制备禽霍乱外膜蛋白h和a基因及融合dna疫苗的方法

专利名称：制备禽霍乱外膜蛋白h和a基因及融合dna疫苗的方法
技术领域：
本发明属于动物疫苗技术领域，尤其是一种制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融 合DNA疫苗的方法。上述发明名称由于受标题字数的限制，其中的禽霍乱外膜蛋白H和A基因全称应 为禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因，故制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及 融合DNA疫苗的方法应为制备禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因及融合DNA 疫苗的方法。
背景技术：
禽霍乱是由禽多杀性巴氏杆菌引起的家禽接触性传染病，呈世界分布，在我国也 是常见的多发性传染病，几乎所有的家禽都能感染禽霍乱，其传染流行严重影响家禽业的 健康发展，也给家禽业带来了巨大的经济损失，据不完全统计，我国家禽感染上呼吸道带菌 率可高达37. 5飞7. 5%，成为禽霍乱爆发的主要原因之一。对于禽霍乱的控制措施主要采用药物治疗，如磺胺嘧啶或链霉素等抗生素的效果 较好，但存在停药后容易复发的缺点，且长期服用易导致致病菌产生耐药性，还可能会对禽 体产生明显的毒害作用，如蛋鸡用后产蛋率会明显下降，肉鸡用后则存在药物残留的危害 从而降低了其商业价值。因此，要想从根本上控制禽霍乱的流行，需要有效的疫苗进行免疫 预防。禽霍乱疫苗常用的有弱毒活疫苗和灭活疫苗两种，其中弱毒活疫苗的免疫期偏 短、免疫保护力偏低、局部及全身的反应偏大，不仅造成家禽的减食和严重产蛋下降，还会 造成一些死亡。此外，弱毒活疫苗的菌株遗传不够稳定，应用不当甚至会引起禽霍乱的爆发。而灭活疫苗存在保护率低和免疫期短的问题，较弱毒活疫苗更为严重。由于禽多杀性巴氏杆菌血清型众多，各血清型之间缺乏有效的交叉保护，因此给 禽霍乱的免疫预防带来了一定的困难。自20世纪制备氯霉素乙酰转移酶、荧光(素)酶或β-半乳糖苷酶DNA疫苗以来， 该类疫苗因具有制备方便、成本低廉、易保存、可诱导全面免疫应答等优点而广泛受到人们 的关注，被誉为疫苗发展史上的第三次革命。截止目前，通过制备禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因来获得融合 DNA疫苗的方法还未见相关报道。

发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA 疫苗的方法，该方法利用聚合酶链式反应法获得禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋 白A基因，然后将制备的禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因与真核表达载体 pcDNA3. 1 (+)制备出融合DNA疫苗，经动物实验验证表明本方法制备出的禽霍乱外膜蛋白H6和A基因融合DNA疫苗可有效地为被免疫的鸡提供抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力，保 护率可达75%，能够有效预防禽多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱。本发明涉及到以下菌种和试剂禽霍乱菌[或称禽多杀性巴氏杆菌Pasteurella muhocida CVCC474)]由中国 兽医微生物菌种保藏管理中心提供，其中的“CVCC474”为保藏编号；大肠杆菌感受态JM83 [^scAericAia. cWi JM83 1. 1100]由河南科技大学实验中心提 供，该菌种已经在美国罗歇分子生物学研究所和中国科学院微生物研究所注册保藏，其中 的“1.1100”为保藏编号；DNA凝胶回收试剂盒由[碧云天生物技术研究所(江苏省海门市解放东路602号)]提 供，该试剂盒中自配有成品的溶液I、溶液II和溶液III。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，该方法中将 基因序列5，-CGGGATCCAaaaaaacagcaattgc-3，自定义为引物①； 基因序列 5，-TAATGGATCCGAAGTGTACGCGTAAAC-3，自定义为引物②； 基因序列 5，-TGAGGTACCATGAAAAAGACAATCGTAG-3，自定义为引物③； 基因序列 5’ -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3，自定义为引物④； 本发明的方法包含如下内容I、利用聚合酶链式反应法获得未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱 外膜蛋白A基因i )在聚合酶链式反应管a中同时加入引物①和引物②各1微升，再依次加入DNA聚 合酶0. 5微升、聚合酶缓冲液2. 5微升、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3微升、禽霍乱菌基 因组模板1微升和水16微升，再将聚合酶链式反应管a放入聚合酶链式反应扩增仪中，设 定反应温度94°C时的预变性时间为5分钟，然后再将在94°C时变性1分钟到降至55°C时 的复性1分钟以及再升温至72°C的延伸2分钟称为一个循环，将所述一个循环重复30次， 30次循环结束后在72°C时再延伸10分钟制备出未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基 因； )在聚合酶链式反应管b中同时加入引物③和引物④各1微升，其余过程同i )，在 该过程中将所述一个循环中的“55°C”变为“53°C”，将“聚合酶链式反应管a”替换为“聚合 酶链式反应管b”即可制备出未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因；II、未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因的酶切回收纯化过程 该酶切回收纯化过程分为如下两步第一步，取1. 5毫升的离心管a，在离心管a中依次加入未经酶切回收纯化的禽霍乱外 膜蛋白H基因20微升、限制性内切酶Kpn I 3微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性 内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入有上述H基因和试剂的离心管a充分混勻后放 入37° C的水浴中3小时得到混合物H ；然后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳 缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板 中，凝固后的固体称为凝胶a ；将所述凝胶a放入电泳缓冲液中，将所述混合物H加入到所 述凝胶a中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电 泳仪得到凝胶b;第二步，取1. 5毫升的离心管b并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶b上的混合物H切 下来，将切下来的混合物H放在已称重的1. 5毫升的离心管b中，称取离心管b的总重并计 算出切下来的混合物H的重量，然后将离心管b中切下来的混合物H捣碎，在离心管b中加 入等体积的溶液I，颠倒离心管b混勻，将离心管b放置在50°C水浴中加热10分钟至混合 物H完全融解，融解过程需颠倒离心管b数次以加速混合物H的融解，将融解后的混合物H 倒入DNA纯化柱a上，该DNA纯化柱a已事先放置在收集管a中，在室温下将收集管a放置 1分钟，然后将收集管a放在离心机中离心1分钟，设定离心机的转速为12000转/分钟，离 心后倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a上加入700微升的溶液II， 在室温下将收集管a放置1分钟，再将收集管a在12000转/分钟的转速下离心1分钟，离 心后倒掉收集管a内的液体，随后再向DNA纯化柱a上加入500微升的溶液II，将收集管a 在12000转/分钟的转速下离心1分钟，再次倒掉收集管a内的液体并在13000转/分钟 的转速下离心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱a并放置于1. 