专利名称：禽卡氏杆菌pcr诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒。
背景技术：
禽卡氏杆菌病是近年来新发现的蛋鸡的一种传染病，是由卡氏杆菌 (Gallibacterium anatis)引起蛋鸡群的一种产蛋量下降的疾病，临床上以输卵管囊肿和卵巢炎等为主要特征。卡氏杆菌不仅是禽卡氏杆菌病的病原，而且还能够引起其他多种禽类患病。卡氏杆菌常与鸡减蛋综合征病毒、鸡传染性支气管炎病毒、霉形体、禽肺病毒等病原混合感染，使病情加重和复杂化，给养禽业带来了巨大的经济损失。卡氏杆菌为两端钝圆的球杆菌，有时呈现多形性，无芽孢，不运动。菌体单个散在或成对分布。革兰氏染色阴性。 瑞氏和美兰染色呈两极着色，有明显或微弱荚膜，需氧菌。目前已鉴定的卡氏杆菌有M个血清型。其中有3个致病性血清型，分别为1型、2型和4型。随着研究的逐步深入，卡氏杆菌的血清型越来越趋于多样化，在同一个鸡场，血清型的分布也会有所不同；而且，各血清型之间没有交叉免疫保护作用。现在缺少一种能对临床样品中的禽卡氏杆菌进行简便、快捷、灵敏、准确的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，它可以快速检测病料中是否含有卡氏杆菌，并且简便、灵敏、准备。本发明是这样实现的禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，它包括500 μ 1浓度为25 mg/ ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE缓冲液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超纯水，30 μ 1的 Marker DL2000，50 μ 1等体积混合的引物P1，P2，引物P1、P2的浓度均为20 μ M，30 μ 1的阴性对照以及30 μ 1的阳性对照。裂解液为由Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH为8. 0，以及占裂解液总体积5%的 triton X-100组成的混合溶液。PCR 酶的组分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1。引物Ρ1，Ρ2的序列分别为 阴性对照为去离子水；
阳性对照为重组PMD18-T-16srRNA质粒。PCR方法的建立
PCR体系在25 μ 1反应体系中最佳反应条件为，退火温度60° C，Taq DNA polymerase 1 U，引物浓度ΙΟμΜ，用引物均有效扩增出了其目的片段，片段大小为780bp。无非特异性片段产生(见图1)。结果表明禽卡氏杆菌PCR检测方法建立成功。敏感性试验
在PCR反应中，10CFU/ml 1 X IO7 CFU/ml稀释的卡氏杆菌进行PCR，卡氏杆菌的最低检测量为1000CFU (见图2)。结果表明建立的PCR敏感性高。特异性试验
以禽卡氏杆菌血清型1型、2型、4型、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌进行PCR反应。禽卡氏杆菌为阳性，而猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、 大肠杆菌的扩增结果均为阴性(见图3)。应用建立的PCR方法，重复检测卡氏杆菌DNA样品3次，结果均一致。从实验结果可以知道禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒能够对临床中禽卡氏杆菌进行快捷、灵敏、准确的检测。由于采用了上述技术方案，本发明通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测禽卡氏杆菌PCR试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照及阳性对照比较，可以得到检测结论， 从而起到快速检测病料中是否含有禽卡氏杆菌。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。
附图1为禽卡氏杆菌PCR试验图；M:DL2000 ；1 禽卡氏杆菌PCR结果。附图2为禽卡氏杆菌PCR敏感性试验图；M :DL2000 ;1 7 :1X107 CFU/ml 10CFU/ml稀释的禽卡氏杆菌PCR结果。附图3为PCR特异性试验图；M :DL2000 ； 1-3 禽卡氏杆菌1型、2型、4型PCR产物； 4 猪链球菌PCR产物；5 多杀性巴氏杆菌PCR产物；6 鼠伤寒沙门氏菌PCR产物；7 大肠杆菌PCR产物。
具体实施例方式
具体实施例方式禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，它包括500μ 1浓度为25 mg/ml 的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE缓冲液，TE缓冲液的具体组成成分为"Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH为8. 0 ；50 μ IPCR酶，PCR酶为自配的PCR预混液，其具体成分为IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1 ；200 μ 1 超纯水，30 μ 1 的 Marker DL2000,50y 1 等体积混合的引物 Pl， P2，引物PI、P2的浓度均为20 μ M，30 μ 1的阴性对照以及30 μ 1的阳性对照。
权利要求
1.一种禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，其特征在于它包括500 μ 1浓度为25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE缓冲液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超纯水，30 μ 1的Marker DL2000, 50 μ 1等体积混合的引物Pl，Ρ2，引物PI、Ρ2的浓度均为20 μ Μ，30 μ 1的阴性对照以及30 μ 1的阳性对照。
2.根据权利要求1所述的禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，其特征在于裂解液为由 Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH为8. 0，以及占裂解液总体积5%的triton X-100组成的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，其特征在于PCR酶的组分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 iTaq DNA polymerase/μ 1。
4.根据权利要求1所述的禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，其特征在于引物Pl，Ρ2的序列分别为P1 TTGAAAGCTTGCTTTCAATGC ；P2 :TCGAGAGCCATACCTTTCGTA。
5.根据权利要求1所述的禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，其特征在于阴性对照为去离子水。
6.根据权利要求1所述的禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，其特征在于阳性对照为重组 PMD18-T-16srRNA 质粒。
全文摘要
本发明公开了一种禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，它包括500μl浓度为25mg/ml的蛋白酶K，1500μl裂解液，2000μlTE缓冲液，50μlPCR酶，200μl超纯水，30μl的MarkerDL2000，50μl等体积混合的引物P1，P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，30μl的阴性对照以及30μl的阳性对照。本发明通过对PCR反应条件进行优化，研制了禽卡氏杆菌PCR诊断试剂盒，通过PCR检测结果与阳性对照和阴性对照比较，得出检测结论，从而起到快速鉴定菌株中是否含有禽卡氏杆菌溶血素基因。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方法简单，使用效果确实。
文档编号C12Q1/68GK102321742SQ201110222208
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者冯惠明, 孙志华, 徐安衡, 李武魁, 杨向东, 杨德明, 许玉清 申请人:云南瑞特农牧发展有限公司