治疗性方法和组合物的制作方法

治疗性方法和组合物的制作方法
【专利摘要】提供了用于诊断或治疗受试者中的免疫病症的方法。所述方法基于不应状态诱导因子(RIF)的检测或调控。
【专利说明】治疗性方法和组合物 发明领域
[0001] 本发明涉及用于调控有此需要的受试者中的免疫系统的组合物和方法。更具体 地，本发明公开了免疫应答的关键的内源因子的存在和表征，并且基于此因子的调控提供 了新的治疗和诊断性方法和组合物。具体地，本发明提供了适合于刺激或抑制受试者中的 CD4T细胞介导的免疫应答的组合物和方法，以及用于监测免疫缺陷的方法和组合物，包括 与人免疫缺陷病毒(HIV)感染有关的免疫缺陷。还提供了诊断和测定抗逆转录病毒疗法后 持续的CD4T细胞缺陷的方法和组合物，以及开发能够特异性治疗此免疫缺陷的药物的方 法。
[0002] 发明背景
[0003] CD4T淋巴细胞在控制免疫系统(细胞和体液应答二者）中发挥卓越的作用，并且在 各种疾病状况中是至关重要的。
[0004] 在与HIV发病机制有关的免疫学疾病期间，所有CD4T细胞的小于0.5%实际上被感 染（如在外周血中测量），但是绝大多数的CD4T细胞显示重大的调节功能障碍。未感染的 CD4T淋巴细胞进行性松开其功能，变得无反应性的，并且其数目减少，导致CD4淋巴细胞减 少。无反应性和淋巴细胞减少是表征感染HIV的患者的免疫缺陷的标志。这些现象背后的机 制从未完全阐明（1)。
[0005] 免疫活化和炎症在HIV发病机制中也发挥重要的作用（2,3)。发明人先前已经证明 了对白介素-2(IL-2)的响应性降低，导致CD4无反应性(4)，和对白介素-7(IL-7)的响应性 的降低，所述白介素-7通过破坏IL-7/CD4调节环，参与导致CD4淋巴细胞减少的机制(5)。牵 涉的机制已经归因于Janus激酶(Jak)/信号转导物和转录活化物（Signal Tranducer and Activator of Transcription)(STAT)途径(6,7)中的缺陷。其它实验室已经获得了相似的 结果(8，9)。在这方面，需要IL-7受体（IL-7R)的区室化以启动正常的⑶4T细胞应答（10)。在 IL-7结合后，首先将IL-7R的两条链(IL-7R alpha和gamma-c)驱动到膜微域(MMD)中。这些 是细胞区室，其与脂筏一样富含胆固醇和鞘磷脂，但是它们也含有非常大量的结构和功能 性蛋白质（11) JL-7R复合物诱导细胞骨架的重构，所述细胞骨架然后与其网络相互作用。 这两个连续的步骤将是启动Jak/STAT途径需要的（12)。
[0006] 本发明人已经调查了感染病毒血HIV的患者(VP)中的⑶4T淋巴细胞的无应答性背 后的机制。本文中提供的实验证明了 CD4T淋巴细胞的长期活化将它们驱动成活化/分化的 异常状态，这使它们对某些生理学信号（如那些由白介素-7递送的生理学信号)不应。此外， 本发明报告了造成CD4T细胞活化的此异常状态的蛋白质从人血浆中的鉴定、分离和表征。 因此，本发明第一次公开了可以通过内源循环蛋白介导免疫抑制，所述内源循环蛋白在表 达后能够诱导CD4-T细胞的改变和失活，并且在抑制后可以刺激受试者中的免疫系统。 [0007]部分基于这些值得注意的发现，本发明现在提供了用于调控免疫系统，特别是用 于调控具有改变的免疫(例如免疫抑制或病理学免疫反应）的受试者中的免疫系统的新方 法、组合物和化合物。本发明进一步提供了通过调控CD4T细胞治疗免疫病症的新方法。本发 明特别适合于治疗与CD4T细胞损伤有联系的免疫缺陷，如与HIV感染有关的免疫缺陷综合 征。本发明还提供了用于表征异常活化状态，对IL7的反应性和/或用于监测感染HIV的患者 中受损的免疫应答的试剂和方法。可以在未治疗的患者或用抗逆转录病毒药物治疗的患者 中评估CD4T细胞的应答，并且量化其对治疗的响应并且评估其CD4T细胞的胜任性。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明的一个目的涉及用于调控受试者中的免疫应答的方法，其包括使受试者暴 露于调控GIBsPLA2的量(例如表达)或活性的化合物。
[0010] 本发明的又一个目的涉及治疗受试者中的免疫病症的方法，其包括使受试者暴露 于调控GI BsPLA2的量(例如表达)或活性的化合物。
[0011] 本发明的又一个目的涉及治疗受试者中的免疫病症的方法，其包括调控受试者中 的GIBsPLA2的量(例如表达)或活性。
[0012]本发明的另一个目的涉及调控GIBsPLA2的量(例如表达)或活性的化合物用于制 备药物的用途，所述药物用于调控免疫应答或用于治疗受试者中的免疫病症。
[0013] 本发明的另一个目的涉及在调控免疫应答或治疗受试者中的免疫病症的方法中 使用的GIBsPLA2调控剂。
[0014] 本发明的另一个目的涉及GIBsPLA2调控剂，用于调控受试者中的白细胞的用途。
[0015] 在第一个实施方案中，本发明用于诱导或刺激受试者中的免疫应答，并且包括抑 制所述受试者中的GIBsPLA2,或者使受试者暴露于GIBsPLA2抑制剂。此类实施方案特别适 合于治疗免疫缺陷的受试者或者需要刺激的免疫(例如传染病，癌症等)的受试者。
[0016] 因此，本发明的一个具体的目的存在于刺激受试者中的免疫应答的方法，其包括 抑制所述受试者中的GIBsPLA2或者使受试者暴露于GIBsPLA2抑制剂。
[0017] 本发明的又一个目的涉及治疗受试者中的传染病的方法，其包括抑制所述受试者 中的GIBsPLA2或使受试者暴露于GIBsPLA2抑制剂。
[0018]本发明的一个更具体的实施方案涉及治疗感染HIV的受试者中的AIDS的方法，其 包括抑制所述受试者中的GIBsPLA2或使受试者暴露于GIBsPLA2抑制剂。
[0019] 在一个具体的实施方案中，使受试者暴露于抑制剂包括对受试者施用抑制剂。在 另一个实施方案中，使受试者暴露于抑制剂包括针对GIBsPLA2对受试者接种疫苗。
[0020] 在这方面，在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于刺激有此需要的受试者的 免疫系统的方法，所述方法包括针对GIBsPLA2对受试者接种疫苗。
[0021] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及GIBSPLA2抗原，用于对有此需要的受试 者接种疫苗的用途。
[0022] 在另一个方面中，本发明用于降低或抑制受试者中的不想要的或有害的免疫应 答，并且包括引起或增加所述受试者中的GIBsPLA2,或者使受试者暴露于GIBsPLA2激动剂 或活化剂。此类实施方案特别适合于治疗具有异常和/或病理学免疫应答(例如自身免疫性 疾病、炎症、荨麻疹，湿疹，变态反应，哮喘等)的受试者。
[0023]在又一个方面中，本发明提供了用于诊断与CD4T细胞改变有关的人免疫缺陷的方 法。在一些实施方案中，方法包括(a)提供含有体液的样品，优选来自受试者的血浆，并且 (b)检测样品中的GIBsPLA2的存在。在方法的一些实施方案中，免疫缺陷是与人免疫缺陷病 毒(HIV)感染有关的免疫缺陷。在一些实施方案中，方法包括使样品与对GIBsPLA2特异性的 抗体接触。在方法的一些实施方案中，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA)检测样品中的 GIBsPLA2的存在。
[0024]在另一个方面中，本发明提供了用于鉴定候选免疫缺陷治疗剂的方法。在一些实 施方案中，免疫缺陷与CD4T细胞改变有关。在方法的一些实施方案中，与CD4T细胞改变有关 的人免疫缺陷由病毒感染，特别是人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起。在一些实施方案中，方 法包括：（a)在存在药剂的情况下使⑶4T淋巴细胞与GIBsPLA2接触，（b)测量GIBsPLA2诱导 的CD4T细胞活化，并且(c)比较在存在药剂的情况下的GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水 平与在缺乏药剂的情况下GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水平。在方法的一些实施方案 中，若在存在药剂的情况下GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水平低于在缺乏药剂的情况下 GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水平，则将药剂鉴定为候选免疫缺陷治疗剂。在方法的一 些实施方案中，若在存在药剂的情况下GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水平不低于在缺乏 药剂的情况下GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水平，则将药剂鉴定为候选免疫抑制治疗 剂。在一些实施方案中，方法包括通过测定每个⑶4T细胞的MMD数目测量GIBsPLA2诱导的 ⑶4T细胞活化。在一些实施方案中，方法包括通过测定⑶4T细胞上的MMD的均值直径测量 GIBsPLA2诱导的⑶4T细胞活化。在一些实施方案中，方法包括通过测定⑶4T细胞的IL-7响 应性测量GIBsPLA2诱导的⑶4T细胞活化。
[0025]在另一个方面中，本发明涉及药物组合物，其包含GIBsPLA2调控剂和药学可接受 载体或赋形剂。在一个优选的实施方案中，GIBsPLA2调控剂是GIBsPLA2抑制剂，更优选地选 自抗体或其片段或衍生物、抑制性核酸、肽或小药物。在另一个具体的实施方案中， GIBsPLA2调控剂是GIBsPLA2激动剂或活化剂，更具体地，GIBsPLA2蛋白。
[0026]在另一个方面中，本发明涉及疫苗组合物，其包含GIBsPLA2抗原（例如免疫原性 GIBsPLA2蛋白或其含有表位的片段）、药学可接受载体或赋形剂和任选地佐剂。在一个优选 的实施方案中，GIBsPLA2抗原是GIBsPLA2蛋白或其片段，其经处理以（i)增加其在人受试者 中的免疫原性和/或（i i)降低其生物学活性。
[0027] 本发明可以在任何哺乳动物中使用。它特别适合于用于人受试者。它可以用于提 高任何哺乳动物中的免疫应答，并且它特别适合于诱导免疫抑制受试者中的有力的CD4-T 细胞活性。
[0028] 附图简述
[0029]图la至le显示了在任何刺激前，来自VP的CD4T细胞显示异常的活化状态，具有不 受IL-7影响的许多大的膜微域。
[0030] (a)用霍乱毒素亚基B (CtxB-AF488)标记膜微域(MMD)，并且通过STED显微术分析。 从上到下，来自经HD、VP和PHA活化的（40μg/ml，30min)HDT细胞的纯化的CD4T细胞。对于每 组，从Z堆叠图像系列（Z-stack image series)中显示了IL-7刺激（2nM, 15min)之前和之后 的代表性⑶4T细胞的上半部。在通过IL-7刺激前还用胆固醇氧化酶(C0ase，31yM，25min)加 上鞘磷脂酶（sphyngomyelinase) (SMase，2 · 7μΜ, 5min)处理 CD4T 淋巴细胞。
[0031] (b，c)在纯化的⑶4T细胞的整个表面上对MMD计数。检查平均值50个细胞。（b) IL-7 刺激之前(HDc:NS)和之后(HDc:IL-7)的HD细胞。（c)IL-7刺激VP之前(VPc:NS)和之后(VPc: IL-7)的VP细胞，IL-7刺激之前(HDc: PHA)和之后（HDc: PHA/IL-7)的经PHA活化的HD细胞。 [0032] (d，e)在纯化的CD4T细胞的表面上测量MMD大小(d)经IL-7刺激的HD细胞(册〇:11^- 7)，（ e)经IL-7刺激的VP细胞(VPc: IL-7)和经IL-7刺激的经PHA预活化的HD细胞(HDc : IL- 7)。
[0033] 图2a至2c显示了来自VP CD4T细胞的IL-7R链包埋于不受IL-7影响的去污剂抗性 微域(DRM)中。将纯化的CD4T淋巴细胞裂解(0.5%Triton X-100)，并且在5-40%蔗糖梯度 上加载200μ1裂解物。在于4°C离心（50krpm)16h后，收集18个级份(#1左=管顶部=5%蔗 糖;#18右=管底部= 40%蔗糖）。在SDS-PAGE(7%双丙烯酰胺(acrylamide-bis))上分析每 个级份。通过免疫印迹法检测阀蛋白（Flottilin)、IL_7R alpha和gamma-c(lO)。
[0034] (a)使用阀蛋白作为标记物来指示与DRM对应的低密度级份和阀外部的高密度级 份。
[0035] (b)对纯化的非刺激的HD CD4T细胞(HDc: NS)、经IL-7刺激的HD细胞(HDc: IL-7)、 非刺激的VP细胞(VPc: NS)和经PHA活化的HD细胞(HDc: PHA)显示了 IL-7Ralpha和（c) gamma-c条带。
[0036] 图3a至3e显示了IL-7R功能在VP CD4T-细胞的膜微域中改变。
[0037] (a)测量IL_7Ralpha的二维有效扩散速率Deff，如图7中形成。还在添加各种药物后 测量扩散速率：C0ase(31yM，30minWplSMase(2.7yM，5min)(C0/SM)、Col(10yM，30min)W 上CytD(20yM，30min)(CytD/Col)，或者在存在所有这些抑制剂(所有）的情况下。研究了来 自HD(HDc)和VP(VPc)的CD4T细胞，也研究了经PHA活化的HD CD4T细胞(HDc:PHA)。棒标示来 自5个独立实验的SEM。图8中给出了更多的实验数据。
[0038] (b)使用用山羊抗兔Atto642标记的兔磷酸-STAT5追踪IL-7诱导的磷酸化和STAT5 的核转位，并且通过脉冲STED显微术(0.5μπι切片）分析。实验牵涉纯化的非刺激的HD CD4T 细胞(HDc:NS)、经IL-7-刺激的HD CD4T细胞(HDc:IL-7)、非刺激的VP CD4T细胞(VPc:NS)、 经IL-7-刺激的VP CD4T细胞(VPc: IL-7)、经PHA-活化的HD CD4T细胞(HDc:PHA)和经PHA-活 化的通过IL-7刺激的HD CD4T细胞（HDc : PHA/1L-7 )。在左边小图中显示了秋水仙素 (colchicine)加上松胞菌素 D的效果。
[0039] (c，d，e)在IL-7刺激后，使用Image J软件测量胞质中的磷酸-STAT5出现和核中的 积累的动力学。（c)HD CD4T细胞（黑线）和用Col加上CytD处理的HD CD4T细胞(蓝线），（d)VP ⑶4T细胞(红线）和(e)经PHA-活化的HD⑶4T细胞(绿线）。
[0040] 图4a至4d显示了来自VP的血浆诱导HD⑶4T细胞中的异常活化模式，如通过MMD的 数目测量。
[0041 ] (a)显示了 用来自 ￥?(^(3:￥?口）、!11(：(肋(3:!110口）或八1?1'患者（!10(3:41^^)的血浆 (10 % )处理的HD⑶4T细胞的代表性图像。用霍乱毒素(CtxB-AF488)染色MMD。对于每组，显 示了 IL-7刺激(2nM，15min)之前（左）和之后（右）的来自Z堆叠图像的代表性⑶4T细胞的上 半部。
[0042] (b)通过来自5种不同VP(VPpl至VPp5)血浆（10%)在CD4T-细胞(HDc)的表面上诱 导的MMD。从对IL-7刺激之前（白色)和之后(蓝色）的50个细胞的分析获得结果。显示了均值 和四分位数。
[0043] (c)比较IL-7刺激之后（蓝色）和之前（白色）的来自HD(HDp)、VP(VPp)、HIC(HICp) 和ART患者(ARTp)的血浆的效果。
[0044] (d)用c中描述的血浆获得的剂量(0.01%至10%)-响应。显示了在HDc⑶4T细胞 的表面上诱导的MMD的数目。VP血浆的效果显示为平红线。
[0045] 图5a至5d显示了来自VP的血浆抑制HD⑶4T淋巴细胞中的IL-7诱导的STAT5磷酸 化和磷酸-STAT5的核转位。
[0046] (a)在IL-7刺激前，将纯化的HD CD4T细胞与血浆（10% )预温育。通过脉冲-STED显 微术(0.5μπι切片)追踪IL-7诱导的磷酸化和磷酸STAT5的核转位。研究以下血浆（10 % ):对 照（HDc: NS)、VP (HDc: VPp)、HIC(HDc: HICp)和ART患者（HDc: ARTp)。
[0047] (b)用5种不同VP的血浆（10%)预处理的经IL-7-刺激的HD⑶4T细胞的细胞质（蓝 色)和核(红色）中回收的磷酸-STAT5的分析。
[0048] (c)比较血浆（10% )预温育对经IL-7-刺激的HD CD4T细胞的影响。血浆来自HD (HDp)、VP(VPp)、HIC(HICp)和ART患者（ARTp)
[0049] (d)用血浆获得剂量(0.01%-10%)_响应，如通过抑制经IL-7-刺激的HD CD4T细 胞中的磷酸-STAT5核转位测量。VP血浆的效果显示为平红线。
[0050] 图6a至6d显示了从VP血浆回收的不应状态诱导因子(RIF)的分子表征。
[0051 ] (a)通过胰蛋白酶、DNA酶、RNA酶和PNG酶处理VP血浆。通过测量HD CD4T-细胞中的 MMD数目和对IL-7诱导的核磷酸-STAT5的影响追踪RIF活性。
