特征在于步骤二中氨苄抗性的LB固体培养基每IOOOmL由50 μ g的氨苄青霉素、IOg 的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、IOg的NaCl和余量的水组成，pH值为6. 0 8. 0。
全文摘要
一种山羊草属杀配子染色体2C特异TRAP-SCAR384标记。标记为SCAR384；扩增SCAR384的引物为2C-F384和2C-R384。方法从山羊草中提取基因组DNA作为模板，TRAP-PCR扩增后获得W55 ARBI1-883片段；W55 ARBI1-883片段纯化后连接到pMD18-T载体，连接产物转化感受态细胞后挑取阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定后测序，长度为883bp；根据设计SCAR引物的要求设计引物为2C-F384和2C-R384，扩增后获得384bp的特异片段，SCAR384。本发明的标记简单、稳定、效率高，且PCR产物只用琼脂糖电泳就可以检测各品系间的多态性。
文档编号C12N15/11GK102286478SQ20111022253
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者吴磊, 徐国辉, 束永俊, 苏文悦, 郭长虹 申请人:哈尔滨师范大学