专利名称：凋亡抑制因子api4基因为靶标的反义寡核苷酸结构和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及反义寡核苷酸的结构及其用途，具体地说涉及凋亡抑制因子基因靶标的反义寡核苷酸的结构和用途。
肿瘤分子生物学研究表明，肿瘤是由于基因异常引起的疾病。致病机理包括癌基因的激活和抑癌基因的失活以及细胞周期的异常。肿瘤发病分子机理的进一步阐明为肿瘤的基因治疗提供了可靠的理论依据。近年来肿瘤研究的热点是肿瘤的发生与细胞周期，细胞增殖，细胞凋亡有密切关系。反义技术是近十几年兴起的生物高技术，用反义技术封闭和抑制特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分。1978年Stephenson和Zamenick用互补寡聚核苷酸特异性抑制Rous肉瘤病毒的复制，首次提出了反义寡聚脱氧核糖核苷酸(ASODN)抑制基因表达的概念。ASODN是根据Watson-Crick碱基配对原理能够与mRNA的碱基对互补阻止其翻译成蛋白质的DNA。反义寡核苷酸具有定向合理设计，体内外作用高效和能人工大规模合成等药用特性，因而近年来成为治疗病毒感染，肿瘤，及其它由于基因表达异常引起的疾病的一类潜在型药物，其中肿瘤相关基因可作为反义药物作用的靶标。
本发明的目的是根据肿瘤相关基因API4设计12条寡核苷酸序列(见表1)，采用PE公司产391A型DNA合成仪合成并采用硫代修饰，经Micro PureII反向柱(Solid PhaseScience)纯化后，以此产物作为肿瘤的治疗药物。
表1 反义寡核苷酸序列及性质序号 靶位(nt)长度(nt) 特性 序列(5’-3’)1644-663 20AGCAGAAGCACCTCTGGTGCC2748-767 20ATTCTCACCTGGTAAGCCCGG3916-935 20AGATAAGGAACCTGCAGCTCA41002-1021 20ACACACAAGTCATGCATCTAC51403-1422 20ACCGTGTGGAGAACGTGACAG612-31 20AGCCAACGGGTCCCGCGATTC733-52 20ACATGCCGCCGCCGCCACCTC838-57 20AGCACCCATGCCGCCGCCGCC946-65 20AAACGTCGGGGCACCCATGCC10 36-55 20AACCCATGCCGCCGCCGCCAC11 29-48 20ACCGCCGCCGCCACCTCTGCC12 42-61 20ACGGGGCACCCATGCCGCCGC本发明的主要内容是选取了API4基因作为靶标进行抗肿瘤反义寡核苷酸的筛选和评价，API4是凋亡抑制因子(IAP)，IAP抑制细胞凋亡可调节组织分化，促进突变发生和产生治疗抗性而促进新生物中细胞的异常增殖导致肿瘤发生。API4在胚胎发育中起作用，在成熟发育的组织中则不出现，而在最终发展成肿瘤的转化细胞中表达。人类许多肿瘤如肺癌，结肠癌，胰腺癌，前列腺癌，乳癌及50％的淋巴瘤均可出现较高表达。
在针对API4基因的12条反义寡核苷酸中，10#的体外抑制细胞增殖作用最强且具有持续性，在用药后的4天内细胞增殖抑制率持续上升，第四天抑制率达到97％的峰值，至第5天开始缓慢下降，第六天降至82.4％。10#序列的二级结构由内环-茎-内环-茎-膨胀环-茎-发夹部组成(A＝3，T＝1，C＝12，G＝4)。
10#药物对荷HepG2人肝细胞癌(接种的细胞数为3×106个/只)裸鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作用，抑瘤率可达63.9％；此药物对裸鼠的体重及生长状态无明显影响，无肉眼可见的毒性。瘤组织的病理切片表明，用药组瘤组织大片坏死，组织间有纤维化，瘤周多为淋巴细胞浸润，而对照组以弥漫性点状，片状坏死为主，瘤周炎细胞浸润以中性粒细胞和单核细胞为主。结果证明10#硫代寡核苷酸体内外具有抑瘤率高、持续时间长、毒性低等优点。