[0052] (b)通过在Sephadex G100柱上的凝胶过滤测量RIF MW。通过测量由柱的不同级份 诱导的MMD数目追踪HD⑶4T细胞上的RIF活性(厚红线）。还通过使用来自VP血浆的多克隆 抗体的点印迹对每个级份测试病毒蛋白的存在。已经扣除了用HD血浆获得的背景。将实验 重复二次。
[0053] (c)还在Sephadex G100柱上的凝胶过滤后测量RIF MW，并且通过抑制IL-7诱导的 磷酸-STAT5追踪其活性，如通过FACS测量。记录了最大IL-7-诱导的磷酸-STAT5的百分比。 还报告了每个级份中的蛋白质的量。将实验重复两次。
[0054] (d)如下测量等电点。将从Sephadex G100柱洗脱的RIF加载到阴离子(MonoQ)或阳 离子(MonoS)交换柱上。通过pH-步进缓冲液洗脱RIF活性。相对pH绘制HD⑶4T细胞上的MMD 数目。
[0055] 图7a至7c显示了来自经HD、VP和IL-7-刺激的HD细胞的纯化的CD4T细胞的IL-7信 号体(signalosome)的2D凝胶分析。（a)非刺激的（NS)HD CD4T细胞。（b)VP CD4T细胞。（c)经 IL-7-刺激的HD CD4T细胞。
[0056] 图8a至8g显示了来自经HD、VP和PHA-刺激的HD细胞的纯化的CD4T细胞的表面上的 IL-7Ralpha的扩散速率的分析。（a，d)在HD CD4T细胞的表面上，（b，e)在VP CD4T细胞的表 面上，（c，f)在用PHA(lμg/ml)预活化的HD⑶4T细胞的表面上。（g)在通过MMD抑制剂或细胞 骨架抑制剂处理之前和之后MMD中包埋的IL-7Ralpha扩散的机制的图解。
[0057] 图9a至9d显示了RIF对HD CD4T细胞作用的假设模式和IL-7无应答性机制的图示。 RIF诱导非功能性的异常MMD。因此，IL-7信号体被改变，并且细胞仍然对细胞因子无应答， 与在VP⑶4T细胞中一样。RIF诱导的HD⑶4T细胞中和VP⑶4T细胞中的异常活化模式和信 号传导缺陷不能区分。图解的左部分显示了 HD中的IL-7信号转导的机制中的不同步骤（10， 12)〇
[0058] (a)在静息CD4T细胞中，在E-7识别前，IL-7R链联合，但是它们的胞质内域离得很 远，并且信号传导分子Jakl和Jak3不是相互作用的。
[0059] (b)在经IL-7-活化的CD4T细胞中，IL-7R在正常MMD(直径为90nm)中区室化，并且 信号体变为功能性的。在细胞骨架构造后，STAT5A和STAT5B与IL-7R/Jakl/Jak3复合物接触 是磷酸化的，然后通过沿着微管移动迀移到核，如先前讨论(12)。
[0060]图解的右边部分显示了 RIF作用的假设机制。提出的作用机制源自初步数据和RIF 诱导的缺陷与在来自VP的纯化的CD4T细胞中表征的变化的比较(未发表的数据）。
[0061 ] (c)RIF诱导许多较大的异常MMD<JL-7R包埋于异常的MMD中，并且它们诱导功能性 信号体的能力被改变。
[0062] (d)经RIF处理的HD CD4T细胞不响应IL-7<Jakl和Jak3磷酸化STAT5,尽管以降低 的动力学，但是磷酸-STAT5由于缺乏细胞骨架和微管构造而不迀移到核中。
[0063] 小图a、b、c和d显示了用CtxB:AF488标记的MMD的STED显微术图像(来自CW-STED的 Z堆叠的半堆）。小图b和d显示了用兔抗微管/山羊抗兔Att〇642染色的微管蛋白，用小鼠抗 肌动蛋白/山羊抗小鼠 Chr494染色的肌动蛋白和用兔抗磷酸-STAT5/山羊抗兔Att〇642染色 的磷酸-STAT5。脉冲STED显微术显示了经甲醇透化的⑶4T细胞的0.5μπι切片。在IL-7刺激 后，与在HD中不一样，经RIF处理的HD CD4T淋巴细胞的MMD细胞质区中的肌动蛋白不能浓缩 为有结构的垫，并且不形成核周围的皮层。此外，与在VP⑶4Τ细胞中一样，在这些经RIF处 理的HD CD4T细胞中的微管蛋白不能形成微管，所述微管已经假设为桥接质膜和核膜的重 要杆，并且从而对于STAT5核转位是必需的。
[0064]缺陷的汇总：画圈的数字1、2、3和4标示了与经RIF处理的HD Τ细胞中的异常活化 模式和IL-7无应答性相关的不同缺陷步骤：（1)信号传导复合物的异常蛋白质模式，如通过 2D凝胶描述，（2)异常膜结构，诸如大MMD，如通过STED显微术看出，（3)异常细胞骨架构造， 如通过扩散动力学和STED显微术测量，和(4)异常信号传导中间体和抑制磷酸-STAT5核转 位，如通过STCD显微术显示。
[0065] 图10:PLA2sGIB抑制健康供体(HD)的CD4T细胞中的IL-2诱导的PStat5核转位:在 37°C用来自5个￥?(￥?63、￥?68、￥?69、￥?74和￥?75)和来自用作对照的3个册的3%或1%血浆 处理从4名健康供体纯化的静息⑶4T细胞30分钟。在指定时，在37°C用2nM IL-2刺激它们15 分钟。显示了 IL-2刺激之前（蓝色点）和之后(红色点）的整个⑶4T细胞(a)中和⑶4+⑶25+T 细胞(b)中在核PStat5方面呈阳性的细胞的百分比，均值和SD。在用兔抗人PStat5(pY694)， 接着用驴抗兔IgG-Die light 405的间接染色后使用激光扫描共焦显微术（LSM 700， Zeiss)观察PStat5的胞内定位。用山羊抗人b-微管蛋白，接着用驴抗山羊IgG-AF555处理染 色总⑶4T细胞。用小鼠抗人⑶25，接着用驴抗小鼠 IgG-AF488靶向⑶25+⑶4T细胞。
[0066] 图ll:PLA2sGIB抑制健康供体(HD)的CD4T细胞中的IL-4诱导的PStat6核转位:在 37°C用来自5个￥?(￥?63、￥?68、￥?69、￥?74和￥?75)和来自用作对照的3个册的3%或1%血浆 处理从4名健康供体纯化的静息⑶4T细胞30分钟。在指定时，在37°C用2nM IL-4刺激它们15 分钟。显示了 IL-2刺激之前(蓝色点）和之后(红色点）的整个⑶4T细胞在核PStat6方面呈阳 性的细胞的百分比，均值和SD。在用兔抗人PStat6(pY694)，接着用山羊抗兔IgG-AF488的间 接染色后使用激光扫描共焦显微术(LSM 700,2&^)观察？5七&七6的胞内定位。用小鼠抗人 a-微管蛋白，接着用山羊抗小鼠 IgG-AF647染色总⑶4T细胞。
[0067] 图12:突变体pPLA2GIB H48Q的活性的缺乏。
[0068]图13:野生型克隆猪PLA2GIB和其突变体H48Q的活性比较。A:异常膜微域(aMMD)的 诱导;B:对IL-7诱导的磷酸STAT5核转位(pSTAT5的NT)的影响。
[0069] 图14显示了用与Sepharose珠偶联的山羊抗PLA2G1B抗体处理来自病毒血患者的 血浆。绿色:VP68;粉红色:VP69;蓝色:VP LJT。在处理（30min室温）后，测试血浆：
[0070] a.在用霍乱毒素 B(CtxB-AF488)染色后测量显示异常MMD/细胞的⑶4T细胞的百分 比
[0071] b.在IL-7刺激后测量PSTAT5的核转位，并且计数阳性核的百分比。
[0072] 图15:抗PLA2GIB抗体对aMMD诱导和对NT pSTAT5的抑制的影响。
[0073] 图16:可溶性PLA2G1B小鼠受体（sMR)抑制人PLA2GlB(huPLA2GlB)对响应来自健康 供体的CD4T细胞的IL-7的活性，表示为PStat5的核转位方面呈阳性的细胞的百分比。响应 的恢复计算为：
[0074] l〇〇x( %P〇s细胞huGlB+sMR-%Pos细胞huGlB)/( %Pos细胞賴er%Pos细胞hUQB)
[0075] 图17显示了来自CD4非响应者（CD4-NR)患者的血浆诱导HD CD4T细胞中的异常 MMD- (a)使用结构照明显微术（Structured Illumination Microscopy) (SIM)获得的用来 自CD4-NR患者的血浆（1 % )处理的HD CD4T细胞的图像。用霍乱毒素 B(CtxB-AF488)染色 MMD。显示了代表性⑶4T细胞的Z堆叠图像的投影。在IL-7刺激(2nM，15min)后，没有图像修 改(右边）。（13)用来自5名⑶4-NR患者(蓝色曲线，均值和SD)和来自代表性病毒血患者(红色 曲线）的血浆获得的剂量曲线响应(0. 〇〇〇 1 %至1 % )。在HD CD4T细胞的表面上诱导的异常 MMD的数目。
[0076] 发明详述
[0077] 本发明涉及用于调控有此需要的受试者中的免疫系统的组合物和方法。更具体 地，本发明公开了 GIBSPLA2作为免疫应答的关键内源因子的鉴定，并且提供了基于此因子 的调控的新治疗和诊断方法和组合物。
[0078]本发明的假设是感染HIV的患者中的免疫系统的长期活化是异常的，并且将CD4T 细胞驱动为活化/分化的异常状态，其不响应参与控制免疫防御的许多方面和CD4区室的稳 态的gamma-c细胞因子，尽管实际上来自外周区室的超过99.5 %⑶4T细胞是未感染的。发明 人评估了此假设，并且本发明阐明了活化的此异常状态的性质和重要性。
[0079]更具体地，在第一个方面，本发明证明了可以如下汇总此状态的特征：1)在任何刺 激前，感染HIV的病毒血患者(VP)中的所有CD4T细胞在其表面上拥有许多大MMD，2)这些异 常MMD隔离所有细胞的IL-7Ralpha和gamma-c链，并且3)链在异常MMD中的此隔绝改变了它 们诱导功能性信号体形成的能力，4)导致STAT5磷酸化的减速和降低和5)磷酸-STAT5核输 入的降低。在VP CD4T淋巴细胞表面上的预先存在的MMD的此异常模式具有多种后果，并且 是解释感染HIV的患者中的免疫缺陷的各种表现的基本机制。IL-7响应性的丧失是部分解 释了观察到的CD4淋巴细胞减少的重要因素。VP中的这些细胞的持续丧失（由于其对凋亡的 敏感性和其被低水平但连续的病毒增殖的破坏)不能被补偿，尽管有升高的IL-7水平。另 外，由于异常MMD隔离非功能性状态的所有gamma-c链，这阻断了此家族中的其它细胞因子 的功能。
[0080]本发明进一步公开了关键的内源因子的鉴定，所述内源因子造成感染的受试者中 的免疫系统的此异常状态，并且更一般地，造成各种病理生理学状况中的免疫应答的激烈 调控。实际上，显示了来自VP的血浆样品含有称作RIF的活性，其能够诱导健康供体(HD) CD4T淋巴细胞的异常活化。在检查的VP的所有血浆样品中找到RIF。此活性的病理生理学意 义通过其在HIV控制者(Controller) (HIC)患者中的缺乏得到证明，其中IL-7/IL-7R系统是 正常的，并且免疫活化是有益的。RIF在ART患者的血浆中也是缺乏的，所述ART患者已经降 低其免疫活化，修复IL-7R功能并且恢复⑶4计数>500/mm 3(5)。
[0081 ]如此，RIF代表一种控制免疫应答(特别是经由调控⑶4T淋巴细胞）的主要因素。值 得注意的是，RIF诱导HD CD4T细胞中的异常活化模式，其与纯化的VP CD4T细胞中离体直接 观察到的模式不能区分。本发明进一步显示了RIF是来自I B组的分泌性磷脂酶A2 ("PLA2GIB"）。本申请中公开的结果显示了（i)PLA2GIB的过表达导致有力的免疫抑制，并且 (ii)抑制PLA2GIB导致免疫功能的明显增加或刺激。GIBsPLA2抑制剂能够校正来自受试者 的血浆中的免疫细胞的不适当状态，并且因此可以用于治疗(例如预防，校正)哺乳动物中 的免疫缺陷或免疫病症。GIBsPLA2抑制也可以诱导、刺激或帮助维持CD4T细胞计数和功能， 并且由此帮助刺激患者中的有效的免疫应答。特别地，在感染HI V的患者中，ART可以被省 下，或者可以被推迟，是要在患者免疫防御和病毒之间达到的平衡。如果在感染后非常早期 给出ART以与RIF抑制剂组合，如由最近的研究提示，这会防止免疫系统的任何RIF诱导的变 化。另外，在一些目前的ART失败的背景中，在延长的ART后具有低CD4计数的患者可以受益 于这些抑制剂。因而，本发明提供了用于通过调控受试者中的GIBsPLA2表达或活性治疗受 试者的方法。更具体地，本发明提供了用于调控有此需要的受试者中的免疫应答的方法，其 包括调控所述受试者中的GIBsPLA2活性或表达。
[0082]实施例中提供的数据还证明了受试者的血浆中的RIF的存在指示⑶4T细胞的HIV-诱导的发病机制状态。因而，除了别的之外，本发明提供了通过检测受试者的血浆中的RIF 水平监测和/或诊断受试者中的HIV感染的方法。
[0083]实施例中提供的数据进一步证明了受试者的T细胞上的膜微域(MMD)的数目和/或 大小指示CD4T细胞的HIV-诱导的发病机制状态。因而，除了别的之外，本公开还提供了监测 和/或诊断受试者中的HIV感染的方法，其通过测量受试者的T细胞上的膜微域(MMD)的数目 和/或大小进行。
[0084]实施例中提供的数据还指示RIF在创建和/或维持感染HIV的受试者中的CD4T细胞 疾病状态的作用。因而，本公开还提供了用于鉴定候选HIV治疗剂的方法，其包括在存在药 剂的情况下测量RIF诱导的CD4T细胞活化。在一些实施方案中，方法包括比较在存在药剂的 情况下的RIF诱导的CD4T细胞活化水平与在缺乏药剂的情况下的RIF诱导的CD4T细胞活化 水平。
[0085] 定义
[0086] 如对核酸或蛋白质序列应用，术语"序列同一性"指使用标准化算法，诸如Smith-Waterman算法（Smith and Waterman(1981)J Mol Biol 147:195_197)、CLUSTALW (Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Res 22:4673-4680)或BLAST2(Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res 25:3389-3402)比对至少两种序列之间的核苷酸或氨基酸残基 匹配的量化(通常是百分比）。可以以标准化且可重复的方式使用BLAST2以在序列之一中插 入缺口以优化比对并且实现它们之间的更有意义的比较。
[0087] 如本文中使用，"治疗/处理"指试图改变治疗的个体的天然过程的临床干预，并且 可以为了预防或治愈目的实施。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减 轻症状、疾病的任何直接或间接病理学后果的降低、预防转移、降低疾病进展率、改善或减 轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的组合物和方法延迟疾 病或病症的形成或者延迟疾病或病症的进展。
[0088] 如本文中使用，术语"分离的"指从其天然环境的组分取出，与它们天然联合的其 它组分分离或分开，并且至少60 %不含，优选75 %不含，且最优选90 %不含所述其它组分的 分子(例如核酸或氨基酸）的分子。例如，"分离的"多肽(或蛋白质)是与其天然环境的组分 分开，并且优选根据例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦（IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离 子交换或反相HPLC)迀移测定，纯化到大于90%或95%纯度的多肽。"分离的"核酸指与其天 然的环境的组分分开和/或在不同构建体(例如载体、表达盒、重组宿主等）中装配的核酸分 子。
[0089] "编码抗GIBsPLA2抗体的核酸"指编码抗体重链和轻链(或其片段）的一个或多个 核酸分子，包括在单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个 或多个位置上的此类核酸分子。
[0090 ] "受试者"指哺乳动物。哺乳动物的例子包括人和非人动物，诸如但不限于家养动 物(例如牛、山羊、猫、犬和马）、非人灵长类(诸如猴）、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠）。
[0091] "免疫应答的调控"在本发明的上下文内指免疫细胞，优选白细胞(例如T淋巴细 胞、B淋巴细胞、NK、NKT细胞、巨噬细胞、树突细胞）的量或活性或比率的任何修饰。在一个具 体的实施方案中，调控免疫应答包括调控T淋巴细胞，优选CD4-T淋巴细胞的量或活性。 [0092] 不应状态诱导因子(RIF)或磷脂酶A2组IB
[0093] 术语RIF与磷脂酶A2组IB、GIBsPLA2(或PLA2GIB)可互换使用。磷脂酶A2组IB是一 种具有约15kDa MW和约6.5至约8.0的等电点的分泌性蛋白质。
[0094]在本发明的上下文内，术语"GIBsPLA2"或"磷脂酶A2组IB"指来自任何脊椎动物来 源，包括哺乳动物，诸如灵长类（例如人）和啮齿类（例如小鼠和大鼠）的任何天然的 GIBsPLA2蛋白，除非另有指示。术语涵盖"全长"未加工的GIBsPLA2，以及源自细胞内部或外 部的加工的GIBsPLA2的任何形式。术语还涵盖天然存在的GIBsPLA2变体，例如剪接变体或 等位变体。
[0095] 在下文显示了例示性的GIBsPLA2的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2) 〇MKLLVLAVLL TVAAADSGIS PRAVWQFRKM IKCVIPGSDP FLEYNNYGCY CGLGGSGTPV DELDKCCQTH DNCYDQAKKL DSCKFLLDNP YTHTYSYSCS GSAITCSSKN KECEAFICNC DRNAAICFSK APYNKAHKNL DTKKYCQS
