专利名称：不对称性梯度电场电泳槽及电泳方法
技术领域：
本发明是一种分离生物大分子物质的凝胶电泳槽及电泳方法，属于生物技术的大分子分离与分析技术领域。
凝胶电泳是分离与分析蛋白质、核酸等生物大分子物质的常用技术。凝胶电泳装置由电泳槽和为之提供电源的电泳仪两部分(同时工作)组成。现有的稳直流电泳槽(水平电泳槽、垂直电泳槽等)都是在一对正、负电极(通常为一对平行的白金丝电极)之间的正中位置设定凝胶支承架(板状或管状)，电泳时，样品在正、负电极之间居中放置的近全部长度的凝胶中进行分离。根据均匀长直导线的电场分布和叠加原理，在这种位于电极对中央位置的凝胶中，电场强度以两电极之间电泳中线处(与正极和负极的有效电泳距离相等)最弱，由该中线向两电极方向逐渐增强，呈对称性梯度分布。因此，在现有的对称性梯度电场电泳槽中，当样品加到凝胶靠近电极(通常为负极)一端，向凝胶另一端进行稳流或稳压电泳时，电泳图谱纵向表现为三段性首先在凝胶的加样一侧，电泳谱带浓重；而在凝胶的中间区域，电泳谱带密集、且多数粘连为弥散状；在凝胶的另一侧，电泳谱带较分散，但单条谱带较宽。随着凝胶长度的增加和电泳时间的相应延长，上述问题更加明显。从而限制了凝胶电泳的分离效果和分辨力。产生这一问题的症结在于电泳过程中，首先由于样品生物大分子物质的电荷效应和凝胶对样品的分子筛效应，较小的、电荷量大的分子泳动快；与此同时，在从样品槽至两极间电泳中线这半段凝胶中，全部样品分子沿着电场强度逐渐减弱的梯度减速泳动，由于较小的分子先进入较低电场强度的凝胶区域，因而首先减速；电荷量越大，减速的幅度也越大；其后较大的分子则仍以较快速度泳动。结果，具有不同分子特性(分子量、分子形状、电荷等)、趋向分开的各种邻近生物大分子谱带又相互靠近。典型的情况是，分子特性相近的两种或多种大分子，在向电泳中线泳动的过程中粘连为单条谱带或弥散带。因此，在前半段凝胶中，梯度减弱的电场强度大大削弱了凝胶分子筛效应等对样品生物大分子物质的分离效果。另一方面，在这半段凝胶中，单条谱带沿着电场强度逐渐减弱的梯度，也得到不同程度的浓集，因而分子特性相差很大、未粘连的谱带，则呈现较清晰的窄带。越过电泳中线以后，生物大分子又沿着电场强度逐渐增强的梯度加速分离，使相邻大分子的泳动速度不断增加差距，在后半段凝胶中，梯度增强的电荷效应显著提高凝胶分子筛效应对样品的分离效果。但由于这半段凝胶的长度不足以使具有微小差异的大分子完全分离，特别是越过电泳中线距离较短(即位于凝胶中间区域电泳中线附近)的多分子条带，仍形成多种分子若即若离的弥散带形。增加凝胶长度并延长电泳时间，一方面可增加谱带间的电泳距离，但另一方面，由于电泳过程中电阻和产热量也相应增加，因而单条谱带的纵向扩散距离增大，带形更加弥散；而且，增加凝胶长度还导致电场梯度增强，使前半段凝胶的分离效果进一步削弱。更大的问题还在于，分子特性相近又没有越过电泳中线、最终位于前半段凝胶中的生物大分子，始终粘连在单条谱带或弥散带中得不到分离。
本发明的目的，就是针对现有电泳槽及电泳方法固有的理论缺陷，创造一类利用不对称性电场强度梯度分离和分析生物大分子物质的凝胶电泳槽和电泳方法，以显著提高凝胶电泳的分离效果和分辨力。
本发明的不对称性梯度电场电泳槽和电泳方法，包括水平电泳槽和垂直电泳槽及相应的电泳方法。其技术特征在于①每一组样品的分离凝胶及该凝胶的支承架(2)，位于正、负电极(1)之间电泳中线(3)一侧的半电场(即不对称性梯度电场)中。②符合上述技术特征①所述的电泳槽，其正、负电极之间的有效电泳距离增加一倍于现有相应电泳槽的凝胶支承架的长度(10～20cm)。③符合上述技术特征①和②所述的单不对称性梯度电场电泳槽和电泳方法，使具有单排样品槽的凝胶一端位于电泳中线附近，凝胶另一端则与电极(通常为正极)靠近，一组样品在电场强度梯度增强的凝胶中电泳。