5毫升的离心管c中，在 离心管c的DNA纯化柱a上加入30微升溶液III，将离心管c室温下放置1分钟，再将离心 管c在13000转/分钟的转速下离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到离心管c中的30微升 液体，该液体就是酶切回收纯化后的禽霍乱外膜蛋白H基因；III、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切回收纯化过程在1.5毫升的离心管d中依次加入真核表达载体pcDNA3. 1(+) 10微升、限制性内切酶 Kpn I 3微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水四微升，将 加入有上述载体和试剂的离心管d充分混勻后放入37° C的水浴中8小时得到混合物ρ ；然 后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末 充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶c ；将所述凝胶 c放入电泳缓冲液中，将所述混合物P加入到所述凝胶c中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压 为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶d ；然后重复上述II中的第二 步并将其中的离心管b替换成离心管e、凝胶b替换成凝胶d、混合物H替换成混合物P、 DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱b、收集管a替换成收集管b、离心管c替换成离心管f即可得 到离心管f中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)；IV、酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因与酶切回收纯化的真核表达载体 pcDNA3. 1⑴的连接和转化连接在1. 5毫升的离心管g中加入酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因10微升、 酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3. 1(+) 2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2 微升和水5微升，将加入有上述H基因、载体和试剂的离心管g放入16°C水浴中12小时；转化从16° C水浴中取出离心管g并加入200微升的大肠杆菌感受态JM83，再将离心 管g先放置在冰浴中30分钟，再在42° C的水浴中放置90秒，最后在冰浴中放置3分钟，然 后向离心管g中加入0. 5毫升LB液体培养基，将离心管g放置在37° C的摇床内以200转/ 分钟的速度振荡培养1. 5小时，振荡培养结束后从离心管g中取出100微升的液体并涂布 于含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养平板上，将涂布后的LB培养平板放置在 37°C的培养箱内倒置培养16小时；V、pcM质粒溶液的提取取出培养16小时后的LB培养平板，挑取LB培养平板上生长的其中一个菌落，将该菌落放入含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中，然后将所述的LB 液体培养基放置在37°C摇床内以200转/分钟的速度振荡培养16小时，振荡培养结束后 从所述的LB液体培养基中取出1毫升的液体并加入到1. 5毫升的离心管h中，再将离心管 h在12000转/分钟的转速下离心5分钟，弃掉离心管h中的上清液，然后往离心管h中的 沉淀物中加入100微升预先放置在4°C冰箱内冷却的溶液IV，将离心管h充分振荡混勻后 加入200微升的溶液V，反复颠倒离心管h数次，将离心管h放置于冰浴中3分钟，再向离 心管h中加入150微升预先放置在4°C冰箱内冷却的溶液VI，然后将离心管h放在冰浴中5 分钟，从冰浴中取出离心管h后在12000转/分钟的转速下和4°C的条件下离心10分钟，吸 取离心后离心管h中的上清液，将所述上清液加入到1. 5毫升的离心管i中，再向离心管i 中加入等量的苯酚和氯仿的混合液，将离心管i振荡后在12000转/分钟的转速下和4°C的 条件下离心10分钟，离心结束后将离心管i中的上层液体移入到1. 5毫升的离心管j中， 再向离心管j中加入上层液体2倍的无水乙醇，将离心管j放置于-20°C冰箱内冷藏20分 钟，然后取出离心管j放在13000转/分钟的转速下和4°C的条件下离心10分钟，将离心管 j中的上清液弃掉，再向离心管j中的沉淀物中加入0.5毫升浓度为70%的乙醇，在12000 转/分钟的转速下和4°C的条件下对离心管j离心5分钟，倒掉离心管j中的上清液，离心 管j中的沉淀物自定义为pcM质粒，待pcM质粒干燥后，向离心管j中加入30微升的水进 行充分溶解得到自定义为PcM质粒溶液；VI、pcM质粒溶液的酶切回收纯化过程在1. 5毫升的离心管k中依次加入pcM质粒溶液10微升、限制性内切酶BamH I 3微 升、限制性内切酶EcoR I 3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水四微升，将加入有上述 pcM质粒和试剂的离心管k充分混勻后放入37°C的水浴中8小时得到混合物M ；然后称取 1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶 解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶e ；将所述凝胶e放入 电泳缓冲液中，将所述混合物M加入到所述凝胶e中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120 伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶f ；然后重复上述II中的第二步并将 其中的离心管b替换成离心管m、凝胶b替换成凝胶f、混合物H替换成混合物M、DNA纯化 柱a替换成DNA纯化柱C、收集管a替换成收集管C、离心管c替换成离心管η即可得到离 心管η中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的pcM质粒溶液；通、未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因的酶切回收纯化过程取1. 5毫升的离心管0，在离心管ο中依次加入未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A 基因20微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性内切酶EcoR I 3微升、限制性内切酶缓 冲液5微升和水19微升，将加入有上述A基因和试剂的离心管ο充分混勻后放入37° C的 水浴中3小时得到混合物A ；然后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中 并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固 后的固体称为凝胶g ；将所述凝胶g放入电泳缓冲液中，将所述混合物A加入到所述凝胶g 中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到 凝胶h ；然后重复上述II中的第二步并将其中的离心管b替换成离心管ρ、凝胶b替换成凝 胶h、混合物H替换成混合物A、DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱d、收集管a替换成收集管 d、离心管c替换成离心管q即可得到离心管q中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的禽霍乱外膜蛋白A基因；通、酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的连接和转化连接在1. 5毫升的离心管r中加入酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因10微升、 酶切回收纯化的PcM质粒溶液2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5 微升，将加入有上述A基因、质粒和试剂的离心管r放入16°C水浴中12小时完成连接；转化重复上述IV并将离心管g替换成离心管r即完成酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋 白A基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的转化；IX、禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因制备融合DNA疫苗i)取出上述VDI中经转化培养16小时的LB培养平板，重复上述V的内容并将其中的 离心管h替换成离心管S、离心管i替换成离心管t、离心管j替换成离心管U，离心管U中 的沉淀物自定义为PcDNA-MA质粒，待PcDNA-MA质粒干燥后，向离心管u中加入30微升的 水进行充分溶解得到自定义为pcDNA-MA质粒溶液；ii)在1. 