微生物捕获用组合物和方法

专利名称：微生物捕获用组合物和方法
微生物捕获用组合物和方法相关专利申请的交叉引用本发明要求2007年12月31日提交的美国临时申请序列号61/018011的优先权， 该临时申请以引用方式并入本文。政府权利按照美国国防部核准的第DAAD-13-03-C-0047号(项目编号2640)和第 W81XWH-07-01-0354号(项目编号2750)合同的条款，美国政府可拥有本发明的某些权利。
背景技术：
用于确定多种样品(包括食品样品、临床样品、环境样品和实验样品在内)中微生 物的存在的测定法越来越重要。这类测定法可指示微生物负荷和/或鉴定所存在的微生 物。现有的定性和定量确定微生物的存在的技术通常涉及鉴定特定的微生物，如病原 菌。样品中具体微生物(如细菌)的存在的成功检测依赖于样品中的细菌浓度。通常，将 细菌样品进行培养，目的是评估存活力和增加样品中的细菌数目以确保有足够的水平供检 测。培养步骤需要很多时间，这会延迟获得检测结果。通过浓缩样品中的细菌，可用较短的培养步骤或者甚至不用培养步骤就可进行检 测。已开发出通过使用特定细菌菌株的特异性抗体来分离从而浓缩该菌株的方法。已提出了其他的非菌株特异性的浓缩方法，这种方法将使得可以对所存在的微生 物进行更全面的采样。菌株混合物当中的某种特定菌株或某几种特定菌株一旦得到分离， 可用已知的检测方法(包括例如核酸扩增方法)来进行鉴定和/或定量。已提出了用碳水化合物和凝集素蛋白的相互作用来非特异性分离微生物。存在于 细菌表面上的凝集素被提出作为连接到聚丙烯酰胺的某些碳水化合物的捕获靶标。充当微 生物营养物的物质也已被提出用作配体以供非特异性捕获微生物。这种营养物配体包括碳 水化合物、维生素、铁螯合化合物和铁载体(sidorophore)。支撑物支持的壳聚糖也已被提 出用于以非菌株特异性方式浓缩微生物，使得可以更容易和更快速地测定微生物。虽然一些微生物分离方法已得到了描述，但对于改进的用于分离微生物的材料和 方法仍继续存在着兴趣和需求。

发明内容
现已发现，生物素结合蛋白通过碳水化合物连接到固相支撑物，这样所得的组合 对于非特异性结合细菌细胞是有效的。固相支撑物上有碳水化合物但没有生物素结合蛋 白，这样所得的组合物被发现对于非特异性结合细菌细胞不太有效。此外，固相支撑物上有 生物素结合蛋白但没有碳水化合物，这样所得的组合物也被发现对于非特异性结合细菌细 胞不太有效。在一些实施例中，通过碳水化合物连接到固相支撑物的生物素结合蛋白，在甾 族化合物或三萜烯的两亲性糖苷存在下，对于非特异性结合细菌细胞更加有效。因此，本发明提供用于非特异性结合细菌细胞的新组合物。
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在一个实施例中，提供包含以下组分的组合物固相支撑物，该固相支撑物具有包 含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且 其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及1)多个非特异性结合于该碳水 化合物和该蛋白的组合的细菌细胞或者2)留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷中的至少一
者ο在另一个实施例中，提供包含以下组分的组合物固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表 面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑 物连接；以及多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。在另一个实施例中，提供包含以下组分的组合物固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表 面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑 物连接；以及留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。在另一个方面，提供分离细菌细胞的方法，所述方法包括提供固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的 表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支 撑物连接；提供怀疑具有多个细菌细胞的样品；使具有包含该碳水化合物和该生物素结合蛋白的组合的表面的该固相支撑物与 该样品接触；其中来自该样品的多个细菌细胞中的至少一部分非特异性结合于该固相支撑 物的表面；以及在来自该样品的多个细菌细胞中的该至少一部分非特异性结合于该固相支撑物 的表面后，使该固相支撑物与该样品的其余部分分离。