专利名称：具骨诱导因子控释功能的生物活性骨修复材料及制备方法
技术领域：
本发明属于生物医用材料技术领域。更确切地说，本发明涉及用于骨组织缺 损修复的一种具骨诱导因子控释功能的生物活性骨修复材料及制备方法。
技术背景人体组织的损伤修复与重建一直是现代医学力求解决的难题。骨组织作为人 体最大、同时也是最容易引起缺损的组织器官，每年有数以百万计的骨组织损坏 患者需要接受手术治疗。然而迄今为止，临床上骨缺损修复与重建所采取的治疗 手段都有不同程度的缺陷。自体骨移植是目前临床上使用最多的方法，但它是一 种以牺牲健康部位骨组织为代价的"以伤治伤"的手段，会对供骨区造成新的缺 损，且自体骨组织供区也十分有限。采用同种异体骨移植或异种骨移植尽管克服 了自体骨移植"来源有限和二次损伤"的缺陷，但由于移植后的免疫排斥反应以及潜在的病源传播使得手术的失败率高达20%,再加上供体来源的限制，以及医 学伦理学方面的障碍，至今尚未在临床上获得广泛应用。人工骨替代材料是继骨移植之后临床上出现的又一骨缺损修复治疗手段。随 着骨修复材料制备理论和技术、材料基础临床研究以及相关配套器械的不断发展 和完善，目前已有多种人工骨替代材料在临床上获得广泛应用。然而，随着研究 的不断深入和临床的应用跟踪，人们发现对于极为复杂的人体骨组织修复过程而 言，上述骨缺损修复材料存在着或生物活性不足，或降解性能不理想，很难达到 两者的高度统一，更难实现两者与骨组织再生速度的协调一致，难以满足骨组织 修复和再生过程的要求，因而修复效果并不十分理想。而这已经成为骨修复材料 进一步研究开发的"瓶颈"，并严重制约着其在临床上的广泛应用。按照生物模拟或仿生的方法，以人体天然骨组织修复过程为基础，通过复合 的方法取长补短，研制具有骨诱导特性的生物活性骨修复材料是解决上述问题的 关键。近年来，骨诱导型生物材料的研究发展迅速，采用的方法主要是向材料中引入一些具有骨诱导特性的生长因子，通常采用的引入方式有如下两种(1) 共引入，即在骨修复材料制备过程中加入骨诱导因子。文献(Saito N， 0kada T， Horiuchi H， et al, A biodegradable polymer as a cytokine delivery system for inducing bone formation. Nature Biotechnology, 2001, 19: 332-335)报道了一种聚乳酸、聚对二氧环己酮和聚乙二醇的嵌段共聚物，并将 其与骨细胞因子直接复合以赋予材料骨诱导特性。体内测试的结果发现，该植入 物具有显著的异位成骨效应。徐放，潘锦立等人在专利CN200410053245.7，"注 射的凝胶型骨修复生物活性材料及其制备方法."中，采用类似的方法公开了一 种包含骨诱导因子的海藻酸钠凝胶体系。然而，由于现有的支架制备技术中经常 会有有机溶剂的参与，随着基础研究的进一步深入和临床应用的进一步扩大，发 现将生物活性分干直接暴露在有机溶剂中，其生物学功能会显著下降。尽管这样， 这种骨诱导材料的设计策略仍在许多研究中被广泛使用。(2) 后引入，即在骨修复材料制备完成后再加入骨诱导因子。文献(WeiG, Jin Q， Giarmobile WV， et al. The enhancement of osteogenesis by na—no-fibrous scaffolds incorporating rhBMP-7 nanospheres. Biomaterials， 2007， 28: 2087-2096)报道了一种提高骨修复材料诱导成骨能力的方法。作者首先将重组 人骨形态发生蛋白包裹在聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)共聚物中，制成纳米尺度 的聚合物微球，然后将该微球接种到已制备好的聚乳酸支架材料的空隙中。采用 这种方式可最大程度地保留骨诱导因子的生物学活性，但又存在引入不均匀和释 放快的问题，并且还会对支架材料的空隙率和孔的通透性产生不利影响，因而使 治疗效果很难如愿，应用受到限制。尽管这样，这一功能材料的设计策略还是值 得借鉴的。