[0096] SEQ ID N0:2的氨基酸1至15(加下划线）是信号序列，并且SEQ ID N0:2的氨基酸 16至22(为粗体)是前肽序列。成熟的蛋白质对应于SEQ ID N0:2的氨基酸残基23-148,其是 例示性的经加工的人GIBsPLA2蛋白。
[0097] 天然存在的变体包括包含SEQ ID N0: 2的序列，或者SEQ ID N0: 2的氨基酸残基 23-148的序列的任意蛋白，且具有一个或几个(通常1、2或3)氨基酸残基的一个或多个氨基 酸取代、添加和/或缺失，优选一个或几个(通常1、2或3)氨基酸残基的不超过10个独特的氨 基酸取代、添加和/或缺失。典型的天然存在的变体保留SEQ ID N0:2的生物学活性。
[0098]在这方面，在一些实施方案中，GIBsPLA2具有至少一种活性，其选自在来自健康受 试者的CD4T细胞中诱导膜微域(MMD)的形成，或者使健康受试者的CD4T细胞对白介素信号 传导不应，诸如对IL-2信号传导不应或对IL-7信号传导不应。
[0099]在一些实施方案中，诱导MMD的形成包括增加健康受试者的⑶4T细胞上的MMD数目 到每个细胞至少约80，每个细胞至少约80，每个细胞至少约90，每个细胞至少约100，每个细 胞至少约110,或每个细胞至少约120。在一个非限制性的优选实施方案中，诱导MMD的形成 包括增加健康受试者的CD4T细胞上的MMD数目到每个细胞超过100。
[0100]在一些实施方案中，诱导MMD的形成包括刺激比在其它情况下存在于⑶4T细胞上 的MMD大的MMD的形成。在一些实施方案中，诱导较大的MMD的形成包括刺激具有至少100nm、 至少llOnm、至少120nm、至少130nm、或至少140nm的直径的MMD的形成。在一个非限制性的优 选的实施方案中，诱导较大的MMD的形成包括刺激具有大于120nm的直径的MMD的形成。
[0101] 在一些实施方案中，使健康受试者的CD4T细胞对白介素-7信号传导不应包括所述 细胞中的STAT5A和/或B磷酸化降低至少约10 %、至少约20 %、至少约30 %或至少约40 %。在 一些实施方案中，使健康受试者的CD4T细胞对白介素-7信号传导不应包括将磷酸-STAT5A 和/或磷酸-STAT5B的核转位速率降低至少约20%、至少约30%、至少约40%或至少约50%。
[0102] 可以通过本领域中已知的任何合适的方法测量GIBSPLA2活性，如实施例中例示或 后来开发。可以使用例如配体募集测定法、免疫测定法和/或酶促测定法在血浆样品，诸如 例如分级的血浆样品中测量GIBsPLA2活性。
[0103] 在一个具体的实施方案中，术语GIBSPLA2指人蛋白质，特别是包含或具有SEQ ID N0:2的蛋白质，或其天然存在的变体。
[0104] 根据本公开的GIBsPLA2可以是分离的、纯化的和/或重组的。在某些实施方案中， 代替GIBsPLA2蛋白或在GIBsPLA2蛋白外，本发明可以使用编码GIBsPLA2的核酸。核酸可以 是DNA或RNA，单链或双链。
[0105] 例示性的编码GIBSPLA2的核酸序列在下文的SEQ ID N0:1中显示：
[0107] 编码GIBsPLA2的备选核酸分子包括源自遗传密码简并性的SEQ ID N0:1的任何变 体，以及在严格条件下与SEQ ID N0:1杂交，更优选与SEQ ID N0;1具有至少80%、85%、 90%、95%或更多序列同一性，并且编码6四8?1^2蛋白的任何序列。
[0108] 生成GIBSPLA2的方法
[0109] 可以通过任何常规已知的蛋白质表达方法和纯化方法生成GIBsPLA2。例如：（i)用 于合成肽的方法；（ii)用于从活体或培养的细胞纯化和分离它们的方法;或（iii)通过使用 遗传重组技术生成它们的方法；以及其组合等等（例如，例如Molecular Cloning (Sambrook，J·，Fritsch，E·F·，Maniatis，T·，Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989)和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F.M·，John Wiley and Sons，Inc. (1989)中描述的标准技术）。
[0110]在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于生成GIBsPLA2的方法，其通过在宿主 细胞中表达编码核酸，并且收集或纯化GIBsPLA2进行。在这方面，本发明还描述了重组宿主 细胞，其包含编码GIBsPLA2的核酸。此类细胞可以是原核（诸如细菌）或真核（诸如酵母细 胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞）。核酸可以置于任何合适的调节序列，诸如启动 子、终止子等的控制下。或者，可以在宿主细胞在通过内源启动子驱动表达的位置中中插入 核酸。用于在细胞中插入核酸的技术是本领域中公知的。
[0111] GIBSPLA2 调控
[0112]本发明提供了新的方法，其包括调控有此需要的受试者中的GIBSPLA2。术语"调 控"指受试者中的GIBsPLA2的水平(例如表达)或活性的任何修饰。还有，调控指GIBsPLA2的 水平或活性的升高或降低。更优选地，调控指与非调控的情况相比变化至少10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。因此，抑制GIBsPLA2指降低至少 10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多6188?1^2水平或活性，以及完全阻断或抑制 GIBsPLA2水平或活性。相反，刺激GIBsPLA2指提高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、 70 %、80 %或更多GIBsPLA2水平或活性。根据情况，调控可以是瞬时的，持续的或永久的。还 有，调控活性包括调控受试者中，特别是体液中的GIBsPLA2量，调控蛋白质的效能(例如通 过调控受试者中的辅因子或底物的水平），以及调控由GIBsPLA2生成的降解产物的水平或 活性。
[0113] GIBsPLA2 抑制
[0114] 在一个具体的实施方案中，本发明提供了用于抑制受试者中的GIBsPLA2的组合物 和方法。GIBsPLA2抑制可以通过使用GIBsPLA2抑制剂获得，即抑制GIBsPLA2表达或活性的 任何化合物。GIBsPLA2抑制剂包括表达抑制剂、诘抗剂、隔离剂(sequestrators)、或祀标掩 蔽化合物。GIBsPLA2抑制剂的优选类型包括GIBsPLA2配体(共价或非共价）、抗GIBsPLA2抗 体(或其片段和衍生物）、编码抗GIBsPLA2抗体(或其片段和衍生物）的核酸、抑制性核酸、 肽、或小药物、或其组合。或者/另外，GIBsPLA2抑制可以通过针对GIBsPLA2抗原对受试者接 种疫苗，使得抗体由需要PLA2-GIB抑制的受试者生成获得。
[0115] 针对GIBsPLA2的抗体
[0116] GIBsPLA2抑制剂的具体例子是特异性结合GIBsPLA2的抗体。
[0117] 抗体可以是合成的、单克隆、或多克隆，并且可以通过本领域中公知的技术生成。 此类抗体经由抗体的抗原结合位点特异性结合（与非特异性结合形成对比KGIBSPLA2多 肽、片段、变体、融合蛋白等可以在生成与其具有免疫反应性的抗体中作为免疫原采用。更 具体地，多肽、片段、变体、融合蛋白等含有引发抗体形成的抗原决定簇或表位。
[0118] 这些抗原决定簇或表位可以是线性或构象的（不连续的）。线性表位由多肽的氨基 酸的单一部分构成，而构象或不连续表位由在蛋白质折叠时变得紧密接近的来自多肽链的 不同区域的氨基酸部分构成（C.A.Janeway,Jr.and P.Travers，Immuno Biology 3:9 (Garland Publishing Inc.，2nd ed.1996))。由于折叠的蛋白质具有复杂的表面，可用的 表位数目是相当大量的;然而，由于蛋白质的构象和位阻，实际上结合表位的抗体的数目小 于可用表位的数目（C.A.Janeway Jr.and P.Travers，Immuno Biology 2:14(Garland Publishing Inc.，2nd ed. 1996))。可以通过本领域中已知的任何方法鉴定表位。多克隆和 单克隆抗体二者都可以通过常规技术制备。
[0119] 本发明的优选抗体针对GIBsPLA2表位，和/或已经通过用包含GIBsPLA2表位的多 肽免疫生成，所述GIBsPLA2表位选自：成熟GIBsPLA2蛋白、包含SEQ ID N0:2的至少8个连续 氨基酸残基的GIBsPLA2片段(或SEQ ID如:2的天然变体的相应残基），所述片段包含至少 氨基酸70、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71或其组合。本发明的优选的 抗体结合SEQ ID NO:2的氨基酸残基50-71或SEQ ID NO:2的天然变体的相应残基之间包含 的表位。
[0120] 术语"抗体"意图包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段，诸如F(ab'）2和Fab片段、 单链可变片段(scFv)、单域抗体片段(VHH或纳米抗体(Nanobodies))、二价抗体片段(双抗 体），以及任何重组和合成生成的结合配偶体、人抗体或人源化抗体。
[0121] 优选地，若抗体以大于或等于约107M-1的Ka结合GIBsPLA2,则它们限定为特异性 结合。可以容易地使用常规技术，例如那些由Scatchard et al · ,Αηη.Ν. Y.Acad. Sci · ,51: 660( 1949)描述的技术测定抗体的亲和力。
[0122] 可以使用本领域中公知的规程容易地从多种来源，例如马、牛、驴、山羊、绵羊、犬、 鸡、兔、小鼠或大鼠生成多克隆抗体。一般地，通常经由胃肠外注射，对宿主动物施用适当缀 合的纯化的GIBsPLA2或基于GIBsPLA2的氨基酸序列的肽。可以经由使用佐剂，例如弗氏完 全或不完全佐剂增强GIBsPLA2的免疫原性。在加强免疫后，收集血清的小样品，并且测试对 GIBsPLA2多肽的反应性。可用于此类测定的各种测定法的例子包括那些记载于 Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane(eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中的；以及诸如对流免疫电泳(CIEP)、放射性免疫测定法、放射性 免疫沉底、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、点印迹测定法、和三明治式测定法的规程。参见美 国专利No · 4，376，110和4，486，530。
[0123] 可以使用公知的规程容易地制备单克隆抗体。参见例如美国专利No.RE 32,011， 4，902,614,4,543,439和4,411，993;Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses ,Plenum Press，Kennett，McKeam,and Bechtol (eds. ),1980中描述的规程。
[0124] 例如，以约3周时间间隔在任选地存在佐剂的情况下用分离的且纯化的野生型或 突变体GIBsPLA2蛋白或缀合的GIBsPLA2肽腹膜内注射宿主动物，诸如小鼠至少一次，且优 选至少两次。然后，通过常规的点印迹技术或抗体俘获(ABC)测定小鼠血清以测定哪个动物 是最佳融合的。约2至3周后，对小鼠给予蛋白质或肽的静脉内加强。随后，处死小鼠，并且遵 循建立的方案将脾细胞与商品化的骨髓瘤细胞，诸如Ag8.653(ATCC)融合。简言之，在培养 基中将骨髓瘤细胞清洗几次，并且以约3个脾细胞与1个骨髓瘤细胞的比率与小鼠脾细胞融 合。融合剂可以是本领域中使用的任何合适的药剂，例如聚乙二醇(PEG)。将融合铺开到含 有培养基的板中，所述培养基容许融合细胞的选择性生长。然后，可以容许融合的细胞生长 约8天。收集来自所得的杂交瘤的上清液，并且添加到首先用山羊抗小鼠 Ig包被的板。在清 洗后，将标记物，诸如经标记的GIBsPLA2多肽添加到每孔，接着温育。随后，可以检测阳性 孔。可以在大批培养物中培养阳性克隆，随后在蛋白A柱(Pharmacia)上纯化上清液。
[0125]可以使用备选技术，诸如那些由Alting-Mees et al ·，"Monoclonal Antibody Expression Libraries : A Rapid Alternative to Hybridomas"，Strategies in Molecular Biology 3:1-9( 1990)(其通过提及并入本文)描述的技术生成本公开的单克隆 抗体。类似地，可以使用重组DNA技术构建结合配偶体以掺入编码特定结合抗体的基因的可 变区。此类技术记载于Larrick et al.，Biotechnology,7:394(1989)。
[0126]本发明也涵盖此类抗体的抗原结合片段(其可以通过常规的技术生成）。此类片段 的例子包括但不限于Fab和F(ab'）2片段。还提供了通过遗传工程技术生成的抗体片段和衍 生物。
[0127] 本公开的单克隆抗体包括嵌合抗体，例如鼠单克隆抗体的人源化形式。此类人源 化抗体可以通过已知的技术制备，并且当对人施用抗体时提供降低的免疫原性的优点。在 一个实施方案中，人源化单克隆抗体包含鼠抗体的可变区（或仅其抗原结合位点）和源自人 抗体的恒定区。或者，人源化的抗体片段可以包含鼠单克隆抗体的抗原结合位点和源自人 抗体的可变区片段(缺乏抗原结合位点）。用于生成嵌合和别的工程化单克隆抗体的规程包 括那些记载于Riechmann et al.(Nature 332:323，1988)，Liu et al.(PNAS 84:3439， 1987) ，Larrick et al.(Bio/Technology 7: 934,1989)，以及Winter and Harris(TIPS 14:139，May,1993)的。转基因生成抗体的规程可以参见GB 2，272,440,美国专利No.5,569， 825和5,545,806。
[0128] 可以使用通过遗传工程方法生成的抗体，诸如可以使用标准重组DNA技术生成的 嵌合和人源化单克隆抗体(其包含人和非人部分两者）。此类嵌合和人源化的单克隆抗体可 以使用本领域中已知的标准DNA技术，例如使用记载于Robinson et al. International Publication No.WO 87/02671；Akira,et al.European Patent Application 0184187； Taniguchi,M.,European Patent Application 0171496；Morrison et al.European Patent Application 0173494；Neuberger et al.PCT International Publication 1'1〇.?0 86/01533;〇&13；[117 6七&1.美国专利1'10.4,816,567;0&13；[117 6七&1上111'0卩6已11 Patent Application 0125023；Better et al.,Science 240:1041 1043,1988；Liu et al.，PNAS 84:3439 3443，1987;Liu et al.，J.Immunol.l39:3521 3526，1987;Sun et al.PNAS 84:214 218,1987；Nishimura et al., Cane . Res .47:999 1005,1987；ffood et al.,Nature 314:446 449,1985；and Shaw et al.,J.Natl.Cancer Inst.80:1553 1559, 1988) ；Morrison,S.L.,Science 229:1202 1207,1985；0i et al.,BioTechniques 4:214, 1986;Winter 美国专利No.5,225,539;Jones et al·, Nature 321:552 525,1986; Verhoeyan et al·, Science 239:1534,1988;以及 Beidler et al.,J.Immunol.l41:4053 4060,1988的方法通过遗传工程生成。
[0129] 关于合成和半合成抗体，此类术语意图覆盖但不限于抗体片段、同种型变换抗体、 人源化抗体(例如小鼠-人，人-小鼠）、杂合物、具有复数种特异性的抗体、和完全合成的抗 体样分子。
[0130] 对于治疗应用，具有人恒定区和可变区的"人"单克隆抗体经常是优选的，从而最 小化患者针对抗体的免疫应答。此类抗体可以通过免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因动 物生成。参见Jakobovits et al.Ann NY Acad Sci 764:525-535(1995)。