在另一个方面，提供用于检测细菌细胞的装置，该装置包括一种组合物，该组合物包含固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表 面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑 物连接；以及多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞；以及用于检测细菌细胞的工具。在另一个实施例中，提供用于检测细菌细胞的装置，该装置包括
一种组合物，该组合物包含固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表 面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑 物连接；以及留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷；以及用于检测细菌细胞的工具。
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在另一个方面，提供试剂盒，该试剂盒包括固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表 面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑 物连接；以及留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。定义术语“留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷”指通过糖苷键与糖连接的留族化合物 或三萜烯，所得的物质具有两亲性特性即表面活性剂特性，该物质既有亲水性，也有亲脂 性。术语“生物素结合蛋白”指结合生物素的亲和力和选择性高的蛋白。本文所用的 “生物素结合蛋白”不包括被结合的生物素。术语“磁性颗粒”意指由铁磁性、顺磁性或超顺磁性粒子构成的颗粒、颗粒聚集物 或珠子(bead)，包括所述粒子在聚合物珠子中的分散体在内。本文所用的“一种”、“该”、“至少一种”和“一种或多种”可互换使用。术语“包括”和其变型形式在说明书和权利要求书中出现这些术语的地方不具有 限制的含义。以上“发明内容”并非意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以 下“具体实施方式
”更为具体地举例说明示例性的实施例。在“具体实施方式
”中的几个地 方，通过实例的列表来提供指导，这些实例可以以各种组合来使用。在每种情况中，所述及 的列表只是用作代表性的群组，不应被解释为是排他性的列表。
具体实施例方式本发明提供用于非特异性结合细菌细胞的新组合物。“非特异性结合”细菌细胞意 指该结合对于任何类型的细菌细胞来说都不是特异性的。因此，样品中的所有细菌都可与 样品中的其他成分分离，而不是靶向例如一种细菌菌株。革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细 菌都可以结合。所得的分离细菌然后可进行已知的检测方法，如细菌负荷检测。在一个实施例中，提供包含以下组分的组合物固相支撑物，该固相支撑物具有包 含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且 其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；和多个非特异性结合于该碳水化合物 和该蛋白的组合的细菌细胞。在另一个实施例中，提供包含以下组分的组合物固相支撑物，该固相支撑物具有 包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合， 且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；和留族化合物或三萜烯的两亲性糖 苷。对于某些实施例，这个组合物还包含多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组 合的细菌细胞。