毒害艾美耳球虫配子体抗原Engam59基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及毒害艾美耳球虫的配子体抗原基因，由所述基因 编码的多肽，含有所述基因的载体以及所述基因的获取方法和多肽的体外表达方法以及功 能鉴定。具体地，本发明的基因来自于鸡毒害艾美耳球虫有性生殖阶段的配子体。
【背景技术】
[0002] 鸡球虫病是由艾美耳属的一种或数种球虫寄生在鸡小肠或盲肠黏膜内引起的严 重危害养鸡业的原虫病，估计每年全球因球虫病的损失为30亿美元。我国每年仅抗球虫药 的年消费就约6?18亿元人民币，由鸡球虫病造成的直接和间接经济损失则难以估计。长 期以来，鸡球虫病的防治主要依赖药物。但由于球虫对药物普遍产生了耐药性，引起药效下 降。而且在鸡饲养周期中长期添加药物还导致药物残留肉蛋，直接危害人类健康，并污染环 境。为此，鸡球虫病的防治方法由化学预防转向了免疫预防。
[0003] 目前，临床上用于免疫预防鸡球虫病的疫苗有活虫苗和由天然蛋白组成的亚单位 疫苗两大类。虽然鸡球虫病活疫苗有着较强的免疫效果，但存在着如扩散病原的风险、球虫 虫株的抗原变异、致弱虫株毒力易返强、疫苗接种剂量难以控制、疫苗影响饲料报酬、生产 成本高、免疫程序繁琐、操作和免疫后的监测和管理技术要求高等一些突出的问题。
[0004] 商品化的鸡球虫病亚单位疫苗是由来源于巨型艾美耳球虫配子体的三种纯化抗 原(分子质量分别为230、82、56 kDa)配制而成，用于干扰卵囊壁的形成，即阻断艾美耳球虫 的有性生殖阶段，从而降低卵囊的产生与传播。由于该类疫苗的抗原需从配子体蛋白中经 亲和柱分离纯化，配子体又需从感染鸡体的肠道上皮细胞中分离纯化，因此生产工艺复杂， 成本高，难易满足生产需求。而利用基因工程技术大量生产该类抗原，可能是解决这一问题 的最佳策略。但巨型艾美耳球虫配子体抗原Emga?似和Em 基因已受到专利保护，而 且在不同鸡球虫种类间缺乏完全的交叉保护力。
[0005] 毒害艾美耳球虫是鸡球虫病的重要病原之一，主要发生在60日龄以上的鸡。由于 在鸡球虫不同种间缺乏交叉保护性，毒害与柔嫩和巨型艾美耳球虫在寄生部位的竞争性， 以及毒害艾美耳球虫繁殖力低等原因，因此在育雏阶段用疫苗免疫预防，往往不能控制鸡 饲养后期由毒害艾美耳球虫引发的球虫病。从毒害艾美耳球虫配子体克隆配子体抗原基 因，构建原核表达载体表达重组抗原。用毒害艾美耳球重组配子体抗原或用毒害艾美耳球 虫配子体抗原基因构建的核酸疫苗免疫饲养后期的鸡，针对性地防治毒害艾美耳球虫引发 的球虫病。
[0006] 迄今为止，文献报道的毒害艾美耳球虫配子体抗原基因仅见En基因，并已 受专利保护。除了 基因外，在国内外还没有其他毒害艾美耳球虫配子体抗原基因 序列及其重组表达的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明利用基因工程技术，克隆毒害艾美耳球虫配子体抗原基因选取 编码酪氨酸-丝氨酸和脯氨酸和甲硫氨酸特殊性结构域并富含抗原表位的基因片段(第 631-1296位核苷酸)，转入工程菌进行表达，获得大量的重组抗原，并对重组抗原的特异性、 免疫原性等进行深入研究，旨为研制鸡球虫重组配子体抗原疫苗奠定基础。
[0008] 本发明涉及毒害艾美耳球虫的一种配子体抗原基因，其中，所述的基因全长为 1473 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。： 其中包含的开放阅读框大小为1473 bp，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 选取第211-432位氨基酸片段进行原核表达。
[0009] 本发明涉及到一种表达载体pET28a(+)，其含有所述配子体抗原基因。将分离得 到的配子体抗原基因插入酶切位点，连接到原核表达载体pET28a(+)中，常规转化肠杆菌 BL21 (DE3 )，构建基因工程菌，并诱导表达，对表达产物进行分离、纯化和复性。
[0010] 此外，本发明涉及一种真核表达载体pcDNA3. 1 (+)，其含有所述配子体抗原基 因。将分离得到的En济皿5?因片段插入酶切位点，连接到pcDNA3.1(+)中，构建成 pcDNA3. 1(+)- En济皿^真核重组质粒，免疫小鼠获得多克隆抗体；以此鼠多抗为一抗，以原 核表达的重组蛋白为抗原进行Western-blot检测，鉴定真核质粒的免疫原性。 [0011] 作为优选的方案，具体操作是： 1)从毒害艾美耳球虫配子体基因中分离因： 常规方法分离纯化毒害艾美耳球虫配子体，用RNA提取试剂盒提取总RNA。设计特异性 引物： 上游引物：5' - ATGACTCGTCTCGCCGCCTGCGCTG -3'（ SEQ ID NO. 3); 下游引物：5' - TTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCC -3'（ SEQ ID N0.4);。