[0131] 也可以使用从源自受试者的淋巴细胞的mRNA制备的免疫球蛋白轻链和重链cDNA 通过构建组合免疫球蛋白文库，诸如Fab噬菌体展示文库或scFv噬菌体展示文库制备针对 GIBsPLA2多肽的人单克隆抗体。参见例如McCafferty et al.PCT公开文本W0 92/01047; Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581 597;及Griffths et al.(1993)EMB0 J 12:725 734。另外，可以通过突变已知的人抗体产生抗体可变区的组合文库。例如，可以通过例如使 用随机改变的诱变的寡核苷酸突变已知结合GIBsPLA2的人抗体的可变区以产生突变可变 区的文库，然后可以筛选所述文库以结合GIBsPLA2。诱导免疫球蛋白重链和/或轻链的CDR 区内的随机诱变的方法，杂交随机化的重链和轻链以形成配对的方法和筛选方法可以参见 例如Barbas et al.PCT公开文本WO 96/07754;Barbas et al.(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:4457 4461。
[0132] 可以通过展示包装群体(优选源自丝状噬菌体)表达免疫球蛋白文库，以形成抗体 展示文库。特别适合于用于产生抗体展示文库的方法和试剂的例子可以参见例如Ladner 6七&1.美国专利如.5,223,409;1(&即6七&1.?(：1'公开文本机）92/18619 ;0〇￥616七&1.?(^ 公开文本TO 91/17271 ;Winter et al.PCT公开文本TO 92/20791 ;Markland et al.PCT公 开文本TO 92/15679;Breitling et al.PCT公开文本TO 93/01288;McCafferty et al.PCT 公开文本TO 92/01047;Garrard et al.PCT公开文本TO 92/09690;Ladner et al.PCT公开 文本TO 90/02809 ;Fuchs et al .(1991 )Bio/Technology 9:1370 1372 ;Hay et al .(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81 85；Huse et al.(1989)Science 246:1275 1281； Griffths et al.(1993)supra；Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889 896； Clackson et al.(1991)Nature 352:624 628；Gram et al.(1992)PNAS 89:35763580； Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9:1373 1377；Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:4133 4137;和Barbas et al.(1991)PNAS 88:79787982。一旦在展示包装（例如丝 状噬菌体）的表面上展示，筛选抗体文库以鉴定和分离表达结合GIBsPLA2多肽的抗体的包 装。在一个优选的实施方案中，文库的初步筛选牵涉用固定化的GIBsPLA2多肽淘选，并且选 择表达结合固定化的G IBsPLA2多肽的抗体的展示包装。
[0133] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及组合物，其包含抗GIBsPLA2抗体(或其片段 或衍生物)和药学可接受赋形剂。
[0134] 存在的抗磷脂酶A2-GIB单克隆抗体包括Mab CH-7(Labome)，MAB5018(Labome)， EPR5186(Genetex);LS-C138332(Lifespan)或CABT-17153MH(creative biomart)。多克隆 抗体的例子包括例如来自GeneTex的N1C3。如上文指示，本发明的优选的抗GIBsPLA2抗体结 合成熟的GIBsPLA2,甚至更优选包含氨基酸的GIBsPLA2域内包含的表位，所述氨基酸选自 氨基酸70、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71或其组合。本发明的优选抗 体结合SEQ ID N0:2的氨基酸残基50-71或SEQ ID N0:2的天然变体的相应残基间包含的表 位。
[0135] 在一个备选的实施方案中，本发明涉及并且使用组合物，其包含编码抗GIBsPLA2 抗体(或其片段或衍生物)的核酸和药学可接受赋形剂。
[0136] 抑制性核酸
[0137] 在一个备选的实施方案中，GIBsPLA2抑制剂是抑制性核酸，即抑制GIBsPLA2基因 或蛋白质表达的任何核酸分子。优选的抑制性核酸包括反义核酸、短干扰RNA(siRNA)、小发 夹RNA(shRNA)、微小RNA、适体、或核酶。在一个具体的实施方案中，抑制性核酸是阻止 GIB s P L A 2 m R N A翻译的小干扰R N A。在另一个具体的实施方案中，抑制性核酸是阻止 GIBsPLA2mRNA翻译的反义寡核苷酸。在另一个具体的实施方案中，抑制性核酸是阻止 G IBsPLA2mRNA翻译的小发夹RNA。
[0138] siRNA包含感兴趣的多核苷酸的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA，使得 单一转录物(双链RNA)具有来自靶基因的有义和互补反义序列两者。可以使用可获自例如 万维网上的Amb ion网址的s iRNA设计计算机程序设计s iRNA的核苷酸序列。
[0139] 在一些实施方案中，反义寡核苷酸或siRNA的长度小于或等于10个核苷酸。在一些 实施方案中，反义寡核苷酸或siRNA的长度与天然存在的转录物一样长。在一些实施方案 中，反义寡核苷酸或siRNA具有18-30个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸和siRNA 的长度小于25个核苷酸。
[0140] 优选的抑制性核酸分子包含具有与GIBsPLA2基因或RNA的区域完全互补的核苷酸 序列的域。此类域通常含有4至20个核苷酸，容许特异性杂交和基因转录或RNA翻译的最佳 抑制。抑制性核酸的序列可以直接源自编码GIBsPLA2的基因的序列，诸如SEQIDN0:1。或 者/另外，抑制性核酸可以与GIBsPLA2基因或RNA中的调节元件，诸如启动子，剪接位点等杂 交，并且防止其有效调节。
[0141]本发明的抑制性核酸分子的具体例子包括分离的单链核酸分子，其由SEQ ID N0: 1的10至50个连续的核苷酸组成。本发明的抑制性核酸分子的具体例子是反义核酸，其由以 下核苷酸序列或其完全互补链组成：
[0152] 肽和小药物
[0153] 在一个备选的实施方案中，GIBsPLA2抑制剂是抑制GIBsPLA2活性的肽或小药物。 肽或小药物通常是选择性结合GIBsPLA2的分子，或GIBsPLA2的底物，或GIBsPLA2的辅因子， 或GIBsPLA2途径的降解产物或代谢物。
[0154] 优选地，肽含有3至20个氨基酸残基，并且其序列可以与GIBsPLA2域(诱饵肽)或者 GIBsPLA2底物、辅因子、降解产物或代谢物的域相同。本发明的优选的肽含有SEQ ID N0: 2 (或SEQ ID N0:2的天然变体的相应序列）的4至30个连续氨基酸残基。本发明的最优选的肽 包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然变体的相应序列）的5至25个连续的氨基酸残基， 并且进一步包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然变体的相应序列）的以下氨基酸残基 的至少一个:氨基酸7〇、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71或其组合。本 发明的肽的具体例子是包含以下序列之任一的小于25个氨基酸的肽：
[0164] 本发明的肽可以包含肽、非肽和/或经修饰的肽键。在一个具体的实施方案中，肽 包含至少一个肽模拟键(peptidomimetic bond)，其选自亚甲基(-CH2-)或磷酸根(_P〇2_)基 团、仲胺(-順-)或氧(-0-)、3]^1^-氮杂肽(323口6口1^(168)、3]^1^-经基肽、1'|-经基肽、氨基膦 酸酯（phosphonamidates)、缩酸酸肽（depsipeptides)、羟基亚甲基（hydroxymethylenes)、 羟基乙稀（hydroxyethylenes)、二羟基乙稀（dihydroxyethylenes)、羟基乙胺 (hydroxyethylamines)、逆反式肽（retro-inverso peptides)、亚甲基氧基 (methyleneoxy)、酮亚甲基（cetomethylene)、酯、次膦酸盐（phosphinates)、次膦酸 (phosphinics)或膦酸酰胺(phosphonamides)的插入。还有，肽可以包含经保护的N端和/或 C端官能，例如通过酰化，和/或酰胺化和/或酯化。
[0165] 可以通过本领域中本身已知的技术，诸如化学、生物学和/或遗传合成生成本发明 的肽。
[0166] 分离形式的这些肽中的每种代表本发明的一个具体目的。
[0167] 优选的小药物是选择性结合GIBsPLA2的烃化合物。
[0168] 优选地，通过方法可获得小药物和肽，所述方法包括：（i)使测试化合物与 GIBsPLA2或其片段接触，（ii)选择结合GIBsPLA2或所述其片段的测试化合物，并且（iii)选 择抑制GIBsPLA2活性的（ii)的化合物。此类方法代表本发明的一个具体的目的。
[0169] 优选地，通过方法可获得小药物和肽，所述方法包括：（i)使测试化合物与 GIBsPLA2底物、辅因子或降解产物，或其片段接触，（ii)选择结合所述GIBsPLA2底物、辅因 子或降解产物，或其片段的测试化合物，并且（i i i)选择抑制GIBsPLA2活性的（i i)的化合 物。此类方法代表本发明的一个具体的目的。
[0170] GIBsPLA2可溶性受体
[0171] 在一个备选的实施方案中，GIBsPLA2抑制剂是GIBsPLA2受体的可溶性形式。此类 可溶性受体化合物能够结合GIBsPLA2,从而通过起诱饵或掩蔽剂作用抑制其活性。
[0172] 此类抑制剂的一个具体实施方案是人或鼠 GIBsPLA2受体，或其GIBsPLA2结合片段 的可溶性形式。
[0173] 分别在SEQ ID N0:22和23中描述了鼠和人可溶性受体的氨基酸序列。因此，术语 可溶性受体涵盖包含SEQ ID N0:22或23序列的整个或片段的任何GIBsPLA2结合多肽。
[0174] GIBsPLA2结合片段指特异性结合PLA2GIB的此类多肽的任何片段，其包含优选至 少5个其连续氨基酸残基，更优选至少8、10或12。受体分子的特异性结合指示受体分子比对 PLA2-IIA或IID以更高的亲和力（例如至少5倍)结合PLA2GIB。最优选地，如上文定义的片段 包含小于50个氨基酸残基。
[0175] GIBsPLA2结合多肽的例子不限于包含以下氨基酸序列中的任一种的多肽：
[0184] SEQIDN0:24-26源自人可溶性PLA2GIB受体的序列，而SEQIDN0:27-31源自鼠 可溶性PLA2GIB受体的序列。
[0185]疫苗接种
[0186] 在一个备选(或累积)的实施方案中，通过用GIBSPLA2抗原接种(或免疫)受试者获 得受试者中的GIBsPLA2的抑制。由于此类疫苗接种或免疫，受试者产生抑制GIBsPLA2的抗 体(或细胞）。具体地，GIBsPLA2抗原(例如免疫原性GIBsPLA2,其基本上无生物学活性)的注 射可以在治疗的受试者中产生抗体。这些抗体会针对过量的GIBsPLA2表达提供保护，并且 可以作为免疫疗法或疫苗预防使用。
[0187] 如此，本发明的目的在于对受试者接种疫苗的方法，其包括对受试者施用 GIBsPLA2 抗原。
[0188] 本发明的又一个目的涉及GIBSPLA2抗原，用于对有此需要的受试者接种疫苗的用 途。
[0189]在一个具体的实施方案中，用于疫苗接种的GIBsPLA2抗原是失活的免疫原性分 子，所述失活的免疫原性分子诱导受试者中针对GIBsPLA2的免疫应答。可以例如通过化学 或物理改变GIBsPLA2或通过突变或截短蛋白质，或者这两种方式获得失活;并且可以由于 失活和/或通过进一步缀合蛋白质与合适的载体或半抗原，诸如KLH、HAS、聚组氨酸、病毒变 性毒素(anatoxin)等，和/或通过聚合等获得免疫原性。如此，可以化学或物理修饰抗原，例 如以改善其免疫原性。
[0190] 在一个优选的实施方案中，本发明的GIBsPLA2抗原包含GIBsPLA2或其含有表位的 片段或模拟位。
[0191] 在一个具体的实施方案中，GIBsPLA2抗原包含全长GIBsPLA2蛋白。在又一个具体 的实施方案中，GIBsPLA2抗原包含含有SEQ ID N0:2的蛋白质，或与SEQ ID N0:2具有至少 90%同一性的序列。
[0192] 在一个备选的实施方案中，GIBsPLA2抗原包含GIBsPLA2蛋白的片段，该片段包含 至少6个连续的氨基酸残基并且含有免疫原性表位，或者其模拟物。在一个优选的实施方案 中，GIBsPLA2抗原包含至少6至20个氨基酸残基。本发明的优选的肽含有SEQ ID N0:2(或 SEQ ID N0:2的天然变体的相应的序列）的4至30个连续的氨基酸残基。本发明的最优选的 肽包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然变体的相应的序列）的5至25个连续的氨基酸残 基，并且进一步包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然变体的相应的序列）的以下氨基酸 残基的至少一个:氨基酸70、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71、或其组 合。本发明的肽的具体例子是包含以下序列之任一的小于50个氨基酸的肽：
[0202] GIBsPLA2抗原可以为各种形式，诸如为游离形式、聚合、化学或物理修饰，和/或与 载体分子偶联（即连接）。与载体的偶联可以提高免疫原性，并且(进一步)抑制GIBsPLA2多 肽的生物学活性。在这方面，载体分子可以是免疫学中常规使用的任何载体分子或蛋白质， 诸如例如KLH(钥孔虫戚血蓝蛋白）、卵清蛋白、牛血清清蛋白（BSA)、病毒或细菌变性毒素， 诸如类毒素 tetanos、类毒素白喉B霍乱毒素、其突变体，诸如白喉毒素 CRM 197、外膜泡囊蛋 白、聚赖氨酸分子、或病毒样颗粒(VLP)。在一个优选的实施方案中，载体是KLH或CRM197或 VLP〇
[0203] 可以通过使用连接化学基团或反应，诸如例如戊二醛、生物素等的共价化学实施 GIBsPLA2与载体的偶联。优选地，缀合物或GIBsPLA2蛋白或片段或模拟位进行用甲醛处理 以完成GIBsPLA2的失活。
[0204]在一个具体的实施方案中，GIBsPLA2抗原包含全长GIBsPLA2蛋白，任选与载体蛋 白偶联。在一个优选的实施方案中，GIBsPLA2抗原包含与载体蛋白偶联的含有SEQ ID N0:2 的蛋白质，或者与SEQ ID NO:2具有至少90%同一性的序列。
[0205]在另一个具体的实施方案中，GIBsPLA2抗原包含GIBsPLA2的免疫原性肽或模拟 位，任选地与载体蛋白偶联。在一个更优选的实施方案中，GIBsPLA2抗原包含长至少10个氨 基酸的多肽，其包含SEQ ID N0:2(或SEQ ID N0:2的天然变体的相应的序列）的以下氨基酸 残基的至少一个:氨基酸70、氨基酸121、氨基酸50、氨基酸52、氨基酸54、氨基酸71、或其组 合，任选地与载体分子偶联。
[0206]可以通过各种方法，诸如通过植入有人免疫细胞的非人动物的免疫，接着验证抗 体的存在，或者通过使用人或人源化抗体的三明治式ELISA测试GIBsPLA2抗原的免疫原性。 可以通过本申请中描述的任何活性测试验证生物学活性的缺乏。在一个优选的实施方案 中，GIBsPLA2抗原在（i)诱导⑶4T细胞中的膜微域(MMD)形成或（ii)使⑶4T细胞对IL-2信号 传导不应或对IL-7信号传导不应的体外方法中具有野生型GIBsPLA2蛋白的活性的小于 20%，更优选小于15%、10%、5%或甚至1 %。
[0207]在一个具体的实施方案中，本发明涉及失活的且免疫原性的GIBsPLA2。
[0208]在又一个具体的实施方案中，本发明涉及与载体分子，优选与KLH缀合的GIBsPLA2 蛋白或其片段或模拟位。
[0209]在又一个方面中，本发明涉及疫苗，其包含GIBsPLA2抗原、合适的赋形剂、和任选 地合适的佐剂。
[0210] 此类分子和缀合物和疫苗代表有力的药剂，用于免疫受试者，从而引起持续的 GIBsPLA2抑制。在重复后，此类方法可以用于引起永久的GIBsPLA2抑制。