综上可见，优良的骨诱导因子控释载体和载体与骨修复材料间的有效复合方 法是真正实现骨诱导因子的可控释放和活性维持的双重目的、提高骨修复材料诱 导成骨能力的关键。发明内扭本发明的目的在于提供一种具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材料及其制备方法。所述骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材料为一 种骨诱导型纳米钙磷盐/胶原/聚乳酸/微襄化壳聚糖复合材料。以克服现有技术 存在的上述缺陷，满足由创伤、肿瘤、感染等造成的骨组织缺损修复的需求。所述具有骨诱导因子控释功能的生物活性骨修复材料主要由纳米羟基磷灰石/胶原(以下简称nHAC)复合材料、生物降解性高分子材料聚乳酸(以下简称 PLA)、以及治疗有效量的骨诱导因子壳聚糖控释微球组成，三者采用物理混合和 超声波分散技术相结合的方法复合而成。所述nHAC复合材料是利用胶原分子自组装纤维模板，在溶液中诱导羟基磷 灰石纳米晶体沿特定的方向生长并沉积而获得的一种纳米晶磷酸钙胶原基复合 材料。该材料产物在纳米尺度上具有重复片层结构，周期为10-15nm，由胶原层 和钙磷盐层交替排列而成，可以按照专利CN01136246. 4公开的方法制备。所述生物降解性高分子材料聚乳酸为聚L-乳酸或聚D， L-乳酸，聚乳酸的分 子量为1. 0 X10B-3. 0 X 10'5 kDa。所述骨诱导因子控释微球是由壁材包裹囊芯得到的载药微胶囊。其中，壁材 选择的是壳聚糖天然高分子材料，因为它本身具有明显的碱性，因而在体内同时 还可以中和聚乳酸降解产物的酸性。囊芯是指具有骨诱导特性的生物活性分子， 如转化生长因子-P (TGF-0)、骨形态发生蛋白(BMPs)、成纤维细胞生长因子 (FGFs)、胰岛素样生长因子(IGFs)、血小板衍生生长因子(PDGFs)、以及人工 合成的上述这些生长因子的活性肽等。这些骨诱导因子既可以单独梭用，也可以 在需要的情况下混合使用。所述具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材料的制备方法，包括 下列各步骤(1) 将壳聚糖溶于卜3% (v: v)的醋酸溶液中，配成浓度为5-50g/L的溶 液，然后按照壁材与囊芯的质量比为1: (0.001-0.1)的比例加入骨诱导因子， 磁力搅拌混合均匀，得水相；(2) 将乳化剂司班80加入液体石蜡中，配成浓度为1-5% (v: v)的溶液， 得油相；然后在搅拌状态下，将水相壳聚糖溶液缓慢滴加入油相溶液中，水相比200710178133.8说明书第4/7页例维持在总体积的10-50%之间，得到的混合乳液继续搅拌0. 5-4小时；(3) 将多聚阴离子交联剂三聚磷酸钠溶于去离子水中配成浓度为 10-100g/L的溶液，缓慢滴加入上述混合乳液中，继续搅拌2-4小时后沉淀；将 所得沉淀物用石油醚、异丙醇交替各洗三次，再用去离子水漂洗，冷冻干燥后得 包裹有骨诱导'因子的壳聚糖控释微球，微球粒径主要分布在10-50 u m之间。(4) 将分子量为1. OX 10s-3. OX 105 kDa的聚乳酸溶于1， 4-二氧六环中， 配成浓度为10-100g/L的溶液，然后依次按nHAC与PLA的质量比为(0. 5-1. 5): 1的比例加入nHAC干粉，载药微球与PLA的质量比为(0.05-0.5): 1的比例加 入骨诱导因子控释微球，混合物充分搅拌混合均匀，制得纳米羟基磷灰石/胶原/ 聚乳酸/微囊化壳聚糖混合溶液；(5) 采用热致分相法制备纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸/微囊化壳聚糖复 合多孔骨支架材料。将上述第四步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于 -20'C冰箱中冷冻以固化溶剂并引起固液分相；充分冷冻后，将模具转移到冷冻 干燥机中冷冻干燥72-120小时，为了将溶剂彻底清除，冷冻干燥后的材料需在 40-60'C的真空干燥箱中烘干24-72小时；(6) 将上述第五步的制品用环氧乙垸蒸气消毒2-4小时，也可参照相关国 际标准进行消毒后保存，即为具有骨诱导因子控释功能的纳米羟基磷灰石/胶原/ 聚乳酸/微囊化壳聚糖复合多孔骨修复材料。