5毫升的离心管ν中依次加入pcDNA-MA质粒溶液2微升、限制性内切酶 Kpn I 1微升、限制性内切酶EcoR I 1微升、限制性内切酶缓冲液1微升和水5微升，将加 入有上述pcDNA-MA质粒和试剂的离心管ν充分混勻后放入37° C的水浴中2小时得到混合 物D ；然后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼 脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶i ；将 所述凝胶i放入电泳缓冲液中，将所述混合物D加入到所述凝胶i中，打开电泳仪开关，在 电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物D的凝胶j ； 将所述凝胶j放在凝胶成像系统中进行检测，若检测出凝胶j含有大小为2082个碱基对的 基因时，则证明该pcDNA-MA质粒是由禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因所制 备出的融合DNA疫苗。所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，LB液体培养基包含 有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠和水。所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，LB培养平板上包含 有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1. 5%的琼脂粉和水。所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，溶液IV包含有50毫 摩尔的葡萄糖、25毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10毫摩尔的乙二胺四乙酸和水。所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，溶液V包含有10毫 摩尔/升的氢氧化钠和10%的十二烷基磺酸钠。所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，溶液VI包含有60% 的5摩尔/升的乙酸钾、11. 5%的冰醋酸和水。由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性1、本发明所用的真核载体为PCDNA3. 1(+)，该载体具有合适的多克隆位点，有高效能稳 定和瞬时转染哺乳动物及人类细胞的能力，具有高效率巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子 和增强子、T7启动子、牛生长激素(BGH)多腺苷酸信号、猿猴空泡病毒40 (SV40)早期启动 子、猿猴空泡病毒40 (SV40)复制起点和pUC载体复制起点，特别是具有在转染细胞中以载 体附加体这一染色体外形式复制的能力，可以随宿主细胞的分裂传递给新生的子代细胞，保证目的基因稳定表达，同时，该载体含有氨苄青霉素抗性基因(AmpD，该基因中含有免疫 增强CpG DNA序列，可增强疫苗的免疫效果。2、本发明将禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因融合在一起，放在同 一个起始密码子之下，同一个开放阅读框(ORF)之中，所表达的蛋白为融合蛋白，所含抗原 表位多于单基因DNA疫苗所含的抗原表位，而且在应用的时侯可以不必考虑抗原之间的配 比问题。
具体实施例方式为书写方便，将禽霍乱外膜蛋白H基因或称禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因，简 称为omph基因。禽霍乱外膜蛋白A基因或称禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A基因，简称为ompa基 因。本发明所使用的基因序列5’-CGGGATCCAaaaaaaCagCaattgC-3，即引物①，基因序 列 5，-TAATGGATCCGAAGTGTACGCGTAAAC-3，即引物②，基因序列 5，-TGAGGTACCATGAAAAAGACA ATCGTAG-3，即引物③，基因序列 5，-CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3，即引物④ 由英俊生物技术公司(广州海珠区新港东路对四号)合成提供。本发明所使用的DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、四种双脱氧核糖核苷酸混合物、限制 性内切酶Kpn I、限制性内切酶BamH I、限制性内切酶EcoR I、限制性内切酶缓冲液、琼脂 糖粉末、真核表达载体PCDNA3. 1 (+)、DNA连接酶、DNA连接酶缓冲液、胰蛋白胨、酵母提取 物、氯化钠、琼脂粉、氨苄青霉素、葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、乙二胺四乙酸、氢氧化 钠、十二烷基磺酸钠、乙酸钾、冰醋酸、苯酚、氯仿、无水乙醇、异丙醇、氯化锂、溶菌酶、RNA酶 A、聚乙二醇、氯化镁、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钾均能在生物工程公司购买 到。本发明制备omph基因和ompa基因及融合DNA疫苗的方法包含有利用聚合酶链式 反应法获得未经酶切回收纯化的omph基因和ompa基因、未经酶切回收纯化的omph基因的 酶切回收纯化过程、真核表达载体pcDNA3. 1 (+)的酶切回收纯化、酶切回收纯化的omph基 因与酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3. 1(+)的连接和转化、pcM质粒溶液的提取、pcM 质粒溶液的酶切回收纯化过程、未经酶切回收纯化的ompa基因的酶切回收纯化过程、酶切 回收纯化的ompa基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的连接和转化以及omph基因和ompa 基因制备融合DNA疫苗共九项内容，各内容分述如下I、利用聚合酶链式反应法获得未经酶切回收纯化的omph基因和ompa基因 i )在聚合酶链式反应管a中同时加入引物①和引物②各1微升，再依次加入DNA聚 合酶0. 5微升、聚合酶缓冲液2. 5微升、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3微升、禽霍乱菌基 因组模板1微升和水16微升，再将聚合酶链式反应管a放入聚合酶链式反应扩增仪中，设 定反应温度94°C时的预变性时间为5分钟，然后再将在94°C时变性1分钟到降至55°C时 的复性1分钟以及再升温至72°C的延伸2分钟称为一个循环，将所述一个循环重复30次， 30次循环结束后在72°C时再延伸10分钟制备出未经酶切回收纯化的omph基因。ii )在聚合酶链式反应管b中同时加入引物③和引物④各1微升，再依次加入DNA 聚合酶0. 5微升、聚合酶缓冲液2. 5微升、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3微升、禽霍乱菌11基因组模板1微升和水16微升，再将聚合酶链式反应管b放入聚合酶链式反应扩增仪中， 设定反应温度94°C时的预变性时间为5分钟，然后再将在94°C时变性1分钟到降至53°C 时的复性1分钟以及再升温至72°C的延伸2分钟称为一个循环，将所述一个循环重复30 次，30次循环结束后在72°C时再延伸10分钟制备出未经酶切回收纯化的ompa基因。II、未经酶切回收纯化的omph基因的酶切回收纯化过程该酶切回收纯化过程分为如下两步第一步，取1. 5毫升的离心管a，在离心管a中依次加入未经酶切回收纯化的omph基因 20微升、限制性内切酶Kpn I 3微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性内切酶缓冲液5 微升和水19微升，将加入上述omph基因和试剂的离心管a充分混勻后放入37° C的水浴中 3小时得到混合物H ；然后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波 炉内煮沸使琼脂糖溶解，将溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶a; 将所述凝胶a放入电泳缓冲液中，将所述混合物H加入所述凝胶a中，打开电泳仪开关，设 定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物H的凝胶b。