根据本发明，发明中所涉及的寡核苷酸或其修饰组成物可用于治疗肝癌。
根据本发明，发明中针对API4基因治疗肿瘤的优选序列为10#序列。下面结合附图，对本发明的具体实施作详细说明
图1为反义寡核苷酸在细胞水平上的增殖抑制率；图2为反义寡核苷酸序列的优化；图3为反义寡核苷酸在细胞水平上作用时间的持续性；图4为反义寡核苷酸对于荷肝细胞癌裸鼠肿瘤体积的抑制情况；图5为反义寡核苷酸对于荷肝细胞癌裸鼠体重的抑制情况；图6为反义寡核苷酸对于荷肝细胞癌裸鼠肿瘤重量的影响。
实施例一体外抗肿瘤活性ASODN筛选和评价1.材料和方法1.1 反义寡核苷酸的设计和合成本研究选取了API4基因作为靶标进行抗肿瘤反义寡核苷酸的筛选和评价，基因序列由Genbank获得，通过国际互联网引入RNAStructure 3.2分析软件，选择RNA二级结构中膨胀环，内环，发夹，多分支连接部等结构不稳定的区域作为反义药物作用的靶点，针对API4 mRNA的二级结构设计了5条针对3’非编码区的序列和4条针对5’非编码区的序列1-9(具体序列见表1)。反义硫代寡聚核苷酸为无色粉末状，合成后浓氨水55℃脱保护15小时，然后用反相柱(购自solid phase sciense公司)层析纯化。体外实验用无双抗的DMEM培养基配制，体内实验用生理盐水配制，保存于-20℃。1.2 细胞培养、脂质体转染及细胞增殖抑制活性测定人肝癌(HepG2)细胞株由军事医学科学院提供。将其用含10％小牛血清及100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM培养液，置37℃，5％CO2孵箱培养。在96孔细胞培养板中，每孔接种5×103细胞/0.2ml。待50-60％细胞融合后，在无血清状态下，采用lipofectin(GIBCO，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行硫代反义寡核苷酸转染。每条硫代反义寡核苷酸设置3个浓度，分别为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L.每个浓度3孔，每孔总体积为100μl，并设置细胞和脂质体对照。转染5小时后，换含10％小牛血清的DMEM培养基培养19小时，于培养48小时后，每孔加20μl MTS(Promega)，并继续培养90分钟，于492nm测定光吸收，计算抑制率。1.3 10#作用持续时间测定HepG2细胞接种于96孔板(3000/孔)，待50-60％细胞融合后，转染10#一次，终浓度为0.2μmol/L。分别于转染后第1-6天，各取3孔细胞测定细胞增殖抑制情况，观察其作用持续时间。2实验结果2.1反义寡核苷酸作用靶位的选择针对API4mRNA的二级结构设计了5条针对3’非编码区的序列和4条针对5’非编码区的序列1-9(序列见表1)。图1所示，针对5’编码区的7#序列在0.2μM时抑制率是68.5％，0.4μM时抑制率是79.7％，0.8μM时抑制率是89.1％。它的细胞增殖抑制作用最强。2.2 反义寡核苷酸序列的优化在反义寡核苷酸设计中发现一个有效的序列后，往往对其进行优化。观察碱基的移动对其作用的影响。因此我们以7#序列为中心进行优化，向其5’端，3’端移动几个碱基设计了3条反义寡核苷酸，在96孔板上评价体外对HepG2细胞生长的抑制，目的是筛选出更加有效的药物。7#序列向3’端移动3个碱基的10#序列对HepG2细胞的抑制率高于其它3条序列。因此选择10#序列为体内动物实验的药物，从12条序列中筛选出了一条序列。10#的IC50是0.039μM。10#序列的二级结构由序列的二级结构由内环-茎-内环-茎-膨胀环-茎-发夹部组成。A＝3，T＝1，C＝12，G＝4。2.3 反义寡核苷酸作用的持续时间作用的持续时间不仅是评价反义核酸药物的一个重要指标，同时对于给药方案具有重要的参考价值。图3可以看出在肝癌细胞(HepG2)中，终浓度0.2μmol/L的10#脂质体介导转染给药1次后，1-4天抑制活性逐渐增加，第4天达到97％的峰值，然后缓慢下降，到第6天抑制率为82.4％。