本发明的有益效果是通过上述方法得到的骨诱导型纳米羟基磷灰石/胶原/ 聚乳酸/微囊化壳聚糖复合材料具有十分显著的优点(1) 将骨诱导因子微胶囊化后，再与nHAC和聚乳酸进行非均相复合，利用 微胶囊的屏蔽作用避免了制备过程对骨诱导因子生物活性的影响，同时还实现了 骨诱导因子在整个支架材料中的均匀分布；(2) 通过控制微球制备过程中的壁材厚度、药物含量以及支架制备过程中 的微球用量，实现骨诱导因子在支架材料中的可控二级缓释(壁材本体结构降解 决定的一级缓释和支架材料多孔微观结构决定的二级缓释)，从而延长了支架系 统释放骨诱导因子的时间；(3)制备的支架材料的孔隙率较高，约为70-90%,且孔隙率与溶液浓度有 关，浓度越小孔隙率越大；支架中分布有大量介于60-200 ix m的微孔，孔与孔之 间相互贯通。因此，本发明是一种新颖的骨修复材料，具有良好的生物相容性和生物可降 解性，同时还具有比现有技术文献报道更好的骨诱导特性，很有希望作为骨组织 缺损用修复材料在临床上得到广泛应用。
具体实施方式
本发明以克服现有技术存在的上述缺陷，满足由创伤、肿瘤、感染等造成的 骨组织缺损修复的需求而提供一种具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨 修复材料及其制备方法。所述具有骨诱导因子控释功能的生物活性骨修复材料主 要由纳米羟基磷灰石/胶原复合材料、生物降解性高分子材料聚乳酸、以及治疗 有效量的骨诱导因子壳聚糖控释微球组成，三者采用物理混合和超声波分散技术 相结合的方法复合而成。所述.nHAC复合材料是利用胶原分子自组装纤维模板，在溶液中诱导羟基磷 灰石纳米晶体沿特定的方向生长并沉积而获得的一种纳米晶磷酸钙胶原基复合 材料。该材料产物在纳米尺度上具有重复片层结构，周期为10-15nm,由胶原层 和钙磷盐层交替排列而成，可以按照专利CN01136246.4公开的方法制备。所述骨诱导因子控释微球可采用相分离法、离子诱导法、乳化交联法、喷雾 干燥法等进行制备，以乳化交联法为佳。选用的交联剂有利用可逆物理交联的多 聚磷酸盐、拧檬酸盐等多聚阴离子，以及利用化学交联的甲醛、戊二醛类化合物。 其中，考虑到囊芯物为生物活性分子，又以多聚阴离子交联剂为佳。下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明 的保护范围。实施例l: BMP-2壳聚糖控释微球的制备称取250mg壳聚糖，溶于10mL 、 20mL/L的醋酸溶液中，配成浓度为25g/L 的溶液;待其完全溶解后，加入lmg骨形态发生蛋白-2;搅拌均匀后,滴加入lOOmL 含有25mL/L司班80的液体石蜡中，在搅拌状态下乳化2小时；然后滴加40mL，浓度为50g/L的三聚磷酸钠溶液，继续搅拌4小时后沉淀；将沉淀物用石油醚、 异丙醇交替各洗三次，再用去离子水漂洗，冷冻干燥后即得BMP壳聚糖控释微球。 体外测试的结果表明，微球的平均粒径为39. 0 u m, BMP-2的包封率达9096以上。 实施例2: BMP-2活性肽壳聚糖控释微球的制备称取250mg壳聚糖，溶于10mL 、 20mL/L的醋酸溶液中，配成浓度为25g/L 的溶液；待其完全溶解后，加入5mg骨形态发生蛋白-2活性肽；搅拌均匀后，滴 加入100mL含有25mL/L司班80的液体石蜡中，在搅拌状态下乳化2小时；然后 滴加40mL，浓度为50g/L的三聚磷酸钠溶液，继续搅拌4小时后沉淀；将沉淀物 用石油醚、异丙醇交替各洗三次，再用去离子水漂洗，冷冻干燥后即得BMP-2活 性肽壳聚糖控释微球。体外测试的结果表明，微球的平均粒径为33.9iim， BMP-2 活性肽的包封率达8096以上。实施例3:包含BMP-2控释微球的生物活性骨修复材料的制备 称取分子量为3.0X105的聚乳酸0.5g，溶于10mL 1, 4-二氧六环中，配成 浓度为50g/L的溶液；待其完全溶解后，加入0. 