第二步用碧云天生物技术研究所提供的DNA凝胶回收试剂盒进行如下操作取1. 5毫升的离心管b并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶b上含有的混合物H切下 来(只有在紫外灯下才能看到凝胶b上含有的混合物H并便于切割)，将切下来的混合物H放 在已称重的1. 5毫升的离心管b中，称取离心管b的总重并计算出从凝胶b上切下来的混 合物H的重量(因为混合物H含有传染性剧毒)，然后将离心管b中的混合物H捣碎，加入等 体积的溶液I (该溶液I由碧云天生物技术研究所提供，等体积的含义是指若离心管b中 的混合物H为100毫克，则加入100微升的溶液I )，颠倒离心管b混勻，将离心管b放置在 50°C水浴中加热10分钟至混合物H完全融解，融解过程中颠倒离心管b 3次以加速混合物 H的融解，将融解后的混合物H加入到DNA纯化柱a上，该DNA纯化柱a已事先放置在收集 管a中，在室温下将收集管a放置1分钟，然后将收集管a放在离心机中离心1分钟，离心 机的转速设定为12000转/分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯 化柱a上加入700微升的溶液II (该溶液II由碧云天生物技术研究所提供)，在室温下将 收集管a放置1分钟，再将收集管a在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管a 内的液体，随后再向DNA纯化柱a上加入500微升的溶液II，将收集管a在12000转/分钟 下离心1分钟，离心后倒掉收集管a内的液体，将倒掉液体后的收集管a在13000转/分钟 下离心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱a并放置于1. 5毫升的离心管c中，在4次离 心后的DNA纯化柱a上加入30微升溶液III (该溶液II由碧云天生物技术研究所提供)， 将离心管c室温下放置1分钟，再将离心管c在13000转/分钟下离心1分钟，取出DNA纯 化柱a得到离心管c中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的omph基因，该步骤是 为了制备出酶切回收纯化后的omph基因；III、真核表达载体pcDNA3. 1(+)的酶切回收纯化在1. 5毫升的离心管d中依次加入真核表达载体pcDNA3. 1 (+) 10微升、限制性内切酶 Kpn I 3微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水四微升，将 加入上述载体和试剂的离心管d充分混勻后放入37° C的水浴中8小时得到混合物p，然后 称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充 分溶解，将充分溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶c，将所述凝胶12c放入电泳缓冲液中，将所述混合物P加入所述凝胶c中，打开电泳仪开关，设定电压为120 伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物ρ的凝胶d。用碧云天生物技术研究所提供的DNA凝胶回收试剂盒进行如下操作取1. 5毫升的离心管e并称其重量，在紫外灯下将凝胶d上的混合物ρ切下来(只有在 紫外灯下才能看到凝胶d上含有的混合物ρ并便于切割)，将切下来的混合物ρ放在已称重 的1. 5毫升的离心管e中，称取离心管e的总重并计算出从凝胶d上切下来的混合物ρ的 重量(因为混合物P含有传染性剧毒)，然后将离心管e中的混合物P捣碎，加入等体积的溶 液I (该溶液I由碧云天生物技术研究所提供，等体积的含义是指若离心管e中的混合物 P为100毫克，则加入100微升的溶液I)，颠倒离心管e混勻，将离心管e放置在50°C水浴 中加热10分钟至混合物ρ完全融解，融解过程中颠倒离心管e 3次以加速混合物ρ的融解， 将融解后的混合物P加入到DNA纯化柱b上，该DNA纯化柱b已事先放置在收集管b中，在 室温下将收集管b放置1分钟，然后将收集管b放在离心机中离心1分钟，离心机的转速设 定为12000转/分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，再向收集管b内的DNA纯化柱b上加 入700微升的溶液II (该溶液II由碧云天生物技术研究所提供)，在室温下将收集管b放 置1分钟，再将收集管b在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，随 后再向DNA纯化柱b上加入500微升的溶液II，将收集管b在12000转/分钟下离心1分 钟，离心后倒掉收集管b内的液体，将倒掉液体后的收集管b在13000转/分钟下离心1分 钟，取出4次离心后的DNA纯化柱b并放置于1. 5毫升的离心管f中，在4次离心后的DNA 纯化柱b上加入30微升溶液III (该溶液III由碧云天生物技术研究所提供)，将离心管f 室温下放置1分钟，再将离心管f在13000转/分钟下离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到 离心管中f的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)，该步 骤是为了制备出经过酶切并纯化后的真核表达载体PCDNA3. 1 (+)。IV、酶切回收纯化的omph基因与酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3. 1⑴的连 接和转化在1. 5毫升的离心管g中加入酶切回收纯化的omph基因10微升、酶切回收纯化的真 核表达载体pcDNA3. 1 (+) 2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5微升， 将加入上述omph基因、载体和试剂的离心管g放入16° C水浴中12小时，然后从16° C水浴 中取出离心管g并加入200微升的大肠杆菌感受态JM83，再将离心管g先放置在冰浴中30 分钟，再在42° C的水浴中放置90秒，最后在冰浴中放置3分钟，然后向离心管g中加入0. 5 毫升LB液体培养基，该LB液体培养基包含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化 钠和水。将离心管g放置在37°C的摇床内以200转/分钟的速度振荡培养1. 5小时，振荡 培养结束后从离心管g中取出100微升液体涂布于含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的 LB培养平板上，该LB培养平板上包含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、 1. 5%的琼脂粉和水。将涂布后的LB培养平板放置在37°C的培养箱内倒置培养16小时，本 步骤是为了将酶切回收纯化的omph基因与酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3. 1(+)连 接后导入到大肠杆菌感受态JM83中，并通过培养让其大量生长繁殖。V、pcM质粒溶液的提取取出培养16小时后的LB培养平板，挑取LB培养平板上生长的一个菌落，将菌落放入 含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中，该LB液体培养基包含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠和水。然后将所述的LB液体培养基放置 在37°C摇床内以200转/分钟的速度振荡培养16小时，振荡培养结束后从所述的LB液体 培养基中取出1毫升的液体并加入到1. 5毫升的离心管h中，再将离心管h在12000转/ 分钟下离心5分钟，弃掉离心管h中的上清液，然后往离心管h中的沉淀物中加入100微升 预先放置在4 °C冰箱内冷却的溶液IV，该溶液IV包含有50毫摩尔的葡萄糖、25毫摩尔的三 羟甲基氨基甲烷-盐酸、10毫摩尔的乙二胺四乙酸和水。将离心管h充分振荡混勻后加入 200微升的溶液V，该溶液V包含有10毫摩尔/升的氢氧化钠和10%的十二烷基磺酸钠；反 复颠倒离心管h 5次，将离心管h放置于冰浴中3分钟，再向离心管h中加入150微升预先 放置在4°C冰箱内冷却的溶液VI，该溶液VI包含有60%的5摩尔/升的乙酸钾、11. 