④符合上述技术特征①和②所述的双不对称性梯度电场水平板电泳槽和电泳方法，将具有双排样品槽的水平凝胶及其支承架(2)(板状)，设置于正、负电极之间的居中位置、并相应地增加一倍于单排样品槽凝胶支承架的长度(10～20cm)；两组样品梳插槽分别定位在水平制胶架(与凝胶支承架相匹配)的一端部和中间线附近；电泳时，凝胶具样品槽(4)的一端与一电极(1)(通常为负极)靠近、凝胶上另一样品槽(4)相应地位于电泳中线(3)附近，两组样品分别在电场强度梯度增强和梯度减弱的半长水平凝胶中，同时进行相同方向(5)的电泳。⑤符合上述技术特征①和②所述的双不对称性梯度电场垂直板电泳槽，其上、下电极缓冲液槽的直视平面图为近等大小的长方形，上槽(6)略小于下槽(7)，两根白金丝直线电极(1)分别位于上、下槽内与槽宽度平行的各一底侧，双垂直的凝胶支承架(2)的高度与上槽的长度近等(约20cm)。电泳时，加在两块垂直板凝胶上端的两组样品，分别在电场强度梯度增强和梯度减弱的双垂直凝胶中同时自上而下地进行异型比照电泳。
应用本发明的单不对称性梯度电场电泳槽和电泳方法，阴离子(或阳离子)样品在从电泳中线附近的样品槽向正极(或负极)端的近全长凝胶中分离，产生的有益效果表现为(1)由于该电泳槽和电泳方法产生梯度增加的电荷效应，显著地增强凝胶分子筛效应的分离效果，因而对于样品中分子特性相近、现有电泳技术不易于或不能分离的生物大分子，可有效地分开；(2)样品中各种生物大分子在凝胶中匀加速分离，因而谱带均匀地分散于全长凝胶中，分辨力显著提高；(3)结合SDS变性凝胶电泳所测定的样品生物大分子的分子量，与该分子的迁移距离成线性关系，从而避免了现有电泳方法必须进行对数转换并绘制标准分子量曲线的复杂程序，显著提高测定的准确性，并降低对标准物复杂性的要求；(4)随着凝胶长度的适当增加，电场梯度相应增强，使电泳谱带的分散度增加、分离的分子范围扩大，从而进一步提高分离效果；(5)对于一定的样品生物大分子混合物，使之有效分离所需的凝胶长度和电泳时间均比现有技术缩短，从而降低成本并提高工作效率。
应用本发明的双不对称性梯度电场电泳槽和电泳方法，将样品分别加在凝胶靠电极端的样品槽和电泳中线附近的样品槽中，可同时在电场强度梯度增加和梯度减弱的凝胶中分别进行异型电泳。除产生上述有益效果外，在电场强度梯度减弱的凝胶中，样品中分子特性相差大、不粘连的大分子条带得到不同程度的浓集，使这类条带的清晰度和检测灵敏度增加。因而通过对相同样品在异型电场中电泳图谱的比照分析，可增加信息量。
图1是本发明的双不对称性梯度电场水平板电泳槽主要结构部位和电泳方法示意图，其中有一对白金丝电极(1)、凝胶支承架(2)、电泳中线(3)和样品槽(4)的相对位置及电泳方向(5)。图2是本发明的双不对称性梯度电场垂直板电泳槽的主要结构示意图，其中还有电极缓冲液上槽(6)和下槽(7)。
本发明的具体实施方案如下在一内框长44cm、宽14cm、高8cm的长方形有机玻璃槽内底部两端，分别固定一根长度大于14cm、直径为0.2mm的白金丝直线电极，并引入槽外与电极插孔连接；在槽内底部距一端2cm至22cm之间，固定一长20cm、宽14cm、高4cm的中空(便于水循环冷却)的凝胶支承架，并制作与之相匹配的可活动的水平制胶架(底面积接近20×14cm2)和多齿样品梳；在制胶架上距一端1cm处，设定样品梳插槽。即制成单不对称性梯度电场水平板电泳槽。电泳前，先在预置好样品梳的水平制胶架中灌制长度为20cm、宽近14cm、厚度为3mm的凝胶板，待凝胶充分凝固后，去样品梳，使样品槽所在的凝胶位置靠近电极间电泳中线、凝胶另一端靠近正电极；在电泳槽中加适宜的碱性电极缓冲液至刚好浸没凝胶水平面；连接电极线；加样后接通电源，进行稳流或稳压电泳。即获得本发明的单不对称性梯度电场电泳槽及电泳方法的有益效果。