这些组合物可通过将上述的具有碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的固相支 撑物与多个细菌细胞或者留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷中的至少一者组合在一起来 制备。具有碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的固相支撑物可如下所述来提供。可通过 将固相支撑物悬浮或沉浸于缓冲液中，并加入同样悬浮于缓冲液中的细菌细胞和/或溶解于缓冲液中的两亲性糖苷，来便利地将固相支撑物与细菌细胞和/或两亲性糖苷组合在一 起。两亲性糖苷缓冲溶液优选含有约0. 2至约10重量/体积百分比(％ w/v)的两亲性糖 苷，更优选约0.5至约5% w/v。在另一个实施例中，提供分离细菌细胞的方法，所述方法包括提供固相支撑物， 该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水 化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；提供怀疑具有多 个细菌细胞的样品；使具有包含该碳水化合物和该生物素结合蛋白的组合的表面的该固相 支撑物与该样品接触；其中来自该样品的多个细菌细胞中的至少一部分非特异性结合于该 固相支撑物的表面；和在来自该样品的多个细菌细胞中的该至少一部分非特异性结合于该 固相支撑物的表面后，使该固相支撑物与该样品的其余部分分离。怀疑具有多个细菌细胞的样品可用已知的方法从多种来源提供。来源的例子包 括生理流体，例如血液、唾液、眼睛晶状体流体、滑液、脑脊髓液、脓、汗液、渗出物、尿液、黏 液、粘膜组织(例如口腔、齿龈、鼻、眼、气管、支气管、胃肠道、直肠、尿道(urethral)、尿道 (ureteral)、阴道、子宫颈和子宫的粘膜)、乳汁等。样品来源的更多例子包括获自例如以下 身体部位的样品伤口、皮肤、鼻孔、鼻咽腔、鼻腔、鼻前庭、头皮、指甲、外耳、中耳、嘴巴、直 肠或其他部位。样品来源的另外例子包括工艺液流、水、食品、土壤、植被、空气(例如受污 染的空气)、表面(如食品制作表面)等。已知的采样技术可用于从来源采集样品。例如，可从来源抽取一定体积的液体样 品，或者可用药签或擦拭物从生理表面或环境表面收集样品。有很多种药签或其他的样品 收集装置可市售获得。样品可以直接原样从收集装置提供用于上述方法，例如在含水液体的情况中。或 者，可以使用例如水、生理盐水、PH缓冲溶液或者任何其他可将样品从收集装置移除并将 样品配成悬浮液的溶液或溶液组合，将样品从收集装置中洗脱、释放或洗涤下来，来提供样 品。洗脱缓冲液的一个例子是磷酸缓冲盐水(PBS)，其可以与表面活性剂如聚氧乙烯失水山 梨醇单月桂酸酯或聚(氧乙烯-co-氧丙烯)嵌段共聚物组合使用。其他的提取溶液可起 到在从样品收集场所传送到样品分析场所的过程中保持样本稳定性的作用。这些类型的提 取溶液的例子包括Amies和Stuart传送介质。样品在与固相支撑物接触之前可以进行处理，如粘稠流体稀释、浓缩、过滤、蒸馏、 透析、稀释、天然成分失活、添加试剂、化学处理等。可通过将固相支撑物悬浮或沉浸于缓冲液中，并加入同样悬浮于缓冲液中的样 品，来便利地使具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面的固相支撑物与怀疑 具有多个细菌细胞的样品接触。合适的缓冲液包括PBS及PBS加非离子型表面活性剂。可 将所得的混合物搅拌一段时间，该时间足以让细菌细胞结合于固相支撑物上的碳水化合物 和生物素结合蛋白的组合。该结合可便利地在室温下进行。可用公知的方法，进行固相支撑物与样品的其余部分的分离。例如，可以使样品的 其余部分从固相支撑物流出、倾析出、吸出、离心出、移取出(用移液管)和/或过滤出。当 固相支撑物是磁性粒子时，可用磁体将固相支撑物固定于容器的一个区域中，以方便地除 去样品的其余部分，例如通过倾析、移液管移取或者用压差或重力(g-force)迫使上清液 流出容器来除去样品的其余部分。或者，可例如用缓冲液洗涤固相支撑物，以除去任何剩余的未结合的样品材料。对于某些实施例，分离细菌细胞的方法还包括检测该多个细菌细胞中的该至少一 部分。对于某些这些实施例，检测是通过选自以下的检测方法来进行通过生物发光进行 的腺苷三磷酸(ATP)检测、聚二乙炔(PDA)比色检测、核酸检测、免疫学检测、基于生长的检 测、表面声波检测等。ATP检测可用作细菌负荷的非特异性指标。在将具有非特异性结合的细菌细胞的 固相支撑物与样品的其余部分(其可能含有干扰性成分如胞外ATP)之后，可将细胞裂解并 与萤光素和萤光素酶接触。