[0012] 以配子体总RNA反转录得到的CDNA为模板，经过PCR条件的反复优化后，成功 扩增出与预期结果相符且大小为1473 bp左右的特异性片段（图1)，命名为En济皿5^。 将含有目的片段PCR产物经试剂盒纯化回收后，克隆到pGEM-T-easy载体中，得到 pGEM-T-easy-En^'續级
[0013] 2)原核表达载体的构建 根据毒害艾美耳球虫En济皿5?因的ORF序列和质粒pET28a(+)酶切位点，选取编码 第211-432位氨基酸的基因片段，设计1对特异性引物： 上游引物F:5'_ CCGGAATTCGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3'，（ SEQ ID NO. 5);含feoR I 酶切位点(划线部分）和3个保护性碱基； 下游引物R:5'_ CCGAAGCTTTTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3'，（ SEQ ID NO. 6);含历·α!ΙΙΙ 酶切位点(划线部分)、终止密码子(黑体部分）和3个保护性碱基。
[0014] 以构建的pGEM-T-eaSy-En^^ffl?体为模板，成功扩增出与预期结果相符且大小 为687bp左右的特异性片段（图2)，并将此片段连接到原核表达载体pET28a(+)中，得到 pET28a (+) -Engam59〇
[0015] 3)毒害艾美耳球虫En济皿5?因的高效表达，纯化，复性 将构建好的原核表达载体pET28a (+) -En济皿5^化BL21宿主菌，IPTG诱导表达后，经 过可溶性分析，发现此体外重组表达的蛋白以包涵体形式存在（图3)。重组蛋白的大量表 达时，超生裂解释放包涵体后，尿素变性。变性蛋白通过含有HIS标签的Ni-NTA亲和层析 纯化后，分别在含有6M、4M、2M、IM尿素的透析液和不含尿素的PBS中各复性8h，最终通过 PEG8000浓缩，收集蛋白，12% SDS-PAGE分析（图4)，4° C保存。
[0016] 4)体外重组表达蛋白的特异性和免疫原性检测 分别以抗HIS的单克隆抗体（图5)、鼠抗En济皿5·游]多克隆抗体（图6)和毒害艾美耳球 虫卵囊三次免疫后鸡的康复血清（图7)为一抗，采用Western-blot方法检测重组蛋白的特 异性和免疫原性。
[0017] 本发明还公开了所述因在构建防治鸡毒害艾美耳球虫核酸疫苗中的 应用。
[0018] 所述核酸疫苗的构建如下： 根据En济皿5?因序列和PCDNA3. 1 (+)的特性，设计1对特异性引物： 上游引物 Fl :5'_ CCGAAGCTTGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3'（ SEQ ID NO. 7)，，含 III酶切位点(划线部分）和3个保护性碱基； 下游引物 Rl :5'_ CCGGAATTCTTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3'（ SEQ ID NO. 8)，，含 feoR I酶切位点(划线部分)、终止密码子(黑体部分）和3个保护性碱基。
[0019] 以构建的为模板，成功扩增得到与预期结果相符大 小为687bp左右的特异性片段（图8)，并将该目的片段连接到质粒pcDNA3. 1(+)中，得到 pcDNA3. I (+) -Engam59〇
[0020] 将构建的重组质粒pcDNA3. 进行feoR I和班《1 III双酶切鉴定（图9)， 选择阳性克隆株测序，确定阅读框正确后大量克隆用于后续试验。
[0021] 核酸疫苗的免疫原性分析： 鼠抗重组质粒PCDNA3. I (+) -En济皿5^克隆抗体的制备：取6~8周龄BALB/c雌 鼠6只，肌肉注射0. 75%利多卡因50 μ 1/只辅助扩散，24h后在相同部位注射重组质粒 pcDNA3. I (+)你100 μ g/只。此后第2周第3周各加强免疫一次，操作与剂量不变。 3次免疫后第10天摘眼球取血，37° C静置30min，4° C静置4h，2500rpm离心15min，收集 分离血清。以此血清为一抗，采用Western-blot方法检测原核表达的重组蛋白， 从而鉴定核酸疫苗的免疫原性（图10)。
【附图说明】
[0022] 图1是毒害艾美耳球虫En济皿5?因整个ORF扩增结果。泳道1为标准分子量； 泳道2为扩增得到的目的片段，大小为1473bp。
[0023] 图2是毒害艾美耳球虫因第211-432位氨基酸编码区基因，加入酶切 位点、保护性碱基和终止密码子后的扩增结果。泳道1为标准分子量；泳道2为扩增得到的 目的片段，大小为687bp。
[0024] 图3是毒害艾美耳球虫En济皿5?因体外重组表达蛋白可溶性分析结果，其中1 : 标准蛋白质分子量标记；2 :菌体裂解后的上清；3 :菌体裂解后的包涵体。
[0025] 图4是毒害艾美耳球虫En济皿5?因的纯化和复性结果分