[0211] 本发明的又一个目的涉及用于诱导抗体的生成的方法，所述抗体中和有此需要的 受试者中的内源GIBsPLA2的活性，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的GIBsPLA2 抗原或疫苗。
[0212]可以通过任何合适的路径，诸如通过注射，优选肌肉内、皮下、经皮、静脉内或动脉 内；通过鼻、口服、粘膜或直肠施用来施用本发明的抗原或疫苗。
[0213] GIBsPLA2抗原或疫苗可以用于治疗与GIBsPLA2的过度生成相关联的任何疾病。更 具体地，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中的与GIBsPLA2的过度生成相关联的疾病 的方法，其包括对受试者施用治疗有效量GIBsPLA2抗原或包含GIBsPLA2抗原的疫苗组合 物。
[0214] GIBsPLA2激动剂或活化剂
[0215] 术语GIBsPLA2"激动剂"在本发明的上下文内涵盖具有、或介导或上调GIBsPLA2活 性的任何物质，诸如但不限于肽、多肽、重组蛋白、缀合物、天然或人工配体、降解产物、同源 物、核酸、DNA、RNA、适体等，或其组合。术语"激动剂"涵盖完全和部分激动剂两者。GIBsPLA2 激动剂的一个具体的例子是GIBsPLA2蛋白或编码GIBsPLA2蛋白的核酸。
[0216] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于抑制受试者中的免疫应答的方法，其 包括对受试者施用GIBsPLA2蛋白或编码GIBsPLA2蛋白的核酸。
[0217] 组合物
[0218]本发明还涉及组合物，其包含如本文中描述为活性成分的GIBsPLA2调控剂或抗 原，和优选地药学可接受载体。
[0219] "药物组合物"指本发明的化合物(活性成分)和本领域中公认用于递送生物学活 性化合物到有此需要的受试者的介质的配制剂。因此，此类载体包括所有药学可接受载体、 稀释剂、介质或支持物。可以采用常规的药学实践对受试者提供合适的配制剂或组合物，例 如以单位剂量形式。
[0220] 根据本发明的化合物或组合物可以配制为软膏剂、凝胶、糊剂、液体溶液、悬浮液、 片剂、明胶胶囊、胶囊、栓剂、粉末、滴鼻剂或气雾剂的形式，优选为可注射溶液或悬浮液的 形式。对于注射，化合物一般以液体悬浮液的形式包装，所述液体悬浮液可以经由例如注射 器或灌注注射。在这点上，化合物一般溶解于与药学用途相容并且对于本领域技术人员已 知的盐水、生理、等张或缓冲的溶液中。如此，组合物可以含有一种或多种药剂或赋形剂其 选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等。值得注意地，可以在液体和/或可注射配制剂中使 用的药剂或赋形剂是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素 、Polysorbate 80、甘露醇、 明胶、乳糖、植物油、阿拉伯胶等。例如，载体也可以选自甲基-beta-环糊精、丙烯酸的聚合 物(如聚羧乙烯(carbopol))、聚乙二醇和聚丙二醇的混合物、单乙醇胺和羟甲基纤维素。
[0221] 组合物一般包含有效量的本发明的化合物，例如有效调控GI BsPLA2的量。一般地， 根据本发明的组合物包含约lyg至l〇〇〇mg GIBsPLA2调控剂，诸如0.001-0.01，0.01-0.1， 0.05-100,0.05-10,0.05-5,0.05-1,0.1-100,0.1-1.0,0.1-5,1.0-10,5-10,10-20,20-50 和 50-100mg，例如 0.05-100mg，优选 0.05-5mg，例如 0·05,0·1，0·2,0·3,0·4,0·5，1，2,3,4或 5mg。技术人员可以根据调控剂和疾病调节剂量。
[0222] 本发明的组合物可以进一步包含一种或多种别的活性化合物，用于同时或序贯使 用。
[0223] 本发明还涉及用于制备药物组合物的方法，其包括混合如先前描述的GIBsPLA2调 控剂和药学可接受赋形剂，并且在任何合适的形式或容器(注射器、安瓿、烧瓶、瓶、小袋等） 中配制组合物。
[0224]本发明还涉及试剂盒，其包含（i)包含如先前描述的GIBsPLA2调控剂的组合物， (ii)至少一个容器，和任选地(iii)关于使用试剂盒的书面用法说明。
[0225] 疾病
[0226] 可以使用本发明的化合物和组合物治疗与不适当（例如缺乏或不正确）的免疫应 答，特别是与不适当的CD4T细胞活性相关的任何疾病，以及增加的免疫可以改善受试者状 况的任何疾病。这些疾病在本申请中有时称为"免疫病症"。这包括免疫缺陷的情况(例如由 病毒感染，病原性感染，癌症等引起）、自身免疫性疾病、移植物、糖尿病、炎性疾病、癌症、变 态反应、哮喘、银肩病、荨麻疹、湿疹等。
[0227] 免疫缺陷和关联的病症
[0228]在第一个方面中，本发明基于抑制受试者中的GIBsPLA2,从而提高或恢复免疫活 性，特别是CD4-T细胞介导的活性。
[0229] 因此，在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于刺激有此需要的受试者中的免 疫应答的方法，其包括抑制所述受试者中的GIBsPLA2。
[0230] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于调控有此需要的受试者中的白细胞的 方法，其包括抑制所述受试者中的GIBsPLA2。
[0231]可以受益于GlBsPLA2抑制剂的疾病的例子可以是所有具有免疫缺陷，诸如HIV介 导的免疫缺陷的疾病。在这方面，在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗有此需要 的受试者中的免疫缺陷或关联的病症的方法，其包括抑制所述受试者中的GIBsPLA2。
[0232] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及GIBsPLA2抑制剂，用于治疗有此需要的 受试者中的免疫缺陷或关联的病症的用途。
[0233] 免疫缺陷和关联的病症指由受试者中的降低的免疫功能或应答为特征和/或引起 的任何状况或病理学。免疫缺陷可以由例如病毒性感染(例如HIV、乙肝等）、细菌性感染、癌 症、或其它病理学状况引起。因此，术语"免疫缺陷关联的病症"指由免疫缺陷引起或与免疫 缺陷有关的任何疾病。本发明特别适合于治疗与CD4-T细胞相关的免疫缺陷和关联的疾病。 本申请实际上证明了 GIBsPLA2的生物学效果参与⑶4T细胞疾病状态。因而，阻断GIBsPLA2 的活性在对引起免疫缺陷的细胞因子具有改变的响应的受试者中具有治疗益处，如经常在 感染HIV的患者中观察到。
[0234] 因而，在一个具体的实施方案中，本发明涉及治疗受试者中的HIV感染的方法，其 通过抑制受试者中的GIBsPLA2,优选通过对受试者施用GIBsPLA2抑制剂或疫苗进行。在一 些实施方案中，受试者是早期HIV患者，并且方法导致提高患者为HIV控制者的可能性。在一 些实施方案中，受试者是用抗逆转录病毒治疗后具有低免疫重建和/或具有严重特发性 CD4T淋巴细胞减少（ICL)的患者。本发明还涉及用于提高感染HIV的受试者中的CD4-T细胞 活性的方法，其通过抑制受试者中的GIBsPLA2,优选通过对受试者施用GIBsPLA2抑制剂或 疫苗进行。
[0235] 在另一个实施方案中，本发明涉及治疗受试者中的急性和/或慢性炎症和源自炎 性反应的突起（processus)的方法，其通过直接或与抗炎药物联合在受试者中注射 GIBsPLA2 进行。
[0236] 本发明还提供了通过提高受试者中的免疫应答治疗癌症的方法，其包括抑制受试 者中的GIBsPLA2,优选通过对受试者施用GIBsPLA2抑制剂或疫苗进行。本发明还提供了治 疗受试者中与癌症有关的CD4T细胞关联免疫缺陷的方法，其通过抑制受试者中的 GIBsPLA2,优选通过对受试者施用GIBsPLA2抑制剂或疫苗进行。
[0237] 病理学免疫应答和关联疾病
[0238]可以使用本发明治疗与不适当（例如病理性或不正确）的免疫应答或与免疫系统 的不想要的（超)活性或(超)活化，特别是与不适当的CD4T细胞活性相关的任何疾病。这些 疾病包括例如自身免疫性疾病、移植物、糖尿病、变态反应、哮喘、银肩病、荨麻疹、湿疹等。 [0239]如此，在又一个方面中，本发明基于活化或诱导受试者中的GIBsPLA2,从而抑制免 疫活性，特别是CD4-T细胞介导的活性。
[0240]因此，在一个具体的实施方案中，本发明涉及抑制有此需要的受试者中的免疫应 答的方法，其包括诱导或活化所述受试者中的GIBsPLA2。
[0241] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于抑制有此需要的受试者中的白细胞的 方法，其包括抑制所述受试者中的GIBsPLA2。
[0242] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中的由不想 要的免疫应答引起的病症的方法，其包括诱导或活化所述受试者中的GIBsPLA2。
[0243] 优选地，诱导或活化受试者中的GIBsPLA2包括对受试者施用GIBsPLA2激动剂，例 如GIBsPLA2蛋白或其功能片段。
[0244] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及GIBsPLA2激动剂或活化剂，用于治疗有 此需要的受试者中的由不想要的免疫应答引起的病症的用途。
[0245] 可以受益于GlBsPLA2激动剂的疾病的例子是自身免疫性病症、癌症、病毒性疾病、 细菌性感染等。
[0246] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中的自身免疫 性病症的方法，其包括刺激或诱导所述受试者中的GIBsPLA2。
[0247] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及本发明的化合物或组合物，在治疗有此 需要的受试者中的自身免疫性病症中的用途。
[0248] 在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中的癌症的方 法，其包括刺激或诱导所述受试者中的GIBsPLA2。
[0249] 在另一个具体的实施方案中，本发明涉及本发明的化合物或组合物，在治疗有此 需要的受试者中的癌症中的用途。
[0250]本发明的另一个具体的实施方案涉及用于治疗(例如降低或预防或抑制）移植物 排斥，或者用于治疗移植受试者中的移植物抗移植物疾病的方法，其包括刺激或诱导所述 受试者中的GIBsPLA2。本发明的另一个目的是用于改善受试者中的同种移植物耐受性的方 法，其包括刺激或诱导所述受试者中的GIBsPLA2。
[0251] 抗微生物活性
[0252] 在又一个方面中，本申请还提供了使用GIBsPLA2杀死微生物的方法。通过直接对 膜起作用，GIBsPLA2可以破坏或杀死细菌、包膜病毒、寄生物等。
[0253] 在急性感染中或在感染中，可以单独或与抗生素、抗病毒、抗逆转录病毒和抗寄生 物药物联合使用GIBsPLA2。在对已知的抗微生物药物有抗性的微生物的情况中，GlBsPLA2 可以代表一种备选疗法。它可以在非常短期的治疗中使用，例如在非常危险且急性的临床 情况中。
[0254] 可以受益于根据本发明的通过GlBsPLA2的治疗的疾病的具体例子是是具有免疫 系统的超活性的所有临床情况或慢性炎症，诸如多发性硬化，重症肌无力，自身免疫性神经 病，如Gui 1 lain-Barrg，自身免疫性葡萄膜炎，葡萄膜炎，自身免疫性溶血性贫血，恶性贫 血，自身免疫性血小板减少症，颞动脉炎，抗磷脂综合征，血管炎如韦格纳肉芽肿病，贝切特 氏病，动脉粥样硬化，银肩病，疱疹样皮炎，寻常型天疱疮，白癜风，寻常型天疱疮，蕈样肉芽 月中，过敏性接触性皮炎，异位性皮炎，扁平苔藓，PLEVA，湿疹，克罗恩病，溃疡性结肠炎，原发 性胆汁性肝硬化，自身免疫性肝炎，1型糖尿病，阿狄森氏病，格雷夫斯(Grave)氏病，桥本 (Hashimoto)氏甲状腺炎，自身免疫性卵巢炎和睾丸炎，自身免疫性甲状腺炎，类风湿性关 节炎，系统性红斑狼疮，硬皮病，多发性肌炎，皮肌炎，脊柱关节病如强直性脊柱炎，或干燥 综合征（Sjogren's Syndrome)。
[0255] 可以根据受试者和疾病改编施用本发明的化合物或组合物的持续时间、剂量和频 率。可以单独或与其它活性成分联合同时或分开或序贯使用治疗。
[0256] 可以以各种方式或路径，诸如但不限于系统注射、肌肉内、静脉内、腹膜内、皮肤、 皮下、真皮、经皮、鞘内、眼（例如角膜)或直肠方式，或者通过在炎性部位上表面施用，并且 优选通过肌肉内或静脉内注射施用根据本发明的化合物或组合物。
[0257] 典型的方案包括在一天或几天，直至一年，并且包括一周和约6个月之间的时段里 单一或重复施用有效量的GIBsPLA2调控剂。应当理解，体内施用的本发明的药物化合物或 组合物的剂量将取决于接受者(受试者）的年龄、健康、性别和重量、并行治疗(若有的话)的 种类、治疗频率、和期望的药学效果的性质。本文中提供的有效剂量的范围并不意图为限制 性的，并且代表有效的剂量范围。然而，将针对个别的受试者修改最有效的剂量，如相关领 域的技术人员理解并且确定（参见例如Berkowet et al.，eds.，The Merck Manual ,16th edition,Merck and Co·，Rahway，N.J·，1992;Goodmanetna·，eds·，Goodman和Cilman's The pharmacological Basis of Therapeutics ,10th edition,Pergamon Press , Inc., Elmsford，N.Y.，（2001))〇
[0258] 诊断
[0259]本发明还提供了基于检测来自受试者的样品中GIBsPLA2的存在或量或缺乏检测 受试者中的免疫缺陷的方法。可以使用本领域中本身已知的多种检测技术或平台，诸如但 不限于俘获测定法、三明治式测定法、竞争测定法、放射性免疫测定法、产生有色、荧光、化 学发光、或电化学活性产物的酶标记物与底物、荧光、荧光极化、化学发光、光学和比色、电 化学发光、时间分辨荧光、表面等离振子共振、隐失波、多孔板(ELISA)、个别的测定法、多重 测定法、胶乳珠-多重测定法、微阵列(Laminar表面)-多重测定法、玻璃、基于板的测定法或 基于条的测定法实施本发明的方法。
[0260]在一个具体的实施方案中，方法包括测定GIBsPLA2基因、RNA或蛋白质中的多态性 的存在或量或缺乏。我们的结果显示了 GIBsPLA2易受高多态性，并且这与受试者的生理学 状态相关联。如此，本发明包括(i)测定GIBsPLA2的特定多态性同等型的存在或量或缺乏， 和/或（ii)测定受试者中的GIBsPLA2多态性的全局比率，所述数据与受试者的生理学状态 相关联。具体地，特定的同等型可以是如上文描述的病症在受试者中的素因、存在或发作特 征性的。此类测定也可以用于个体化的药物，以调整治疗。
[0261] 监测和/或诊断与CD4T细胞缺陷有关的免疫缺陷的方法，其包括检测GIBsPLA2
[0262] 本公开提供了监测和/或诊断受试者中的与CD4T细胞缺陷有关的免疫缺陷，特别 是人免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法。在一些实施方案中，方法包括(a)提供含有来自受试 者的体液，优选血浆的样品，并且(b)检测高于阈值的样品中的GIBsPLA2水平。可以通过本 领域中已知的任何方法，诸如例如通过包括酶促测定法、配体俘获测定法和/或免疫测定法 的方法检测样品中的GIBsPLA2的存在。
[0263] 在一些实施方案中，方法包括获得包含来自受试者的血浆的样品，并且测定血浆 是否具有至少一种选自下组的活性：诱导来自健康受试者的CD4T细胞中的异常膜微域 (MMD)的形成和使健康受试者的CD4T细胞对白介素（IL-7)信号传导不应。若来自受试者的 血浆包含此类活性，则在一些实施方案中，受试者确定为具有CD4T细胞关联的免疫缺陷，如 经常但不仅在感染HIV的患者中观察到的。若血浆级份不含此类活性，则在一些实施方案 中，受试者确定为具有对与T CD4细胞至细胞因子调节稳态的变化有关的免疫缺陷的低暴 露。
[0264] 在一些实施方案中，受试者确定为具有HIV感染。比较而言，若蛋白质级份不包含 此类活性，则在一些实施方案中，受试者确定为没有与如本文中公开的与CD4T细胞缺陷有 关的免疫缺陷。在一些实施方案中，受试者确定为没有HIV感染。
[0265] 在一些实施方案中，方法包括使包含来自受试者的体液，优选血浆的样品与对 GIBsPLA2特异性的抗体接触，并且测定免疫学反应的存在或缺乏。在一些实施方案中，通过 包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)的方法测定免疫学反应的存在或缺乏。对GIBsPLA2特异 性的抗体和样品之间的免疫学反应的存在指示样品中的GIBsPLA2的存在，这继而指示受试 者具有与CD4T细胞缺陷有关的免疫缺陷。在一些实施方案中，受试者确定为具有HIV感染。 比较而言，对GIBsPLA2特异性的抗体和样品之间的免疫学反应的缺乏指示受试者没有与如 本文中公开的与CD4T细胞缺陷有关的免疫缺陷。在一些实施方案中，受试者确定为没有HIV 感染。