将上述电泳槽加长为46cm，凝胶支承架(2)改造为长40cm、高5cm、距槽两端均为3cm(即位于槽中间)，并制作与之匹配、可活动的水平制胶架(底面积接近40×14cm2)和两组同型多齿样品梳；在制胶架上距一端1cm和21cm处，分别设定两组样品梳插槽。即制成双不对称性梯度电场水平电泳槽。制胶时，先在预置好两组样品梳的水平制胶架中灌制长度为40cm的板状凝胶；电泳时，使凝胶上距一端1cm的样品槽(4)位于负电极一侧，则另一样品槽(4)位于距电泳中线(3)1cm处。相同的两组样品分别在电场强度梯度增强和梯度减弱的半长凝胶中进行同一方向(5)的水平电泳，可获得本发明的全部有益效果。
双不对称性梯度电场垂直板电泳槽，其上、下电极缓冲液槽的直视平面图为近等大小的长方形，上槽(6)略小于下槽(7)，上槽外框为20cm×18cm×3cm，其中在上槽两端的18cm×3cm端框上缘中央，设置16cm×2cm的凹缺；下槽内框为22cm×20cm×4cm。两根白金丝电极(1)分别位于上、下槽内与槽宽度平行的各一侧；双垂直的凝胶支承架(2)(板状)平面的高度(含上槽端框的2cm凹缺深度)为21cm。其制胶架和样品梳结构、制胶和加样方法均类似现有技术，采用不连续凝胶电泳系统(含浓缩胶3cm和分离胶)。电泳时，位于两块垂直板凝胶上端样品槽中的两组阴离子(或阳离子)样品，由负极(或正极)向正极(或负极)方向，分别在电场强度梯度增强和梯度减弱的双垂直凝胶中同时自上而下地进行异型电泳。可获得本发明的全部有益效果。
权利要求
1.一种分离与分析生物大分子物质的稳直流电泳槽和电泳方法，其特征在于每一组样品的分离胶及该凝胶的支承架(2)，位于正、负电极(1)之间电泳中线(3)一侧的半电场即不对称性梯度电场中。
2.根据权利要求1所述的电泳槽和电泳方法，其特征在于正、负电极间的电泳距离增加一倍于现有电泳槽凝胶支承架的长度(10～20cm)。
3.根据权利要求1和2所述的单不对称性梯度电场电泳槽和电泳方法，包括水平电泳槽和垂直电泳槽及相应的电泳方法，其特征在于具有单排样品槽(4)的凝胶一端位于电泳中线附近，凝胶另一端与电极(通常为正极)靠近；一组样品在电场强度梯度增强的凝胶中电泳分离。
4.根据权利要求1和2所述的双不对称性梯度电场水平板凝胶电泳槽和电泳方法，其特征在于具有双排样品槽的水平板凝胶及其支承架(2)，设置于正、负电极(1)之间的居中位置，并增加一倍于单排样品槽凝胶支承架的长度(10-20cm)，两组样品梳的插槽分别定位在水平制胶架(与凝胶支承架相匹配)的一端部和中间线附近；电泳时，凝胶端部的样品槽(4)与一电极靠近、凝胶上另一样品槽(4)则位于电极间电泳中线(3)附近，两组样品分别在电场强度梯度增强和梯度减弱的半长凝胶中同时进行水平方向地电泳。
5.根据权利要求1和2所述的双不对称性梯度电场垂直板凝胶电泳槽和电泳方法，其特征在于上、下电极缓冲液槽的直视平面图为近等大小的长方形，上槽(6)略小于下槽(7)，两根白金丝电极(1)分别位于上、下槽内与槽宽度平行的各一底侧，双垂直的凝胶支承架(2)的高度与上槽的长度近等；电泳时，位于两块垂直板凝胶上端的两组样品，分别在电场强度梯度增强和梯度减弱的双垂直凝胶中同时自上而下地电泳。
全文摘要
本发明是一种不对称性梯度电场电泳槽及电泳方法,属于生物技术的大分子分离与分析技术领域。该电泳槽中,具有单排样品槽的凝胶及其支承架偏一电极设置,使凝胶具样品槽的一端位于电泳中线附近、另一端与电极靠近。一组样品在电荷效应梯度增强的凝胶中电泳,可显著提高分离效果和生物大分子条带的分辨力。具有双排样品槽的凝胶及其支承架,设置于电极间居中位置,两组样品分别在电荷效应梯度增强和梯度减弱的凝胶中同时进行比照电泳。
文档编号G01N27/447GK1191310SQ9611705
公开日1998年8月26日 申请日期1996年8月8日 优先权日1996年8月8日
发明者方继朝 申请人:江苏省农业科学院