5g nHAC干粉，同时加入0.25g 实施例1制备好的BMP-2壳聚糖控释微球；混合物在室温下充分搅拌混合均匀， 然后倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20'C冰箱中冷冻24小时；将冷冻成型后的材 料转移到冻干机中冷冻干燥72小时以除去1， 4-二氧六环溶剂，后将材料放入温 度为40'C、真空度为-0. lMPa的真空干燥箱中烘干48小时，即得包含BMP-2的 纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸/微囊化壳聚糖生物活性骨修复材料。实施例4:包含BMP-2壳聚糖控释微球的生物活性骨修复材料的制备 称取lg分子量为1.0X105的聚乳酸，溶于10mL 1， 4-二氧六环中，配成浓 度为100g/L的溶液；待其完全溶解后，加入lg nHAC干粉，同时加入0. 25g实 施例1制备好的BMP-2壳聚糖控释微球；混合物在室温下充分搅拌混合均匀，然 后倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20"C冰箱中冷冻24小时；将冷冻成型后的材料 转移到冻干机中冷冻干燥72小时以除去1， 4-二氧六环溶剂，后将材料放入温度 为401G、真空度为-0. lMPa的真空干燥箱中烘干48小时，即得包含BMP-2的纳 米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸/微囊化壳聚糖生物活性骨修复材料。实施例5:包含BMP-2活性肽壳聚糖控释微球的生物活性骨修复材料的制备 称取分子量为3.0X105的聚乳酸0.5g,溶于10mLl， 4-二氧六环中，配成 浓度为50g/L的溶液；待其完全溶解后，加入0. 5g nHAC干粉，同时加入0. 25g 实施例2制备好的BMP-2活性肽壳聚糖控释微球；混合物在室温下充分搅拌混合 均匀，然后倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20X:冰箱中冷冻24小时；将冷冻成型 后的材料转移到冻干机中冷冻干燥72小时以除去1， 4-二氧六环溶剂，后将材料 放入温度为40'C 、真空度为-0. lMPa的真空干燥箱中烘干48小时,即得包含BMP-2 活性肽的纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸/微囊化壳聚糖生物活性骨修复材料。 实施例6:包含BMP-2活性肽壳聚糖控释微球的生物活性骨修复材料的制备 称取分子量为1.0X105的聚乳酸lg，溶于10mL 1, 4-二氧六环中，配成浓 度为100g/L的溶液；待其完全溶解后，加入lgnHAC干粉，同时加入0.25g实 施例2制备好的BMP-2活性肽壳聚糖控释微球；混合物在室温下充分搅拌混合均 匀，然后倒入聚四氟乙烯模具中，置于-201C冰箱中冷冻24小时；将冷冻成型后 的材料转移到冻干机中冷冻干燥72小时以除去1， 4-二氧六环溶剂，后将材料放 入温度为40'C、真空度为-0. lMPa的真空干燥箱中烘干48小时，即得包含BMP-2 活性肽的纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸/微囊化壳聚糖生物活性骨修复材料。
权利要求
1.一种具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材料，其特征在于，所述具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材料由纳米羟基磷灰石/胶原复合材料nHAC、生物降解性高分子材料聚乳酸PLA、以及治疗有效量的骨诱导因子壳聚糖控释微球组成。
2. 根据权利要求1所述具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材 料，其特征在于，所述nHAC复合材料是利用胶原分子自组装纤维模板，在溶液 中诱导羟基磷灰石纳米晶体沿特定的方向生长并沉积而获得的一种纳米晶磷酸 钙胶原基复合材料；该复合材料在纳米尺度上具有重复片层结构，周期为 10-15nm，由胶原层和钙磷盐层交替排列而成。