5%的冰 醋酸和水。然后将离心管h放在冰浴中5分钟，从冰浴中取出离心管h后在12000转/分 钟和4°C的条件下离心10分钟，吸取离心后离心管h中的上清液，将所述上清液加入到1. 5 毫升的离心管i中，再向离心管i中加入与等量的苯酚和氯仿的混合液(该混合液中的苯酚 和氯仿也是等量的)，将离心管i振荡后在12000转/分钟和4°C的条件下离心10分钟，离 心结束后将离心管i中的上层液体移入到1. 5毫升的离心管j中，再向离心管j中加入上 层液体2倍的无水乙醇，将离心管j放置于-20°C冰箱内冷藏20分钟，然后取出离心管j放 在13000转/分钟和4°C的条件下离心10分钟，将离心管j中的上清液弃掉，再向离心管 j中的沉淀物中加入0. 5毫升浓度为70%的乙醇，在12000转/分钟和4°C的条件下对离 心管j离心5分钟，倒掉离心管j中的上清液，离心管j中的沉淀物自定义为pcM质粒，等 PcM质粒干燥后，向离心管j中加入30微升水进行溶解得到自定义为pcM质粒溶液，本步骤 是将pcM质粒从大肠杆菌感受态JM83中提取出来并溶解，为下一步实验做准备。VKpcM质粒溶液的酶切回收纯化过程在1.5毫升的离心管k中依次加入pcM质粒溶液10微升、限制性内切酶BamH I 3微 升、限制性内切酶EcoR I 3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水四微升，将加入上述物 质的离心管k充分混勻后放入37° C的水浴中8小时得到混合物M ；然后称取1. 0克琼脂糖 粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖溶解，将溶解后的琼脂糖 溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶e，将所述凝胶e放入电泳缓冲液中，将所述混 合物M加入所述凝胶e中，打开电泳仪开关，设定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟 后关闭电泳仪得到含有混合物M的凝胶f。用碧云天生物技术研究所提供的DNA凝胶回收试剂盒进行如下操作取1. 5毫升的离心管m并称其重量，在紫外灯下将凝胶f上的混合物M切下来，将切下 来的混合物M放在已称重的1. 5毫升的离心管m中，称取离心管m的总重并计算出从凝胶 f上切下来的混合物M的重量，然后将离心管m中的混合物M捣碎，加入等体积的溶液I，颠 倒离心管m混勻，将离心管m放置在50°C水浴中加热10分钟至混合物M完全融解，融解过 程中颠倒离心管m 3次以加速混合物M的融解，将融解后的混合物M加入到DNA纯化柱c 上，该DNA纯化柱c已事先放置在收集管c中，在室温下将收集管c放置1分钟，然后将收 集管c放在离心机中离心1分钟，离心机的转速设定为12000转/分钟，离心后倒掉收集管 c内的液体，再向收集管c内的DNA纯化柱c上加入700微升的溶液II，在室温下将收集管 c放置1分钟，再将收集管c在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液 体，随后再向DNA纯化柱c上加入500微升的溶液II，将收集管c在12000转/分钟下离14心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，将倒掉液体后的收集管c在13000转/分钟下离 心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱c并放置于1. 5毫升的离心管η中，在4次离心后 的DNA纯化柱c上加入30微升溶液III，将离心管η室温下放置1分钟，再将离心管η在 13000转/分钟下离心1分钟，取出DNA纯化柱c得到离心管中η的30微升液体，该液体就 是酶切回收纯化的PcM质粒溶液，本步骤是为了获得经过酶切后的纯化的pcM质粒溶液，为 后续的连接实验做准备。ΥΠ、未经酶切回收纯化的ompa基因的酶切回收纯化过程取1.5毫升的离心管0，在离心管ο中依次加I中的ii )制备出的未经酶切回收纯化 的ompa基因20微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性内切酶EcoR I 3微升、限制性 内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入有ompa基因和试剂的离心管ο充分混勻后放入 37° C的水浴中3小时得到混合物A ；然后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓 冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板 中，凝固后的固体称为凝胶g，将所述凝胶g放入电泳缓冲液中，取离心管ο中的混合物A加 入所述凝胶g中，打开电泳仪开关，设定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电 泳仪得到含有混合物A的凝胶h。用碧云天生物技术研究所提供的DNA凝胶回收试剂盒进行如下操作取1. 5毫升的离心管ρ并称其重量，在紫外灯下将凝胶h上的混合物A切下来，将切下 来的物质放在已称重的1. 5毫升的离心管ρ中，称取离心管ρ的总重并计算出从凝胶h上 切下来的混合物A的重量，然后将离心管ρ中的混合物A捣碎，加入等体积的溶液I，颠倒 离心管P混勻，将离心管P放置在50°C水浴中加热10分钟至混合物A完全融解，融解过程 需颠倒离心管P 3次以加速混合物A的融解，将融解后混合物A加入到DNA纯化柱d上，该 DNA纯化柱d已事先放置在收集管d中，在室温下将收集管d放置1分钟，然后将收集管d 放在离心机中离心1分钟，离心机的转速设定为12000转/分钟，离心后倒掉收集管d内的 液体，再向收集管d内的DNA纯化柱d上加入700微升的溶液II，在室温下将收集管d放置 1分钟，再将收集管d在12000转/分钟下离心1分钟，离心后倒掉收集管d内的液体，随后 再向DNA纯化柱d上加入500微升的溶液II，将收集管d在12000转/分钟下离心1分钟， 离心后倒掉收集管d内的液体，将倒掉液体后的收集管d在13000转/分钟下离心1分钟， 取出4次离心后的DNA纯化柱d并放置于1. 5毫升的离心管q中，在4次离心后的DNA纯 化柱d上加入30微升溶液III，将离心管q室温下放置1分钟，再将离心管q在13000转/ 分钟下离心1分钟，取出DNA纯化柱d得到离心管中q的30微升液体，该液体就是酶切回 收纯化的ompa基因，本步骤是为了获得经过酶切后的纯化的ompa基因，为后续的连接实验 做准备。通、酶切回收纯化的ompa基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的连接和转化在1. 5毫升的离心管r中加入酶切回收纯化的ompa基因10微升、酶切回收纯化的pcM 质粒溶液2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5微升，将加入有上述 ompa基因、质粒和试剂的离心管r放入16°C水浴中12小时，然后从16°C水浴中取出离心 管r并加入200微升的大肠杆菌感受态JM83，再将离心管r先放置在冰水混合液中30分 钟，再在42° C的水浴中放置90秒，最后在冰水混合液中放置3分钟，然后向离心管r中加 入0. 5毫升LB液体培养基，将离心管r放置在37°C的摇床内以200转/分钟的速度振荡培养1. 5小时，振荡培养结束后从离心管r中取出100微升液体涂布于含有浓度为50微克 /毫升氨苄青霉素的LB培养平板上，将涂布后的LB培养平板放置在37°C的培养箱内倒置 培养16小时，本步骤是为了将酶切回收纯化的ompa基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液 连接后导入到大肠杆菌感受态JM83中并通过培养让其大量生长繁殖。IX、omph基因和ompa基因制备融合DNA疫苗i )从VDI中培养16小时后的LB培养平板上挑取一个菌落，将菌落放入含有浓度为 50微克/毫升氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中，然后将所述的LB液体培养基放置在 37° C摇床内以200转/分钟的速度振荡培养16小时，振荡培养结束后从所述的LB液体培 养基中取出1毫升的液体并加入到1. 5毫升的离心管s中，再将离心管s在12000转/分 钟下离心5分钟，弃掉离心管s中的上清液，然后往离心管s中的沉淀物中加入100微升预 先放置在4°C冰箱内冷却的溶液IV，将离心管s充分振荡混勻后加入200微升的溶液V (溶 液V包含10毫摩尔/升的氢氧化钠和10%的十二烷基磺酸钠)，反复颠倒离心管s 5次，将 离心管s放置于冰浴中3分钟，再向离心管s中加入150微升预先放置在4°C冰箱内冷却的 溶液VI，然后将离心管s放在冰浴中5分钟，从冰浴中取出离心管s后在12000转/分钟和 4°C的条件下离心10分钟，吸取离心后离心管s中的上清液，将所述上清液加入到1. 