[0266] 在一些实施方案中，用于样品中的GIBsPLA2存在的测定法是定性的。在一些实施 方案中，用于样品中的GIBsPLA2存在的测定法是定量的。
[0267] 在一些实施方案中，方法包括比较测定法的结果与对照样品的相似测定法的结 果，所述对照样品包含没有与CD4T细胞缺陷有关的免疫缺陷的受试者的血浆。在一些实施 方案中，方法包括比较测定法的结果与包含较早收获的同一名受试者的血浆的样品的相似 测定法的结果。
[0268] 监测和/或诊断与CD4T细胞改变有关的免疫缺陷的方法，包括表征CD4T细胞上的 膜微域
[0269] 实施例中的数据证明了感染HIV的患者呈现⑶4T细胞表面上的独特膜微域(MMD) 的形成，尽管非常少的细胞真正被HIV感染。因而，本公开还提供了用于诊断受试者中的与 CD4T细胞改变有关的免疫缺陷，诸如例如由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的免疫缺陷的 方法。在一些实施方案中，方法包括：（a)从受试者分离⑶4T淋巴细胞，并且(b)测量T细胞上 的膜微域(MMD)的数目和/或大小。在一些实施方案中，方法进一步包括下列至少一项：（c) 测量T细胞中的磷酸-STAT5的量，并且(d)测定T细胞中的磷酸-STAT5的核输入级份。在一些 实施方案中，在缺乏白介素的情况下测量T细胞上的MMD的数目和/或大小。在一些实施方案 中，在缺乏IL-2的情况下测量T细胞上的MMD的数目和/或大小。在一些实施方案中，在缺乏 IL-7的情况下测量T细胞上的MMD的数目和/或大小。在一些实施方案中，在存在亚阈值水平 的白介素的情况下测量T细胞上的MMD的数目和/或大小。
[0270] 在一些实施方案中，若从受试者分离的T细胞上的MMD的数目是至少阈值，则这指 示受试者具有与CD4T细胞改变有关的免疫缺陷。在一些实施方案中，它指示受试者具有HIV 感染。在一些实施方案中，若从受试者分离的T细胞上的MMD的数目不是至少阈值，其指示受 试者没有如本文中公开的与CD4T细胞改变有关的免疫缺陷。在一些实施方案中，它意味着 受试者没有对细胞因子信号传导的受损的CD-4T细胞应答。在一些实施方案中，它意味着受 试者没有对白介素-7的受损的CD-4T细胞应答。在一些实施方案中，它指示受试者没有HIV 感染。在一些实施方案中，阈值是每个细胞至少约80、每个细胞至少约90、每个细胞至少约 100、每个细胞至少约110、或每个细胞至少约120。在一个非限制性的优选的实施方案中，阈 值是每个细胞约100。在一些实施方案中，若从受试者分离的T细胞上的MMD具有至少阈值的 直径，则这指示受试者具有HIV感染。在一些实施方案中，若从受试者分离的T细胞上的MMD 没有至少阈值的直径，则这指示受试者没有对白介素-7和更一般对细胞因子的受损的应 答。在一些实施方案中，它指示受试者没有HIV感染。在一些实施方案中，阈值是至少100nm、 至少llOnm、至少120nm、至少130nm、或至少140nm的直径。在一个非限制性的优选的实施方 案中，阈值是至少约120nm的直径。
[0271] 由于RIF可以通过在异常大的MMD上聚集膜受体改变⑶4T细胞对IL-7的响应性，对 其它gamma-c和细胞因子的响应也可以受到影响，并且RIF可以也与牵涉改变的CD4T细胞应 答的其它病理学有关。
[0272] 鉴定候选治疗剂的方法
[0273] 本发明还提供了用于鉴定候选治疗剂的方法，其包括：（a)在存在药剂的情况下使 ⑶4T淋巴细胞与GIBsPLA2接触，并且(b)测量GIBsPLA2诱导的⑶4T细胞活化。在一些实施方 案中，方法包括(c)比较在存在药剂的情况下的GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水平与在 缺乏药剂的情况下GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水平。在一些实施方案中，若在存在药 剂的情况下GIBsPLA2诱导的⑶4T细胞活化的水平低于在缺乏药剂的情况下GIBsPLA2诱导 的CD4T细胞活化的水平，则将药剂鉴定为候选免疫缺陷治疗剂。在一些实施方案中，药剂鉴 定为候选HIV治疗剂。在一些实施方案中，若在存在药剂的情况下GIBsPLA2诱导的CD4T细胞 活化的水平高于在缺乏药剂的情况下GIBsPLA2诱导的CD4T细胞活化的水平，则将药剂鉴定 为候选免疫抑制治疗剂。
[0274] 在一些实施方案中，测量GIBsPLA2诱导的⑶4T细胞活化包括测定每个⑶4T细胞的 MMD数目。
[0275] 在一些实施方案中，测量GIBsPLA2诱导的⑶4T细胞活化包括测定⑶4T细胞上的 MMD的均值直径。
[0276] 在一些实施方案中，测量GIBsPLA2诱导的⑶4T细胞活化包括测定通过STAT5磷酸 化和/或核输入测定的⑶4T细胞的IL-7响应性。
[0277] 如本文中使用，"药剂"可以是作为潜在治疗剂评估下的任何化学实体。在一些实 施方案中，药剂是有机分子。在一些实施方案中，药剂包含2至100个碳原子，如2至50个碳原 子，5至50个碳原子，或10至50个碳原子。在一些实施方案中，药剂是肽、蛋白质、糖蛋白、或 脂蛋白。在一些实施方案中，药剂是抗体。
[0278] 在一些实施方案中，先前尚未确定药剂具有暗示作为用于治疗免疫缺陷的治疗剂 的效用的生物学活性，诸如经常与HIV感染有关的。在一些实施方案中，先前已经确定药剂 具有暗示作为用于治疗免疫缺陷的治疗剂的效用的生物学活性，诸如经常与HIV感染有关 的。
[0279] 如本文中使用，"候选免疫缺陷治疗剂"或"候选HIV治疗剂"指在至少一种测定法 中抑制RIF活化CD4T细胞的能力的药剂。与本文中报告的数据一致，在至少一种测定法中药 剂抑制GIBsPLA2活化CD4T细胞的能力的能力是一种可用于鉴定药剂的方式，所述药剂可能 在治疗上可用于治疗免疫缺陷，包括与HIV感染有关的免疫缺陷。因此，它也是一种可用于 鉴定可能在治疗上可用于治疗HIV感染的药剂的方式。当然，与在所有治疗分子的情况下一 样，将需要进一步的表征。然而，这不减损本公开的候选HIV治疗剂的效用。
[0280] 在以下实施例部分中公开了本发明的其它方面和优点，所述实施例应当认为是例 示性的。 实施例
[0281] 1.材料和方法
[0282] 1.1.患者
[0283] 研究中包括的VP已经呈HIV阳性超过一年。他们从未接受任何抗逆转录病毒药物， 并且在血液收集时具有病毒载量>10,000个RNA拷贝/ml以及⑶4计数>20〇Ail(ANRS EP 33 和EP20研究）。在Centre Hospitalier de Gonesse抽取来自VP的所有血液样品。来自HD的 血液由Etablissement Frangaisdu Sang(Centre Necker-Cabanel，Paris)提供。从已经接 受治疗至少一年的个体抽取来自ART患者的血浆样品。他们的病毒载量不能检出至少6个 月，并且在血液收集时他们的CD4计数>500/μ1。在感染后10年从具有不能检测病毒载量的 个体抽取来自HIC患者的血衆样品。在Centre d' Infectiologie Necker-Pasteur收集血衆 样品。
[0284] 1.2.分析纯化的⑶4T淋巴细胞中的膜微域(MMD)、受体扩散速率和磷酸-STAT5细 胞区室化
[0285] 通过负选择纯化CD4T-细胞，如已经描述（10)，然后用2nM重组糖基化人IL-7 (Cytheris)或40yg PHA(Sigma)活化。已经描述了用于研究细胞表面微域(MMD)和磷酸-STAT5细胞区室分布的共焦和STED显微术（10，12)。还已经描述了活细胞表面上的蛋白质扩 散的?05分析(10，12)。
[0286] 1.3.制备和分析去污剂抗性微域(DRM)
[0287] 先前已经描述了制备来自HD或VP的CD4T淋巴细胞的Triton-XlOO裂解物，接着离 心通过鹿糖梯度，并且对收集的级份进行Western印迹分析（12)。通过Western印迹使用对 阀蛋白、IL_7Ralpha和ga_a c特异性的单抗检测相应的条带（12)。
[0288] 1.4.来自VP血浆的RIF的表征
[0289] 1.4.1.生物测定法
[0290] MMD诱导测定法如下：首先将VP血浆(5或10%)在培养基中与纯化的HD⑶4T细胞 一起温育（20min)。然后，在经聚赖氨酸包被的玻璃载玻片上铺板细胞10min，然后通过 15miη IL-7 (2nM)活化或对于对照(NS)不活化，然后通过在PBS/SVF 5 %中平衡1小时的PFA (PFA，1.5%，15min，于37°C，接着在室温15min)固定，之后通过霍乱毒素 B(CtxB-AF488)染 色。通过STED显微术计数MMD。
[0291] 用于抑制STAT磷酸化和核转位的测定法如下：首先将VP血浆(5或10%)与纯化的 HD CD4T细胞一起温育（20min)，之后通过IL-7 (2nM，15min)刺激。然后，在经聚赖氨酸包被 的玻璃载玻片上铺板细胞l〇min，然后通过15min IL-7(2nM)活化或对于对照(NS)不活化， 然后通过??4(??六，1.5%，151^11，于37°(：，接着在室温151^11)固定，并通过甲醇(90%在-20 °C)透化。在PBS/SVF 5%中平衡细胞1小时，然后通过用山羊抗兔Atto642标记的兔抗STAT5 染色磷酸-STAT5,并且通过FACS或STED显微术分析。
[0292] 1.4.2.酶处理
[0293] 通过处理30kDa膜上过滤的VP血浆评估酶消化对RIF活性的影响。使用具有MW〈 lOkDa的血浆化合物作为阴性对照。测试猪胰蛋白酶(于37 °C，lU/ml持续30min，接着是PMSF 抑制，并且用Mi 11 ipore 5kDa-膜离心滤器进行缓冲液更换）或DNA酶I (于37 °C，lU/ml持续 30min)，或RNA酶(于37°C，lU/ml持续30min)或肽N-聚糖酶(于37°C，lU/ml持续30min)的效 果。在10 %终浓度分析所有制备物。
[0294] 1.4.3.]\^测定或1?正纯化
[0295] 通过将1.6ml血浆加载到用碳酸铵（0.1M)或roS预平衡的85-ml Sephadex G100 柱，然后收集洗脱液的〇 .8ml级份实施大小排阻层析。使用蛋白质集(GE-Healthcare)校准 柱。通过Bradford法测量蛋白质浓度。测试了先前在lOOkDa膜上过滤的VP血浆和总VP血浆， 并且给出相同的结果。收集13-17kDa的级份，其含有半纯化的RIF。
[0296] 1.4.4等电点测定
[0297] 在MonoQ或MonoS 1ml柱(GE-Healthcare)上实施阴离子或阳离子交换层析，通过 连续pH步进(碳酸铵/乙酸铵缓冲液)洗脱。测量每个洗脱级份的pH，然后，将这些调节到pH 7.4,之后测试其生物学效果。在洗脱后立即在相应的级份中测量RIF活性。
[0298] 1.4.5MS 分析
[0299] 根据本领域中本身已知的方法，将来自凝胶过滤(G100)的样品冻干，然后重悬，合 并，并且用猪胰蛋白酶蛋白水解。然后，通过层析流过C18柱在12个级份中分开蛋白水解肽， 所述C18柱在乙酸铵中洗脱。经由以反相（乙腈）洗脱的C18分开12个级份，并且通过在 orbitrap Velos(Thermo Scientific)中的电喷射直接注射，用于在二级Ar片段化的情况 下MS分析，然后是MS/MS，每个MS扫描为10个较高强度的峰。
[0300] 使用标准Mascot和X-Tandem程序。对于数据库亚组的每个蛋白质，计算3个标准：
[0301] -i-得分：富含具有信号肽切割的成熟蛋白质的NextProt数据库中来自单一蛋白 质的胰蛋白酶消化的每个肽的理论特异性的计算(独特的肽/蛋白质的数目）：特定肽总体 人序列的数目（所有），每个蛋白质的具有N端信号肽的序列(sec)
[0302] -与来自所有MS扫描系列的峰相容的肽的理论发生的计算（理论肽匹配峰/蛋白 质）
[0303]-具有峰匹配肽的蛋白质序列的理论覆盖度的计算 [0304]对于每个蛋白质，p值以所有三个得分的计算测定。
[0305]实施例1:来自VP的⑶4T淋巴细胞的异常活化，如通过异常膜微域(MMD)的存在测 量。
[0306]本实施例描述了调查新的分子和细胞参数，其解释慢性HIV感染患者的CD4T淋巴 细胞中看到的异常应答中的一些。通常通过评估认为是⑶4功能障碍的主要标志物的细胞 表面分子，如⑶38、HLA-DR和⑶25的过表达测量免疫系统的长期活化（15)。然而，尽管付出 大量努力，这些数据仍然是模糊的，并且CD4T细胞的表型不能直接解释其免疫缺陷。
[0307] 使用STED显微术和用霍乱毒素 B(CtxB-AF488)标记检测MMD的存在（12)。在任何刺 激前，发现从VP纯化的CD4T淋巴细胞的表面携带远多于从HD纯化的静止CD4T淋巴细胞的 MMD(图la)。并且更重要地，所有来自VP的⑶4T细胞显示了增加的MMD数目。此异常模式不是 由VP血浆中的IL-7刺激的结果，因为此血浆中的平均IL-7浓度(0.4pM)仅是IL-7R的Kd的百 分之一（13，14)。当通过IL-7刺激来自HD的纯化的⑶4T细胞时，观察到大量的丽D。比较而 言，来自VP的CD4T细胞的MMD模式不受IL-7影响（图1 a)。与对IL-7的任何响应的缺乏偶联的 此异常活化可以通过非生理学刺激物，诸如用植物凝集素(PHA)模拟(图la)。
[0308] 然后，计数这些各种异常丽D。如用PHA-刺激的HD⑶4T细胞一样，来自VP的每个 ⑶4T细胞观察到150-200个左右的MMD(图lc)。这里再一次，获得的结果显示了来自VP的所 有⑶4T细胞表达MMD，包括所有主要的⑶4亚群（图lc)。IL-7不能增加 VP中的MMD数目。比较 而言，HD⑶4T细胞中的丽D数目在IL-7刺激后从10个左右的MMD/细胞的背景水平增加到 300个。还进行了 MMD大小的研究（图Id和e)。这显示了来自VP的CD4T细胞上和PHA-刺激的HD CD4T细胞上的MMD远大于（250nm)那些来自通过IL-7(90nm)刺激的HD CD4T细胞的。
[0309]实施例2:在从VP CD4T细胞分离的异常去污剂抗性膜微域(DRM)中隔离所有IL-7R alpha和gamma-c链
[0310] 分析静息HD CD4T细胞以验证IL-7R alpha和gamma-c链位于MMD外部的高密度级 份中。当通过IL-7刺激这些HD CD4T细胞时，这两条链位于低密度级份中，所述低密度级份 对应于去污剂抗性MMD或含有MMD中隔离的所有蛋白质的DRM(图2)。
[0311]当在从VP纯化的⑶4T细胞上重复研究时，模式是不同的（图2)。在任何刺激前，所 有IL-7R alpha和gamma-c链已经在DRM中隔离;无一位于与MMD外部的游离受体对应的高密 度级份中。此外，在DRM制备前通过IL-7预先刺激CD4T细胞不影响此模式(数据未显示）。这 里再一次，通过非病理学PHA预先刺激HD⑶4T细胞再现此病理学情况。这确认了图1中的数 据，并且证明了 VP中的CD4T细胞在任何刺激前进行异常活化。另外，这些异常MMD含有所有 IL-7R链（图 2)。
[0312] 实施例3:来自HD、VP和经IL-7-刺激的HD细胞的纯化的CD4T细胞中IL-7信号体的 2D凝胶分析。通过免疫沉淀后回收的蛋白质模式表征异常活化状态。
[0313] 使用2D电泳证明VP中的IL-7信号体的组成是异常的，并且与静止且经IL-7-活化 的HD CD4T细胞中的IL-7信号体的组成不同（图7a，7b和7c)。
[0314] 用蛋白G-Sepharose 4G上固定化的抗_IL_7Ralpha(小鼠单抗40131，R&D System) 免疫沉淀蛋白质，其来自纯化的CD4T细胞裂解物，并且在2D-PAGE(在pH 3-10凝胶条上的 IEF，接着用双丙稀酰胺的SDS凝胶）上分离。展示pH和MW(kDa)标度。用Sypro-Ruby染色凝 胶。显示的凝胶代表来自HD的8个NS/IL-7对和来自VP的3个凝胶。
[0315](图7a)非刺激的（NS)HD CD4T细胞。
[0316](图7b)VP CD4T细胞。从VP比从HD制备的经Sypro Ruby染色的2D凝胶中观察到更 多的点。另外，我们观察到当用VP提取物制备2D凝胶时，共同的点是更强烈的。
[0317] (图7c)经IL-7-刺激的HD CD4T细胞。通过IL-7刺激的HD CD4T细胞中的模式不同 于VP CD4T细胞中的。这进一步支持下述提议，即VP中找到的异常活化不是可以在具有高水 平IL-7的器官中，例如在生成IL-7的器官中发生的IL-7刺激的结果。
[0318] 可以从分析得出结论，VP⑶4T细胞中的IL-7R链不仅是异常MMD的一部分，而且它 们与不同于正常IL-7信号体中找到的那些蛋白质复合物的蛋白质复合物相互作用。
[0319] 实施例4:在来自HD、VP和经PHA-刺激的HD细胞的纯化的⑶4T细胞表面上的IL- 7Ralpha的扩散速率。VP CD4T细胞中的IL-7Ralpha包埋于富含脂质的异常MMD中，如此限制 其扩散速率，并且排除与细胞骨架的任何相互作用以及因此传播信号的任何能力。