实施例二动物体内抗肿瘤活性ASODN的评价1.材料和方法1.1 裸鼠的饲养，移植瘤的接种和药物处理Balb/c(nu/nu)裸鼠18-22克，雌性由北京医科大学动物中心提供。将Balb/c(nu/nu)裸鼠饲养于二级动物房的层流柜中，自由摄取食物和水，大量扩增HepG2肿瘤细胞，用0.2％胰酶溶液消化和收集细胞，用PBS清洗两次后，调节细胞浓度为1.5×107个细胞/毫升，于每个裸鼠左后肢腋窝皮下接种0.2毫升。接种细胞后第5日，确认肿瘤细胞生长并可触及后，给裸鼠分为两组，给药组每日腹腔注射药物一次0.1毫升的10#，(25mg/kg)，对照组给予相应量的生理盐水，每周测量两次肿瘤的重量观察记录肿瘤的大小(用游标卡尺)，按下列公式计算肿瘤的相对体积V＝L×W2×1/2，式中V为肿瘤体积(mm3)；L、W分别为瘤体最长和最短的两个径(mm)。待裸鼠行动困难时，处死。用药共28天，称量瘤重量制备病理切片。1.2光镜病理检查标本的制备标本在10％福尔马林溶液固定72小时，经石蜡包埋切片，H-E染色，在光镜下阅片。2 实验结果2.1 反义寡核苷酸对于荷肝细胞癌裸鼠肿瘤生长的抑制情况荷瘤裸鼠在接种肿瘤的第三天即可见其生长，第五天可触及肿瘤并开始用药，在用药的四天内用药组与对照组相比，肿瘤体积无差异，第八天时出现差别，第15天后两者差别显著，从图4中可见对照组体积增长迅速而用药组体积增长缓慢。10#药物使瘤体积倍增22.16倍，而对照组瘤体积倍增了81.55倍。从用药期间裸鼠体重的变化曲线看，所有裸鼠体重均呈增长趋势，作方差分析表明10#组与对照组相比有显著性差异，10#组抑制率达63.9％。肿瘤的病理切片显示两组肿瘤均有变性和坏死，程度以用药组严重，10#组肿瘤中心部有囊腔形成，炎细胞浸润用药组以淋巴细胞浆细胞为主，对照组以中性粒细胞和单核细胞为主，两组均有部分裸鼠呈现纤维组织增生。
权利要求
1.与凋亡抑制因子基因5’和3’非编码区及翻译起始区互补、长度为10-30个碱基并包含下列序列的寡核苷酸(序列为5’到3’)1〕GCAGAAGCACCTCTGGTGCC；2〕TTCTCACCTGGTAAGCCCCG；3〕GATAAGGAACCTGCAGCTCA；4〕CACACAAGTCATGCATCTAC；5〕CCGTGTGGAGAACGTGACAG；6〕GCCAACGGGTCCCGCGATTC；7〕CATGCCGCCGCCGCCACCTC；8〕GCACCCATGCCGCCGCCGCC；9〕AACGTCGGGGCACCCATGCC；10〕ACCCATGCCGCCGCCGCCAC；11〕CCGCCGCCGCCACCTCTGCC或12〕CGGGGCACCCATGCCGCCGC。
2.根据权利要求书1所述的反义寡核苷酸，其特征在于含下列序列6〕GCCAACGGGTCCCGCGATTC；7〕CATGCCGCCGCCGCCACCTC；10〕ACCCATGCCGCCGCCGCCAC或11〕CCGCCGCCGCCACCTCTGCC。
3.根据权利要求书1所述的反义寡核苷酸，经化学修饰后在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及反义寡核苷酸的结构及用途,具体地说是根据凋亡抑制因子肿瘤相关基因(APl4)设计并制备的反义寡核苷酸。采用人肝癌(HepG2)细胞株及Balb/c(nu/nu)裸鼠接种肝癌细胞为模型,对所设计、制备的12条反义寡核苷酸进行筛选及评价。体外实验可有效地抑制人肝癌细胞生长,且呈剂量依赖性关系;在荷瘤裸鼠模型中亦有效地抑制了肿瘤的生长。故本发明是针对肿瘤的反义寡核苷酸结构及其作为治疗肿瘤、减少肿瘤及其相关性疾病危害性的新型药物。
文档编号C07H21/00GK1358857SQ0013453
公开日2002年7月17日 申请日期2000年12月11日 优先权日2000年12月11日
发明者王升启, 林莉, 管伟, 王小红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所