5毫升 的离心管t中，再向离心管t中加入与等量的苯酚和氯仿的混合液(该混合液中的苯酚和氯 仿也是等量的)，将离心管t振荡后在12000转/分钟和4°C的条件下离心10分钟，离心结 束后将离心管t中的上层液体移入到1. 5毫升的离心管u中，再向离心管u中加入上层液 体2倍的无水乙醇，将离心管u放置于-20°C冰箱内冷藏20分钟，然后取出离心管u放在 13000转/分钟和4°C的条件下离心10分钟，将离心管u中的上清液弃掉，再向离心管u中 的沉淀物中加入0. 5毫升浓度为70%的乙醇，在12000转/分钟和4°C的条件下对离心管 u离心5分钟，倒掉离心管u中的上清液，离心管u中的沉淀物自定义为pcDNA-MA质粒，等 PcDNA-MA质粒干燥后，向离心管u中加入30微升水进行溶解得到自定义为pcDNA-MA质粒 溶液，本步骤是将pcDNA-MA质粒从大肠杆菌感受态JM83中提取出来并溶解，为下一步实验 做准备。ii )在1. 5毫升的离心管ν中依次加入pcDNA-MA质粒溶液2微升、限制性内切酶 Kpn I 1微升、限制性内切酶EcoR I 1微升、限制性内切酶缓冲液1微升和水5微升，将加 入有上述pcDNA-MA质粒和试剂的离心管ν充分混勻后放入37° C的水浴中2小时得到混合 物D ；然后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼 脂糖粉末充分溶解，将充分溶解后的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶i， 将所述凝胶i放入电泳缓冲液中，取离心管ν中的混合物D加入所述凝胶i中，打开电泳仪 开关，设定电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，将电泳后得到的含有混 合物D的凝胶j放置在凝胶成像系统中进行检测，若在含有混合物D的凝胶j中检测出大 小为2082个碱基对的基因，则证明该pcDNA-MA质粒是omph基因和ompa基因制备出的融 合DNA疫苗。有关omph基因和ompa基因制备出的融合DNA疫苗的免疫预防效果或检测等内容 参见如下含有2082个碱基对基因的pcDNA-MA质粒或称omph基因和ompa基因制备出的融合 DNA疫苗可简称为pOMPHA。
关于pOMPHA的大量制备问题本内容所挑取的菌落为上述IX中ii )获得的含有pOMPHA的大肠杆菌感受态JM83。挑取菌落接种于25毫升含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基 中，然后将所述的LB液体培养基放置在37°C的摇床中以200转/分钟的速度振荡培养至 液体在600纳米处的吸光度(0D·值)为0. 6时，将所述的LB液体培养基中的液体全部倒 入500毫升含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的新鲜的LB液体培养基中后放置于37°C 的摇床中以300转/分钟的速度振荡培养15小时，振荡培养结束后将培养所得的液体倒 入1000毫升的离心管中，再将该1000毫升的离心管在6000转/分钟和4°C的条件下离心 15分钟，弃掉1000毫升的离心管中的上清液，向1000毫升的离心管中的沉淀物中加入18 毫升的溶液IV将沉淀物悬浮起来，然后再向1000毫升的离心管中加入2毫升浓度为10毫 克/毫升的溶菌酶混勻后再加入40毫升的溶液V，反复颠倒1000毫升的离心管5次，将 1000毫升的离心管室温下放置5分钟，随后再向其中加入20毫升冰预冷的溶液VI，轻轻振 荡所述1000毫升的离心管后放置在冰浴中10分钟，从冰浴中取出1000毫升的离心管后在 12000转/分钟和4°C的条件下离心20分钟，离心结束后将1000毫升的离心管中的上清液 移入到一个200毫升的离心管中，再向所述的200毫升的离心管中加入体积为所述上清液 0. 6倍的异丙醇，混勻后将200毫升的离心管在室温下放置10分钟，然后对200毫升的离 心管在12000转/分钟的条件下离心20分钟，弃掉上清液后再向200毫升的离心管中加入 50毫升浓度为70%的乙醇，再将200毫升的离心管在12000转/分钟和4°C的条件下离心 5分钟，倒掉200毫升的离心管中的液体，等200毫升的离心管中的沉淀物干燥后向200毫 升的离心管中加入3毫升pH值为8. 0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)溶液溶解 沉淀物，沉淀物溶解后将溶液移至一个15毫升的离心管中，将15毫升的离心管放置在冰浴 中静置10分钟，随后向15毫升的离心管中加入3毫升的浓度为5摩尔/升的氯化锂溶液， 将15毫升的离心管混勻后在10000转/分钟和4°C的条件下离心10分钟，吸取15毫升的 离心管中的上清液并加入到10毫升的离心管中，向10毫升的离心管中加入等量的异丙醇， 将10毫升的离心管室温放置10分钟后在12000转/分钟的条件下离心10分钟，把10毫 升的离心管中的上清液倒掉，再向10毫升的离心管中加入5毫升浓度为70%的乙醇，将10 毫升的离心管在12000转/分钟和4°C的条件下离心5分钟，倒掉10毫升的离心管中的上 清液，等10毫升的离心管中的沉淀物干燥后，向10毫升的离心管中加入0. 5毫升含有浓度 为100微克/毫升的RNA酶A的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)溶液溶解沉淀物， 等10毫升的离心管中的沉淀物溶解后向其中加入等量的苯酚和氯仿混合液，将10毫升的 离心管振荡后在12000转/分钟和4°C的条件下离心10分钟，离心结束后将10毫升的离 心管中的上层溶液移入到5毫升的离心管中，然后向5毫升的离心管中加入所述上层液体 2倍的无水乙醇，将5毫升的离心管放置于-20°C冰箱内20分钟，然后取出5毫升的离心管 放在13000转/分钟和4°C的条件下离心10分钟，将5毫升的离心管中的上清液弃掉，等5 毫升的离心管中的沉淀物干燥后向5毫升的离心管中加入1毫升水进行溶解，然后向溶解 后的溶液中加入0. 5ml聚乙二醇-氯化镁(PEG-MgCl2)溶液，将5毫升的离心管室温放置30 分钟后在13000转/分钟的条件下离心20分钟，将5毫升的离心管中的上清液倒掉后再向 5毫升的离心管中的沉淀物中加入0. 5毫升浓度为70%的乙醇，在13000转/分钟的条件 下对5毫升的离心管离心5分钟，倒掉5毫升的离心管中的上清液，等5毫升的离心管中的17沉淀物充分干燥后再向5毫升的离心管中加入1毫升浓度为0. 01摩尔/升的磷酸盐缓冲 液，该磷酸盐缓冲液中包含有0. 8%的氯化钠、0. 02%的磷酸二氢钾、0. 02%的氯化钾、0. 29% 的十二水合磷酸氢二钠和水。溶解后的溶液就是大量制备的P0MPHA，最后用分光光度计测 定溶解液中所含的POMPHA浓度，本内容是为了大量制备pOMPHA并为随后的动物免疫实验 做准备。关于动物免疫实验问题动物免疫实验所用的实验物为鸡。取年龄为1日龄的没经过免疫的鸡40只进行饲养， 等40只鸡长到年龄为4周龄时将它们分为两组，每组20只鸡，其中的一组中所有的20只鸡 都免疫本发明制备的禽霍乱外膜蛋白H和A基因融合DNA疫苗即pOMPHA，将这一组自定义 为pOMPHA免疫组，pOMPHA免疫组中所有的20只鸡都免疫三次，第一次免疫的时间是20只 鸡的年龄为4周龄时，第二次免疫的时间是20只鸡的年龄为6周龄时，第三次免疫的时间 是20只鸡的年龄为8周龄时，每次免疫的剂量都是每只鸡200微克，每次免疫的方式都是 大腿内侧肌肉注射。另外一组的20只鸡不进行任何免疫，只是与pOMPHA免疫组中的鸡在 相同的条件下进行饲养，将这一组自定义为未免疫组，本步骤是将制备的pOMPHA免疫鸡， 同时设置不进行任何免疫的鸡作为对照，为下面的攻毒实验做准备。关于攻毒实验问题本内容的目的是为了检测本发明制备的omph基因和ompa基因融合DNA疫苗pOMPHA 能不能给被免疫的鸡提供抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力，能不能预防禽霍乱，具体操 作方法如下实验物选用40只鸡，鸡龄为10周龄，用禽多杀性巴氏杆菌CVCC474菌株对pOMPHA免 疫组和未免疫组中的所有的鸡都进行肌肉注射攻毒，攻毒时的剂量为IXlO9个禽多杀性巴 氏杆菌CVCC474/只鸡，攻毒之后对pOMPHA免疫组和未免疫组中的所有的鸡继续饲养两周 至鸡的年龄为12周龄时为止，然后记录pOMPHA免疫组的20鸡和未免疫组的20鸡在年龄 为12周龄时仍然存活的数量并计算出pOMPHA免疫组和未免疫组的保护率，保护率越高说 明免疫预防效果越好，POMPHA免疫组的保护率的计算方法如下[pOMPHA免疫组的鸡在年龄为12周龄时仍然存活的数量+20X 100% 未免疫组的保护率的计算方法如下未免疫组的鸡在年龄为12周龄时仍然存活的数量+20X 100% 结果如表1所示，在12周龄时pOMPHA免疫组的鸡仍然有15只存活，pOMPHA免疫组的 保护率为75%，未免疫组的鸡在12周龄时已经全部死亡，未免疫组的保护率为0%。上述结果表明利用本发明制备出的omph基因和ompa基因融合DNA疫苗pOMPHA 给鸡进行三次免疫之后能使被免疫鸡有效地预防禽多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱。表1是12周龄时仍存活的鸡的数量及保护率