3. 根据权利要求1所述具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材 料，其特征在于，所述生物降解性高分子材料聚乳酸为聚L-乳酸或聚D， L-乳酸， 聚乳酸的分子量为1.0X105-3. 0X105 kDa。
4. 根据权利要求1所述具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材 料，其特征在于，所述骨诱导因子控释微球是由壁材包裹囊芯得到的载药微胶囊， 其中，壁材选择的是壳聚糖天然高分子材料，因为它本身具有明显的碱性，因而 在体内同时还可以中和聚乳酸降解产物的酸性；囊芯是指具有骨诱导特性的生物 活性分子，选择转化生长因子-3、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、胰 岛素样生长因子、血小板衍生生长因子、以及人工合成的上述这些生长因子的活 性肽中的一种或一种以上混合使用。
5. —种具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材料的制备方法，其 特征在于，所述生物活性骨修复材料的制备是用权利要求1所述的三种材料采用物理混合和超声波分散技术相结合的方法复合而成，包括下列各步骤1) 将壳聚糖溶于1-3% (v: v)的醋酸溶液中，配成浓度为5-50g/L的溶液， 然后按照壁材与囊芯的质量比为1: (0.001-0.1)的比例加入骨诱导因子，磁力 搅拌混合均匀，得水相；2) 将乳化剂司班80加入液体石蜡中，配成浓度为1-5% (v: v)的溶液，得油相；然后在搅拌状态下，将水相壳聚糖溶液缓慢滴加入油相溶液中，水相比例 维持在总体积的10-50%之间，得到的混合乳液继续搅拌0. 5-4小时；3) 将多聚阴离子交联剂三聚磷酸钠溶于去离子水中配成浓度为10-100g/L的溶液，缓慢滴加入上述混合乳液中，继续搅拌2-4小时后沉淀；将所得沉淀物用石油醚、异丙醇交替各洗三次，再用去离子水漂洗，冷冻干燥后得包裹有骨诱导因子的壳聚糖控释微球，微球粒径主要分布在10-50 n m之间；4) 将分子量为1.0Xl(f-3.0X105 kDa的聚乳酸溶于1， 4-二氧六环中，配 成浓度为10-100g/L的溶液，然后依次按nHAC与PLA的质量比为(0.5-1.5): 1 的比例加入nHAC干粉，载药微球与PLA的质量比为(0.05-0.5): 1的比例加入 骨诱导因子控释微球，混合物充分搅拌混合均匀，制得纳米羟基磷灰石/胶原/聚 乳酸/微囊化壳聚糖混合溶液；5) 采用热致分相法制备纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸/微囊化壳聚糖复合多 孔骨支架材料。将上述第四步配成的混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，置于-20 'C冰箱中冷冻以固化溶剂并引起固液分相；充分冷冻后，将模具转移到冷冻干燥 机中冷冻干燥72-120小时，为了将溶剂彻底清除，冷冻干燥后的材料需在40-60 r的真空干燥箱中烘干24-72小时；6) 将上述第五步的制品用环氧乙烷蒸气消毒2-4小时，也可参照相关国际 标准进行消毒后保存，即为具有骨诱导因子控释功能的纳米羟基磷灰石/胶原/聚 乳酸/微囊化壳聚糖复合多孔骨修复材料。
全文摘要
本发明公开了属于生物医用材料技术领域的一种具有骨诱导因子控释功能的纳米生物活性骨修复材料及其制备方法。该生物活性骨修复材料由纳米羟基磷灰石/胶原复合材料nHAC、生物降解性高分子材料聚乳酸PLA、以及治疗有效量的骨诱导因子壳聚糖控释微球组成。所述生物活性骨修复材料的制备是用权利要求1所述的三种材料采用物理混合和超声波分散技术相结合的方法复合而成。本发明是一种新颖的骨修复材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时还具有比现有技术文献报道更好的骨诱导特性，很有希望作为骨组织缺损用修复材料在临床上得到广泛应用。
文档编号A61L27/40GK101219241SQ20071017813
公开日2008年7月16日 申请日期2007年11月27日 优先权日2007年11月27日
发明者冯庆玲, 崔福斋, 牛旭锋 申请人:清华大学