[0320] 在活CD4T细胞的表面上通过FCS测量用AF488-抗IL-7Ralpha单抗染色的IL-7Ralpha的二维扩散。图8中显示了结果。在缺乏IL-7(?，自相关）的情况中或在存在IL-7-生物素· SAF633(籲，交叉相关）的情况下测量扩散时间tD(以l(T3sec计），如描述的（10， ⑵。然后，相对于通过共焦体积截取的细胞表面积ω〇 2(1〇3ηπι2)绘制这些时间。在用或不用 MMD抑制剂(COase lμg/ml加上SMase 0.1μg/ml持续30min)或细胞骨架抑制剂(CytD 20μΜ 加上Col ΙΟμΜ持续30min)预处理的情况下显示了扩散图。
[0321] 棒标示来自5个独立实验的SEM。线性回归的斜率给出了有效的扩散速率Drff，并且 y-截距外推约束时间（confinement time)τ〇,如我们先前描述（12)。在柱形图图3a中显示 了 Def f 〇
[0322] (图8a，8d)在HD CD4T-细胞的表面上，
[0323] (图8b，8e)在VP CD4T细胞的表面上，
[0324] (图8c，8f)在用PHA(lμg/ml)预先活化的HD CD4T细胞的表面上。
[0325] (图8g)通过MMD抑制剂或细胞骨架抑制剂处理之前和之后包埋于MMD中的IL-7Ralpha扩散的机制的图解。MMD以圆盘标示，受体以杆标示，细胞骨架显示为网。标示扩散 速率(快速，缓慢，非常缓慢)以促进数据解读。此图解显示了图3a中也报告的结果。
[0326] 实施例5:VP⑶4T细胞的异常MMD中隔离的IL-7R链是非功能性的。
[0327] 在⑶4T细胞的表面上测量IL-7R alpha扩散速率，如先前描述（10，12)并且如实施 例4中详述。在任何刺激前，看到这些扩散速率在VP比HD⑶4T细胞上慢三倍（图3a)。这进一 步证明了 IL-7R alpha链包埋于这些⑶4T细胞的表面上的异常丽D中（图3a)。⑶ase加上 SMase处理从其MMD约束释放受体，并且因此提高其扩散速率（图3a)。比较而言，用松胞菌素 D(Cyt D)加上秋水仙碱(Col)(其瓦解细胞骨架）的处理对VP CD4T细胞中的IL-7R alpha链 的扩散速率没有影响（图3a)。由于细胞骨架构造是信号转导的绝对必要物，在IL-7R alpha 和细胞骨架网眼之间的任何功能或结构联系的此种缺乏提示了当IL-7R复合物在异常MMD 中隔离时不能进行信号传导，在VP CD4T细胞中也是如此。
[0328] 然后，使用脉冲-STED显微术研究HD和VP⑶4T细胞两者的细胞质和核中的STAT5 磷酸化(磷酸-STAT5)和磷酸-STAT5分割。图3b显示了 15min IL-7刺激之前和之后的磷酸-STAT5分布的STED图像。我们注意到磷酸-STAT5在HD CD4T细胞的核中积累，并且此现象受 到细胞骨架瓦解抑制。比较而言，在VP⑶4T细胞中或在经PHA预先刺激的HD⑶4T细胞中不 发生磷酸-STAT5对核的转位(图3b)。
[0329] 然后，追踪磷酸-STAT5在细胞质和核中出现的动力学达1小时（图3c，d，e)。这显示 了 VP CD4T细胞中的磷酸-STAT5主要在细胞质中积累，并且不迀移到核（图3d)，与在经PHA- 刺激的HD CD4T细胞中一样（图3e)。当结果与在核中找到50%磷酸-STAT5的在IL-7刺激HD CD4T细胞后5分钟中获得的结果比较时，这是特别清楚的（图3c)。
[0330] 实施例6:来自VP的血浆诱导纯化的HD⑶4T细胞表面上的异常MMD。
[0331] 然后，调查了VP⑶4T细胞的异常活化的起源。牵涉所有⑶4T细胞并且非生理学信 号，诸如PHA模拟结果的实情导致VP的血浆的调查。将纯化的HD⑶4T细胞与10%VP血浆一 起温育30min，并且在⑶4T细胞表面上计数MMD，如通过经标记的霍乱毒素 B(CtxB-AF488)检 测。图4a显示了获得的图像。单独的VP血浆诱导HD CD4T细胞上的大量MMD。添加 IL-7不影响 这些MMD的大小或数目（图4a)。对来自5个不同VP的血浆显示了这些结果（图4b)，并且使用 来自这些VP的更多血浆样品（>15)验证。还使用来自不同HD(>5)的⑶4T细胞报告了实验。对 照由在纯化的HD⑶4T细胞上测试来自HIV控制者(HIC)和经抗逆转录病毒治疗的(ART)患 者的血浆样品组成。这些无一诱导MMD或抑制IL-7对MMD的诱导（图4c)。
[0332] 这进一步通过测试各种血浆的大量稀释验证（图4d)。下至0.1 %稀释度的VP血浆 导致细胞表面间散布的MMD的形成。以50至100倍稀释的VP血浆给出50 %最大活性。在任何 稀释度，来自HI C或ART患者的血浆样品无一诱导MMD。
[0333] 实施例7:来自VP的血浆抑制IL-7诱导的磷酸-STAT5核转位
[0334] 通过追踪STAT5磷酸化和核转位测试用VP血浆处理的HD⑶4T细胞中的IL-7R的功 能。如图5a中看到，HD⑶4T细胞与VP血浆（10 %浓度）的预温育抑制IL-7诱导的STAT5磷酸 化和其核转位。图5b显示了用5个VP血浆样品获得的结果。在10%稀释度，全部抑制磷酸-STAT5的核转位。这些结果用来自不同VP(> 15)的血浆和HD CD4T细胞的各种来源(>5)确认。
[0335] 源自HIC和ART患者的血浆的效果也通过将这些与纯化的HD⑶4T细胞预温育来测 试（图5a和5c)。这里再一次，仅VP血浆能够抑制IL-7诱导的磷酸-STAT5核转位。还确定（图 5d)VP血浆下到0.1%稀释度有活性，并且在50至100倍稀释获得半最大活性，如此与诱导异 常MMD的能力关联起来(图4d)。
[0336] 源自经ART处理但不响应(CD4-NR)其治疗（低计数的病毒RNA和低计数的⑶4T细 胞）的患者的血浆的效果也通过预温育这些与纯化的HD CD4T细胞测试。这里再一次，仅 〇)4-冊血浆能够抑制11^-7诱导的磷酸-3了4了5核转位。还确定了〇)4-冊血浆下到0.1%稀释 度有活性，并且在50至100倍稀释获得半最大活性，如此与如用VP观察到的诱导异常MMD的 能力关联起来。
[0337] 实施例8:不应状态诱导因子的分子表征
[0338]调查了RIF的化学性质。进行的研究（图6a)显示了RIF是一种蛋白质，因为其活性 被胰蛋白酶破坏。用肽N-聚糖酶(PNG酶）的处理没有影响，指示N-糖基化不是RIF活性需要 的。
[0339] 然后，通过在Sephadex G-100上的大小排阻层析测量RIF的分子量。对于从柱中洗 脱的所有级份测量MMD的诱导（图6b)和对IL-7诱导磷酸-STAT5核转位的抑制（图6c)。图6中 给出了两个代表性的柱概况。两者都显示了 RIF是具有10-15kDa的MW的单一因子。
[0340] 图6b显示了通过从Sephadex G100柱中收集的100个级份之每个中的点印迹测量 的病毒肽或蛋白质的密度。用来自VP血浆样品的不同多克隆抗体将测量重复三次，所述多 克隆抗体的特征在于其针对病毒蛋白的高活性。对于每个实验，然后从数值中扣除用HD血 浆获得的信号。图6b中显示的模式证明了在含有RIF活性的级份中检测不到病毒蛋白或片 段，而点印迹测定法能够检测较高丽(190至321^&)的病毒蛋白。
[0341] 然后，使用来自Sephadex G100柱的10至15kDa有活性的富集级份制定RIF的等电 点，通过在阴离子(MonoQ)或阳离子(MonoS)交换柱上保留，接着pH洗脱(在MonoS的情况下 pH增加或在MonoQ的情况下pH降低）（图6d)。然后，在调节其pH至7.4后测量各个pH组分的 丽D诱导活性。总共，在两个级份中回收了初始活性的25至30%，即与6.5至8.0的等电点一 致的结果。
[0342] 因此，RIF是一种分泌性蛋白质，具有约15kDa的MW，7.5-8.0左右的pi，其含有二硫 桥。在上述结构和功能特征后，直接获得RIF身份（identity)。特别地，在所有36853已知的 人蛋白质中，仅62具有RIF的上述4个特征。使用质谱术和标准Mascot程序分析从三名病毒 血患者和三名HD制备的半纯化的材料。根据材料和方法中描述的p值排序回收的蛋白质。下 文表1中显示的结果清楚且直接指示RIF是GIBsPLA2。
[0343] 表 1
[0346]如此，病毒血患者的血浆中找到的蛋白质是GIBsPLA2的分泌性形式。成熟的蛋白 质具有125aa(MW14138)、PI 7.95和7个二硫桥。使用商业的纯化的猪6188?1^2，我们能够在 体外验证此蛋白质诱导异常MDM，其阻断病毒血患者的血浆中的IL-7pSTAT5核转位，这进一 步确认RIF是GIBsPLA2，更具体地其分泌形式。人GIBsPLA2的氨基酸序列以SEQ ID N0:2提 供。
[0347] 实施例9:PLA2sGIB诱导⑶4淋巴细胞的无应答性(无反应性）
[0348] 实施例7显示了尽管诱导aMMD，但PLA2sGIB诱导对IL-7诱导的磷酸STAT5核转位 (NT pSTAT5)的阻断。因此，⑶4T淋巴细胞不响应IL-7,并且尽管HIV患者的血浆中的高水平 的此细胞因子，其数目减少，然后导致⑶4淋巴细胞减少，即感染HIV的患者的标志。
[0349] 这里，我们调查了PLA2sGIB也参与无反应性的诱导（来自慢性HIV感染患者的⑶4 淋巴细胞的另一个特征)的可能性。
[0350] 生物测定法
[0351] MMD 诱导：
[0352] 首先将含有PLA2sGIB的VP血浆在培养基中与纯化的HD CD4T细胞一起温育 (20min)。然后，在经聚赖氨酸包被的玻璃载玻片上铺开细胞，再持续lOmin。然后，用低聚甲 醛(PFA，1.5%，15min于37°C，接着在室温15min)固定它们，之后通过霍乱毒素 B(CtxB-AF488)染色，通过CW-STED显微术计数MMD。
[0353] 对STAT磷酸化和核转位的抑制：
[0354] 首先将含有PLA2sGIB的VP血浆与纯化的HD⑶4T细胞一起温育（20min)，之后，通 过IL-7(2nM，15min.)刺激。然后，在经聚赖氨酸包被的玻璃载玻片上铺开细胞，之后通过 PFA(1.5 % )固定，并且通过甲醇(90 %在-20 °C)透化。然后，通过用山羊抗兔Atto642标记的 兔抗STAT5染色pSTAT5,并且通过FACS或脉冲STED显微术分析。
[0355]
[0356] 图10a显示了在暴露于PLA2GIB(病毒血患者的血浆)后，来自健康供体(HD)的⑶4 淋巴细胞变得不能响应IL-2,如通过对IL-2诱导的NT pSTAT5的抑制测量。此抑制总体用 3%血浆，并且用1 %血浆是高度显著的(p〈0.0001)。
[0357] 我们进一步研究了⑶4+⑶25+T reg淋巴细胞对PLA2GIB的响应。图10b中呈现了结 果。如显示，虽然100%的健康细胞通过NT PSTAT5响应IL-2,但是PLA2GIB(病毒血患者的 1 %血浆)完全抑制此信号转导机制。由于⑶4+⑶25+细胞代表总体⑶4T细胞的小于5%，它们 不能显著影响图l〇a中呈现的数据。
[0358] IL-7和IL-2是gamma c细胞因子家族的成员。为了确认对此细胞因子的无应答性 可以与gamma c联系起来，我们测试了对IL-4的响应。通过追踪pSTAT6的IL-4诱导的NT测量 IL-4响应（图11)。我们的结果清楚显示了 IL-4响应受到PLA2GIB抑制（用3%血浆完全地和 1 %血浆较大地）。
[0359] 因此，这些结果显示了由gamma c家族的细胞因子诱导的信号传导机制被PLA2GIB 改变。这与我们的下述发现完全一致:发现gamma c受体链在来自HIV患者的CD4淋巴细胞表 面上自发找到的aMMD中完全隔离(数据未显示）。
[0360] 实施例10:PLA2GIB的重组形式的活性
[0361] 在本实施例中，测试了PLA2GIB蛋白的各种纯化形式的活性，以进一步确认纯化形 式的此蛋白质对免疫系统的影响，并且进一步确认其特异性。
[0362] 酶促测定法
[0363] 用来自Life Technologies的Enz Check PLA2测定试剂盒(ref · :E102147)进行测 定法。此测定法提供了 PLA2酶活性的连续的快速实时监测。通过515nm的单一波长的强度增 加追踪PLA2活性。通过515/575nm的发射强度比率以及460nm激发的变化检测PLA2。比活以 每秒和溶液中的每yg酶获得的荧光底物的量(U)表示。
[0364] 莖里
[0365] 下文表2中提供了结果。
[0366] 表2:重组PLA2GIB蛋白的活性
[0367]
[0368] 结果显示了大肠杆菌中生成的重组人PLA2GIB展现出有力的酶促活性。此外，结果 还显示了大肠杆菌中生成的重组猪PLA2GIB与重组人PLA2GIB具有相似的比活。比较而言， 重组PLA2GIIA和PLA2GIID没有活性，并且PLA2GX具有非常有限的活性。
[0369] 如此，重组PLA2GIB代表一种用于本发明的有力的活性剂。
[0370] 实施例11 :PLA2sGIB对⑶4淋巴细胞的影响牵涉其酶促活性。
[0371] 在本实施例中，我们调查了PLA2sGIB对CD4淋巴细胞的活性是否牵涉PLA2sGIB的 酶促(例如催化)活性(例如是PLA2sGIB的酶促(例如催化)活性的结果）。此类酶促活性会修 改膜结构，导致⑶4淋巴细胞的表面上形成多个aMMD。
[0372] 在这些实验中，我们测试了PLA2sGIB的突变体，其中第48位的重要组氨酸被替换 为谷氨酰胺（突变体H48Q)。使用实施例10中描述的酶促测试，我们比较大肠杆菌中生成的 重组猪PLA2GIB的酶促活性与也在大肠杆菌中生成的突变体H48Q的活性。在200微摩使用每 种蛋白质。如图12显示，突变体已经丧失其全部酶促活性，例示了 PLA2GIB中的第48位组氨 酸的关键作用。
[0373] 我们然后在生物测定法中比较了野生型猪PLA2GIB与其突变体H48Q的活性。图13 中呈现的结果显示了突变体已经丧失wtPLA2GIB诱导aMMD或降低或消除IL-7诱导的pSTAT5 核转位(NT pSTAT5)的能力。
[0374] 如此，这些结果证明了酶促活性参与PL2GIB对⑶4淋巴细胞的病理学影响。
[0375] 实施例12:抗GIBsPLA2抗体恢复HIV病毒血患者的血浆中的⑶4-T细胞活性。
[0376] 本实施例例示了在病毒血患者的血浆中，GIBsPLA2将⑶4淋巴细胞从HD转化成"患 病"淋巴细胞，其与感染HIV的患者的血液中表征的那些淋巴细胞相当。本实施例进一步显 示了抗GIBsPLA2抗体的确有效抑制病原性活性。
[0377] 在第一个实验系列中，通过用针对人GIBsPLA2的山羊抗体或针对无关抗原的两种 对照山羊抗体包被的Sepharose珠处理血衆。图14(a)清楚显示了抗GIBsPLA2抗体完全消除 或除去血浆的活性，其变得不能诱导来自HD的CD4淋巴细胞中的异常MMD。对照I和对照II抗 体没有影响。对于每种血浆将这些实验重复三次，并且研究来自病毒血患者的三种不同血 浆。
[0378] 图14(b)显示了相同的结果。在这里，如上文处理血浆，但是使用第二种生物测定 法分析。通过用抗GIBsPLA2抗体包被的Sepharose珠处理血浆不再抑制IL-7诱导的pSTAT5 核转位。对照I和对照II山羊抗体不影响来自病毒血患者的血浆抑制IL-7诱导的pSTAT5核 转位的能力。
[0379] 在第二个实验系列中，我们测试了特异性针对人GIBsPLA2、-GIIA和-GIID的中和 性兔抗体的效果。在生物测定法期间将这些抗体与血浆和细胞一起温育。获得的结果显示 了抗GIBsPLA2抗体中和病毒血血浆的效果，如通过诱导异常MMD和通过抑制IL-7诱导的 PSTAT5核转位测量。值得注意的是，针对分泌性PLA2-GIIA或分泌性PLA2-GIID(与GIBsPLA2 紧密相关的两种磷脂酶)的抗体在此测试中没有效果。
[0380] 这些结果显示了抗GIBsPLA2抗体可以恢复并且防止病毒血血浆的免疫抑制效果。 这些结果显示了抗GIBsPLA2抗体可以防止免疫缺陷，并且再刺激免疫缺陷受试者中的免疫 应答。
[0381] 这些结果进一步证明了响应是特异性的。GIBsPLA2是参与检查的病理学效应并且 表征病毒血患者的血浆的唯一效应物。
[0382] 实施例13:抗PLA2GIB抗体抑制PLA2GIB对CD4细胞的影响。
[0383] 使用克隆并纯化的人PLA2G1B免疫兔。制备相应的血清的免疫球蛋白级份。在放射 性标记的大肠杆菌膜上测量它们抑制PLA2G1B的酶促活性的能力。将活性免疫球蛋白级份 添加到生物测定法，其包含自健康供体的血浆纯化的CD4淋巴细胞。随后，将克隆并纯化的 分泌性PLA2(GIB，GIIA，GIID和GX)添加至培养物。作为对照，使用自用各种分泌性PLA2免疫 的兔制备的免疫球蛋白级份。
[0384] 图15显示了多克隆抗体的不同浓度抑制aMMD的诱导（图15a)，并且阻断IL-7诱导 的NT pSTAT5(图15b)。此活性可以获自lμg/ml至100μg/ml含有抗PLA2GIB抗体的Ig。此活性 是完全特异性的，因为针对PLA2GIIA，PLA2GIID或PLA2GX的抗体在生物测定法中没有显示 效果(图15a和b)。
[0385] 如此，这些结果进一步证明了抑制PLA2GIB可以用于治疗免疫缺陷并且恢复⑶4活 性。