权利要求
1. 一种制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，该方法中将 基因序列5，-CGGGATCCAaaaaaacagcaattgc-3，自定义为引物①； 基因序列 5，-TAATGGATCCGAAGTGTACGCGTAAAC-3，自定义为引物②； 基因序列 5，-TGAGGTACCATGAAAAAGACAATCGTAG-3，自定义为引物③； 基因序列 5’ -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3，自定义为引物④； 其特征是该方法包含如下内容I、利用聚合酶链式反应法获得未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱 外膜蛋白A基因i )在聚合酶链式反应管a中同时加入引物①和引物②各1微升，再依次加入DNA聚 合酶0. 5微升、聚合酶缓冲液2. 5微升、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3微升、禽霍乱菌基 因组模板1微升和水16微升，再将聚合酶链式反应管a放入聚合酶链式反应扩增仪中，设 定反应温度94°C时的预变性时间为5分钟，然后再将在94°C时变性1分钟到降至55°C时 的复性1分钟以及再升温至72°C的延伸2分钟称为一个循环，将所述一个循环重复30次， 30次循环结束后在72°C时再延伸10分钟制备出未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基 因； )在聚合酶链式反应管b中同时加入引物③和引物④各1微升，其余过程同i )，在 该过程中将所述一个循环中的“55°C”变为“53°C”，将“聚合酶链式反应管a”替换为“聚合 酶链式反应管b”即可制备出未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因；II、未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因的酶切回收纯化过程 该酶切回收纯化过程分为如下两步第一步，取1. 5毫升的离心管a，在离心管a中依次加入未经酶切回收纯化的禽霍乱外 膜蛋白H基因20微升、限制性内切酶Kpn I 3微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性 内切酶缓冲液5微升和水19微升，将加入有上述H基因和试剂的离心管a充分混勻后放 入37° C的水浴中3小时得到混合物H ；然后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳 缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板 中，凝固后的固体称为凝胶a ；将所述凝胶a放入电泳缓冲液中，将所述混合物H加入到所 述凝胶a中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电 泳仪得到凝胶b;第二步，取1. 5毫升的离心管b并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶b上的混合物H切 下来，将切下来的混合物H放在已称重的1. 5毫升的离心管b中，称取离心管b的总重并计 算出切下来的混合物H的重量，然后将离心管b中切下来的混合物H捣碎，在离心管b中加 入等体积的溶液I，颠倒离心管b混勻，将离心管b放置在50°C水浴中加热10分钟至混合 物H完全融解，融解过程需颠倒离心管b数次以加速混合物H的融解，将融解后的混合物H 倒入DNA纯化柱a上，该DNA纯化柱a已事先放置在收集管a中，在室温下将收集管a放置 1分钟，然后将收集管a放在离心机中离心1分钟，设定离心机的转速为12000转/分钟，离 心后倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a上加入700微升的溶液II， 在室温下将收集管a放置1分钟，再将收集管a在12000转/分钟的转速下离心1分钟，离 心后倒掉收集管a内的液体，随后再向DNA纯化柱a上加入500微升的溶液II，将收集管a 在12000转/分钟的转速下离心1分钟，再次倒掉收集管a内的液体并在13000转/分钟的转速下离心1分钟，取出4次离心后的DNA纯化柱a并放置于1. 5毫升的离心管c中，在 离心管c的DNA纯化柱a上加入30微升溶液III，将离心管c室温下放置1分钟，再将离心 管c在13000转/分钟的转速下离心1分钟，取出DNA纯化柱a得到离心管c中的30微升 液体，该液体就是酶切回收纯化后的禽霍乱外膜蛋白H基因；III、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切回收纯化过程在1. 5毫升的离心管d中依次加入真核表达载体pcDNA3. 1 (+) 10微升、限制性内切酶 Kpn I 3微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水四微升，将 加入有上述载体和试剂的离心管d充分混勻后放入37° C的水浴中8小时得到混合物ρ ；然 后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末 充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶c ；将所述凝胶 c放入电泳缓冲液中，将所述混合物P加入到所述凝胶c中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压 为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶d ；然后重复上述II中的第二 步并将其中的离心管b替换成离心管e、凝胶b替换成凝胶d、混合物H替换成混合物P、 DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱b、收集管a替换成收集管b、离心管c替换成离心管f即可得 到离心管f中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的真核表达载体pcDNA3. 1(+)；IV、酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因与酶切回收纯化的真核表达载体 pcDNA3. 1⑴的连接和转化连接在1. 5毫升的离心管g中加入酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白H基因10微升、 酶切回收纯化的真核表达载体pcDNA3. 1(+) 2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2 微升和水5微升，将加入有上述H基因、载体和试剂的离心管g放入16°C水浴中12小时；转化从16° C水浴中取出离心管g并加入200微升的大肠杆菌感受态JM83，再将离心 管g先放置在冰浴中30分钟，再在42° C的水浴中放置90秒，最后在冰浴中放置3分钟，然 后向离心管g中加入0. 5毫升LB液体培养基，将离心管g放置在37° C的摇床内以200转/ 分钟的速度振荡培养1. 5小时，振荡培养结束后从离心管g中取出100微升的液体并涂布 于含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养平板上，将涂布后的LB培养平板放置在 37°C的培养箱内倒置培养16小时；V、pcM质粒溶液的提取取出培养16小时后的LB培养平板，挑取LB培养平板上生长的其中一个菌落，将该菌 落放入含有浓度为50微克/毫升氨苄青霉素的5毫升LB液体培养基中，然后将所述的LB 液体培养基放置在37°C摇床内以200转/分钟的速度振荡培养16小时，振荡培养结束后 从所述的LB液体培养基中取出1毫升的液体并加入到1. 5毫升的离心管h中，再将离心管 h在12000转/分钟的转速下离心5分钟，弃掉离心管h中的上清液，然后往离心管h中的 沉淀物中加入100微升预先放置在4°C冰箱内冷却的溶液IV，将离心管h充分振荡混勻后 加入200微升的溶液V，反复颠倒离心管h数次，将离心管h放置于冰浴中3分钟，再向离 心管h中加入150微升预先放置在4°C冰箱内冷却的溶液VI，然后将离心管h放在冰浴中5 分钟，从冰浴中取出离心管h后在12000转/分钟的转速下和4°C的条件下离心10分钟，吸 取离心后离心管h中的上清液，将所述上清液加入到1. 5毫升的离心管i中，再向离心管i 中加入等量的苯酚和氯仿的混合液，将离心管i振荡后在12000转/分钟的转速下和4°C的 条件下离心10分钟，离心结束后将离心管i中的上层液体移入到1. 5毫升的离心管j中，再向离心管j中加入上层液体2倍的无水乙醇，将离心管j放置于-20°C冰箱内冷藏20分 钟，然后取出离心管j放在13000转/分钟的转速下和4°C的条件下离心10分钟，将离心管 j中的上清液弃掉，再向离心管j中的沉淀物中加入0. 5毫升浓度为70%的乙醇，在12000 转/分钟的转速下和4°C的条件下对离心管j离心5分钟，倒掉离心管j中的上清液，离心 管j中的沉淀物自定义为PcM质粒，待pcM质粒干燥后，向离心管j中加入30微升的水进 行充分溶解得到自定义为PcM质粒溶液； VI、pcM质粒溶液的酶切回收纯化过程在1. 5毫升的离心管k中依次加入pcM质粒溶液10微升、限制性内切酶BamH I 3微 升、限制性内切酶EcoR I 3微升、限制性内切酶缓冲液5微升和水四微升，将加入有上述 PcM质粒和试剂的离心管k充分混勻后放入37°C的水浴中8小时得到混合物M ；然后称取 1.0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶 解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶e ；将所述凝胶e放入 电泳缓冲液中，将所述混合物M加入到所述凝胶e中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120 伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到凝胶f ；然后重复上述II中的第二步并将 其中的离心管b替换成离心管m、凝胶b替换成凝胶f、混合物H替换成混合物M、DNA纯化 柱a替换成DNA纯化柱C、收集管a替换成收集管C、离心管c替换成离心管η即可得到离 心管η中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化后的pcM质粒溶液； 通、未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因的酶切回收纯化过程 取1. 5毫升的离心管0，在离心管ο中依次加入未经酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A 基因20微升、限制性内切酶BamH I 3微升、限制性内切酶EcoR I 3微升、限制性内切酶缓 冲液5微升和水19微升，将加入有上述A基因和试剂的离心管ο充分混勻后放入37° C的 水浴中3小时得到混合物A ；然后称取1. 0克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中 并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固 后的固体称为凝胶g ；将所述凝胶g放入电泳缓冲液中，将所述混合物A加入到所述凝胶g 中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到 凝胶h ；然后重复上述II中的第二步并将其中的离心管b替换成离心管ρ、凝胶b替换成凝 胶h、混合物H替换成混合物A、DNA纯化柱a替换成DNA纯化柱d、收集管a替换成收集管 d、离心管c替换成离心管q即可得到离心管q中的30微升液体，该液体就是酶切回收纯化 后的禽霍乱外膜蛋白A基因；通、酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的连接和转化连接在1. 5毫升的离心管r中加入酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋白A基因10微升、 酶切回收纯化的PcM质粒溶液2微升、DNA连接酶1微升、DNA连接酶缓冲液2微升和水5 微升，将加入有上述A基因、质粒和试剂的离心管r放入16°C水浴中12小时完成连接；转化重复上述IV并将离心管g替换成离心管r即完成酶切回收纯化的禽霍乱外膜蛋 白A基因与酶切回收纯化的pcM质粒溶液的转化；IX、禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因制备融合DNA疫苗 i )取出上述VDI中经转化培养16小时的LB培养平板，重复上述V的内容并将其中的 离心管h替换成离心管S、离心管i替换成离心管t、离心管j替换成离心管U，离心管U中的沉淀物自定义为pcDNA-MA质粒，待pcDNA-MA质粒干燥后，向离心管u中加入30微升的 水进行充分溶解得到自定义为pcDNA-MA质粒溶液；ii )在1. 5毫升的离心管ν中依次加入pcDNA-MA质粒溶液2微升、限制性内切酶 Kpn I 1微升、限制性内切酶EcoR I 1微升、限制性内切酶缓冲液1微升和水5微升，将加 入有上述pcDNA-MA质粒和试剂的离心管ν充分混勻后放入37° C的水浴中2小时得到混合 物D ；然后称取1. O克琼脂糖粉末加入到100毫升的电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼 脂糖粉末充分溶解，将充分溶解的琼脂糖溶液倒入制胶板中，凝固后的固体称为凝胶i ；将 所述凝胶i放入电泳缓冲液中，将所述混合物D加入到所述凝胶i中，打开电泳仪开关，在 电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪得到含有混合物D的凝胶j ； 将所述凝胶j放在凝胶成像系统中进行检测，若检测出凝胶j含有大小为2082个碱基对的 基因时，则证明该pcDNA-MA质粒是由禽霍乱外膜蛋白H基因和禽霍乱外膜蛋白A基因所制 备出的融合DNA疫苗。
2.如权利要求1所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，其特征 是LB液体培养基包含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠和水。
3.如权利要求1所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，其特征 是LB培养平板上包含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1. 5%的琼脂粉 和水。
4.如权利要求1所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，其特征 是溶液IV包含有50毫摩尔的葡萄糖、25毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10毫摩尔的 乙二胺四乙酸和水。
5.如权利要求1所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，其特征 是溶液V包含有10毫摩尔/升的氢氧化钠和10%的十二烷基磺酸钠。
6.如权利要求1所述制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法，其特征 是溶液VI包含有60%的5摩尔/升的乙酸钾、11. 5%的冰醋酸和水。
全文摘要
一种制备禽霍乱外膜蛋白H和A基因及融合DNA疫苗的方法包括利用聚合酶链式反应法获得禽霍乱外膜蛋白H和A基因、禽霍乱外膜蛋白H基因的酶切回收纯化、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切回收纯化、纯化后的连接和转化、pcM质粒溶液提取、pcM质粒溶液的酶切回收纯化过程、禽霍乱外膜蛋白A基因的酶切回收纯化、A基因与pcM质粒溶液的连接和转化以及H和A基因制备融合DNA疫苗共九项内容。经动物实验检测表明，本发明的方法所制备出的融合DNA疫苗可有效地为被免疫的鸡提供抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力，保护率可达75%，能够有效预防禽多杀性巴氏杆菌引起的禽霍乱。
文档编号A61K39/102GK102038960SQ20101053018
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者刘开永, 孙军杰, 孙晓菲, 宫强, 曲宁, 李洋, 牛明福, 王帅涛, 程茗 申请人:河南科技大学