[0386] 实施例14:可溶性PLA2GIB受体抑制PLA2GIB对CD4T细胞的影响。
[0387] 作为PLA2GIB抑制剂可以施加治疗效果的进一步证明，我们测试了PLA2GIB受体的 可溶形式。
[0388]在第一个实验系列中，我们使用具有以下氨基酸序列（SEQ ID N0:22)的对 PLA2GIB特异性的可溶性鼠受体：
[0414] 在1 OOnM的浓度，在实施例9中描述的生物测定法中测试抑制剂。图16中呈现了结 果。它们显示了重组PLA2可溶性受体可以用作有力的拮抗剂，并且此类分子能够显著阻断 PLA2sGIB对pSTAT5NT的负面影响（图16)。
[0415] 可以使用包含SEQ ID N0:25或28的序列的PLA2-GIB结合多肽在进一步的实验组 中获得相似的结果。
[0416] 实施例15:GIBsPLA2的过表达诱导免疫学缺陷
[0417]先前已经显示了降低病毒载量的高度活性抗逆转录病毒疗法(Highly Active Anti-Retroviral Therapy，HAART)在大多数患者中也诱导⑶4计数增加。然而，在一些患者 中，尽管实际上HIV变得不能检出，CD4计数不增加。我们先前已经研究了此临床情况，并且 我们已经显示了在这些称作⑶4非响应者(CD4-NR)的患者中，发现⑶4T淋巴细胞群体的强 烈且持久的缺陷。
[0418]图17显示了⑶4-NR患者的血浆的确比用作对照的来自病毒血患者的血浆含有更 多的PLA2GIB活性。这首先通过每个细胞的异常MMD的诱导测量。这些数据也通过测量抑制 IL-7诱导的pSTAT5核转位的能力确认。
[0419] 结果共同显示了 CD4-NR患者的血浆比来自病毒血患者的血浆含有多100倍的 PLA2GIB 活性。
[0420]
[0421] 我们的结果显示了PLA2GIB诱导与表征来自病毒血患者的⑶4T细胞的免疫抑制相 似的免疫抑制，包括不能响应IL-2 (无反应性)和IL-7 (针对CD4淋巴细胞减少的中心机制）。 因此，在HIV感染期间的GIBsPLA2表达在表征这些患者的免疫疾病的病理生理学中发挥中 心作用。这些缺陷是细胞类型特异性的，因为来自HIV患者的CD8T淋巴细胞不展现出异常的 MMD，并且继续响应IL-7(数据未显示KPLA2GIB的作用模式可能是其酶促活性的结果。通过 攻击CD4淋巴细胞的膜，它修饰其流动性，并且可能容许异常且非常大的MMD的形成。
[0422]炎性反应在HIV感染期间发挥重要的作用。然而，它们在HIV发病机制中的确切作 用仍然有待阐明。考虑到我们的数据，可以假设HIV感染诱导非常奇怪的炎症类型，其包括 GIBsPLA2。此外，可以推测在PLA2GIB诱导后，其分泌逃逸到正常的调节过程，因此导致长期 生成和免疫学病症，其是CD4T淋巴细胞功能障碍的直接后果。作为CD4T淋巴细胞功能障碍 的间接后果，还可以观察到其它缺陷。例如，减少的干扰素 gamma生成会降低单核细胞/巨噬 细胞和天然杀伤者的功能。
[0423] 血浆PLA2GIB活性的恢复和不同组患者的特征之间的关联也是非常有信息的。 "HIV控制者"是非常罕见的患者，其在数年里维持检测不到的病毒载量和准正常的CD4计 数。我们的结果显示了他们在其血浆中不表达PLA2GIB活性。比较而言，在大多数患者中，此 酶是表达的，并且代表导致免疫学疾病的炎性的负面。总之，这清楚建立PLA2GIB是HIV感染 的病理生理学中的非常重要的参数。
[0424] HAART病毒载量降低继之以免疫恢复，包括⑶4计数增加。在此治疗期间，PLA2GIB 活性在患者的血浆中消失。由于认为HAART降低炎性反应，这进一步提示了 PLA2GIB是这些 炎性过程的部分。更重要的是，我们在本文描述了仍然具有非常低的CD4计数的CD4-NR患者 的情况，而HAART控制器病毒载量。这些个体中发现的PLA2GIB过度生成可以解释免疫疾病 的持续性，其表征了此临床状态。因此，在HAART后，导致免疫修复的PLA2GIB的降低生成或 导致免疫疾病的不可逆性的其持续过度生成之间有强烈关联。
[0425] 此发现的治疗结果和效用是巨大的。对PLA2GIB的抑制的确可以用于预防或治愈 HIV患者以及更一般地免疫抑制受试者的免疫学疾病。感染期间早期应用，PLA2GIB抑制剂 将患者引导到HIV控制者状态。后来单独或与HAART结合/交替应用，它们加速CD4T淋巴细胞 功能的恢复，并且通过加强宿主防御，与在许多其它病毒慢性感染中一样，PLA2GIB抑制剂 导致病毒和免疫系统之间的平衡。因此，PLA2GIB抑制剂代表单独或组合用于治疗与异常免 疫应答或活性有关的病症的非常有力的药剂。它们也可以帮助省下HAART，并且可以导致这 些治疗的中断，所述治疗在它们的严重不利效果方面是已知的。
[0426] 此外，由于GIBsPLA2表达的缺乏(与在相应的基因方面K0的小鼠中一样)是完全容 忍的，使用抑制剂或者经由疫苗接种对GIBsPLA2的瞬时或永久抑制代表一种用于免疫疾 病，特别是HIV患者的强烈且有效的免疫疗法。
[0427] 参考文献
[0428] (l)Grossman Z,Meier-Schellersheim M,Sousa AE,Victorino RMM,Paul WE (2002)CD4+T_cell depletion in HIV infection:are we closer to understanding the cause?Nat Med 8(4):319-323
[0429] (2)Catalfamo M，et al·(2008)HIV infection-associated immune activation occurs by two distinct pathways that differentially affect CD4and CD8T cells.PNAS 105(50):19851-19856.
[0430] (3)Armah KA,et al.(2012)HIV status, burden of comorbid disease and biomarkers of inflammation,altered coagulation，and monocyte activation.Clin Infec Dis 55(1)126-36.
[0431] (4)David D,et al.(1998)Regulatory dysfunction of the Interleukin-2receptor during HlV-infection and the impact of triple combination therapy.PNAS 95:11348-11353.
[0432] (5)Colle JH?et al.(2006)Regulatory dysfunction of the interleukin-7receptor in CD4and CD81ymphocytes from HIV-infected patients-effects of antiretroviral therapy.J Acquir Immune Defic Syndr 42(3):277-285·
[0433] (6)Kryworuchko M,Pasquier V,Theze J(2003).Human Immunodeficiency Virus-lenvelope glycoproteins and anti_CD4antibodies inhibit Interleukin-2induced Jack/STAT signaling in human CD4T lymphocytes.Clinical and Experimental Immunology 131(3):422-427.
[0434] (7)Landires I，et al.(2011)HIV infection perturbs IL_7signaling at the step of STAT5nuclear relocalization.AIDS 25(15):1443-1453.
[0435] (8)Vranjkovic A,Crawley AM,Patey A,Angel JB(2011)IL-7dependent STAT-5activation and CD8+T cell proliferation are impaired in HIV infection.J Leukoc Biol 89(4):499-506.
[0436] (9)Benoit A，et al.(2009)Inverse association of repressor growth factor independent-lwith CD8T cell interleukin(IL)-7receptor[alpha]expression and limited signal transducers and activators of transcription signaling in response to IL-7among[gamma]-chain cytokines in HIV patients. AIDS 23(11): 1341-7.
[0437] (10)Rose T，et al.(2010)Interleukine-7compartimentilizes its receptor signaling complex to initiate CD4 T lymphocyte response.J Biol Chem 285(20): 14898-14908.
[0438] (ll)Lingwood D,Simons K(2010)Lipid rafts as a membrane-organizing principle.Science 327(5961):46-50.
[0439] (12)Tamarit B，et al.(2013)Membrane microdomains and cytoskeleton organisation shape and regulate the IL-7-receptor signalosome in human CD4T-cells.J Biol Chem.
[0440] (13)Beq S,et al.(2004)HIV infection:pre-highly active antiretroviral therapy IL-7 plasma levels correlate with long term CD4 cell count increase after treatment.AIDS 18(3):563-5.
[0441] (14)Rose T,Lambotte 0,Pallier C,Delfraissy JF,Colle JH(2009) Identification and biochemical characterization of human plasma soluble IL_ 7R:lower concentrations in HIV-1 infected patients.J Immunol 182(12):7389-97.
[0442] (15)Sauce D,Elbim C,Appay V(2013)Monitoring cellular immune markers in HIV infection:from activation to exhaustion.Curr Opin HIV AIDS 8:125-131.
[0443] (16)Younes SA,et al.(2003)HIV-1 viremia prevents the establishment of interleukin-2 producing HIV-specific memory CD4+T cells endowed with proliferative capacity.J Exp Med 198:1909-1922.
[0444] (17)Sirskyj D,Theze J,Kumar A,Kryworuchko M(2008)Disruption of the gamma c cytokine network in T cells during HIV infection.Cytokine 43(1):1-14.
[0445] (18)Pallikkuth S，Parmigiani A，Pahwa S(2012)The role of interleukin-21in HIV infection.Cytokine 23(4-5):173-80.
[0446] (19)Vingert B,et al.(2012)HIV Controllers maintain a population of highly efficient TH1 effector in contrast to patients treated in the long term.J Virol 86(19):10661-10674.
[0447] (20)Sandler NG,Douek DC(2012)Microbial translocation in HIV infection:causes，consequences and treatment opportunities.Nat Rev Microbiol 10(9):655-66.
【主权项】
1. 调控GIBSPLA2的量或活性的化合物，用于调控有此需要的受试者中的免疫应答的用 途。2. 权利要求1的用途的化合物，其中所述化合物是GIBsPLA2抑制剂或配体。3. 权利要求1的用途的化合物，其中所述化合物诱导或刺激所述免疫应答。4. 权利要求2的用途的化合物，其中所述GIBsPLA2抑制剂或配体选自：抗GIBsPLA2抗体 或其衍生物、抑制性核酸、可溶性受体、肽、或小药物。5. 权利要求4的用途的化合物，其中所述GIBsPLA2抑制剂或配体选自：抗GIBsPLA2多克 隆抗体、单克隆抗体、其片段，所述片段选自F(ab'）2和Fab片段、单链可变片段(scFv)、单域 抗体片段(VHH或纳米抗体）、二价抗体片段(双抗体），以及重组和合成生成的结合配偶体、 人抗体或人源化抗体或其片段。6. 权利要求1至5中任一项的化合物，用于诱导或刺激所述受试者中的CD4T细胞的用 途。7. 权利要求1至6中任一项的用途的化合物，其中所述受试者是免疫缺陷或免疫抑制 的。8. 权利要求1至6中任一项的用途的化合物，其中所述受试者具有传染病。9. 权利要求8的用途的化合物，其中所述受试者具有病毒性感染。10. 前述权利要求中任一项的化合物，用于治疗感染HIV的受试者中的AIDS的用途。11. 权利要求10的用途的化合物，用于抑制或反转HIV介导的免疫缺陷。12. 权利要求1至6中任一项的用途的化合物，其中所述受试者具有癌症。13. 权利要求1的用途的化合物，其中所述化合物是GIBsPLA2激动剂或活化剂，并且所 述化合物降低免疫应答。14. 权利要求13的用途的化合物，其中所述GIBsPLA2激动剂或活化剂是GIBsPLA2蛋白 或其片段。15. 权利要求13或14的用途的化合物，其中所述受试者具有由病理性或异常免疫应答 引起的疾病，优选选自自身免疫性病症、炎性疾病、癌症、荨麻疹、湿疹、变态反应或哮喘。16. 权利要求1或13-15中任一项的化合物，用于降低受试者中的移植物排斥或者降低 GVHD的用途。17. 前述权利要求中任一项的用途的化合物，其中通过注射，优选肌肉内、皮下、经皮、 静脉内或动脉内；通过鼻、口服、粘膜、直肠施用或者通过吸入施用所述化合物。18. 药物组合物，其包含GIBsPLA2调控剂和药学可接受载体或赋形剂。19. 诱导抗GIBsPLA2免疫应答的免疫原，用于调控有此需要的受试者中的免疫系统的 用途。20. 权利要求19的用途的免疫原，其中所述免疫原包含人或动物GIBsPLA2蛋白、蛋白质 片段或肽、或其抗原性片段或模拟位。21. 权利要求19或20的用途的免疫原，其中所述免疫原为游离形式、聚合的、或化学或 物理修饰的、和/或与载体连接的。22. 权利要求19-21中任一项的用途的免疫原，其中所述免疫原与佐剂组合。23. 权利要求19-22中任一项的用途的免疫原，其中所述免疫原诱导中和性抗体。24. 疫苗组合物，其包含诱导抗GIBsPLA2免疫应答的免疫原、药学可接受载体或赋形剂 和任选地佐剂。25. 权利要求23的组合物，其中所述免疫原包含GIBsPLA2蛋白或肽，或其抗原性片段或 模拟位。26. 权利要求24的组合物，其中所述GIBsPLA2蛋白或其抗原性片段或模拟位为游离形 式、聚合的、或化学或物理修饰的、或与载体连接的，并且任选地与佐剂组合的。27. 用于诊断与T细胞改变有关的人免疫缺陷的方法，其包括： (a) 提供含有来自受试者的体液或组织碎片或细胞的样品，并 (b) 检测或量化所述样品中的GIBsPLA2。28. 重组细胞，其中所述细胞或其祖先已经被修饰为含有编码GIBsPLA2的核酸。29. 用于产生GIBsPLA2的方法，其包括在容许GIBsPLA2表达的条件下培养权利要求28 的细胞，并且收集GIBsPLA2。
【文档编号】C12N9/20GK105980408SQ201480075437
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2014年12月22日
【发明人】J.泰泽, T.罗斯, F.巴高尔特
【申请人】巴斯德研究院