然后可例如用发光计测量所产生的生物发光，该生物发光的强 度与被捕获的细菌细胞的数量成比例。PDA比色检测可用于通过使比色传感器与细菌接触来检测特定细菌或一批细菌。 比色传感器包含受体和聚合组合物，该聚合组合物包括联乙炔化合物或聚二乙炔。当细菌 细胞被受体结合时，所产生的传感器构象变化引起可测量的颜色变化。该颜色变化可例 如目视测量或用比色计测量。使用能结合该受体的探针对细菌细胞进行间接检测，这也 可以采用。使用这种比色传感器的PDA比色检测是公知的，在例如美国专利申请公布号 2006/0134796A1、国际公布号 WO 2004/057331A1 和 WO 2007/016633A1 中以及在本受让人 的共同待审美国专利申请序列号60/989298中有描述。检测核酸(包括DNA和RNA)的方法常常包括使核酸扩增或杂交。将被捕获的细 菌细胞裂解以使细胞核酸可供检测。裂解可用酶法、化学法和/或机械法进行。用于裂解 的酶包括例如溶葡球菌酶、溶菌酶、变溶菌素或者其他的酶。化学裂解可用表面活性剂、碱、 热或其他手段进行。当用碱进行裂解时，可用中和试剂来中和裂解后的溶液或混合物。机 械裂解可通过用固体颗粒或微颗粒如珠子或微珠混合或剪切来进行。超声处理也可用于进 行裂解。裂解试剂可包括表面活性剂或去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂 (LLS)、TRITON系列、TffEEN系列、BRIJ系列、NP系列、CHAPS、N-甲基-Ν_(1_氧代十二烷 基)甘氨酸钠盐等，按需进行缓冲；离液剂如盐酸胍、硫氰酸胍、碘化钠等；裂解酶，如溶菌 酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、蛋白酶、链霉蛋白酶、纤维素酶或任何其他市售裂解酶；碱性裂 解试剂；固体颗粒如珠子，或者它们的组合。扩增方法的例子包括聚合酶链反应(PCR)；靶标多核苷酸扩增方法如自动维持 序列扩增(3SR)和链置换扩增(SDA)；基于连接到靶标多核苷酸的信号的扩增的方法，如 “支链” DNA扩增；基于探针DNA的扩增的方法，如连接酶链式反应(LCR)和QB复制酶扩增 (QBR)；基于转录的方法，如连接激活的转录(LAT)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、商品名 称为INVADER的扩增和转录介导的扩增(TMA)；和各种其他的扩增方法，如修复链式反应 (RCR)和循环探针反应(CPR)。弓丨物指导的核酸扩增方法，其包括例如热循环方法如PCR、LCR和SDA，可有利地用 于通过选择能与来自一批细菌的核酸杂交的探针来检测该批细菌。核酸杂交检测方法也是公知的。在这种方法中，使单链核酸探针与来自细菌细胞 的单链核酸杂交，以提供包含探针链的双链核酸。然后可进行定量和检测的核酸探针(探 针标记)如荧光标记、化学发光标记和放射性标记是已知的。此外，可使用菌种特异性探针 或菌种特异性探针的组合来检测特定细菌或多种不同的细菌。免疫学检测包括检测在细菌表面上充当标志物 生物分子，如蛋白、蛋白聚糖或其他具有抗原活性的物质，抗原物质的检测通常是通过抗体、从诸如噬菌体展示的过程选 择的多肽或得自筛选过程的适体来进行。免疫学检测方法是已知的，其例子包括免疫沉淀 和酶联免疫吸附测定(ELISA)。可通过几种方式检测抗体结合，包括通过用荧光染料、量子 点(quantum dot)或能产生化学发光或颜色变化的酶对第一抗体或第二抗体进行标记。读 板机和侧向流动装置已被用于检测和定量结合事件。基于生长的检测方法是公知的，通常包括将细菌平板接种，在特定条件下培养细 菌以增加细菌细胞的数量和计数细菌细胞。PETRIFILM好氧细菌计数板(3M公司，美国明尼 苏达州St. Paul市)可用于此目的。表面声波检测，例如在国际公告号WO 2005/071416中所述的，也已知可用于检测 细菌细胞。例如，已将本体声波_阻抗传感器用于检测固体介质表面上的细菌细胞的生长 和数量。此方法可检测的细菌浓度范围为3. 4X IO2至6. 7X IO6个细胞/ml。参见Le Deng 等人，J. Microbiological Methods, Vol. 26，Iss. 10-2,197-203 (1997)。对于某些实施例(包括任一个上述的分离细菌细胞的方法实施例在内)，使固相 支撑物与样品接触是在留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷存在下进行。如上所指出，使固相支撑物与样品接触也可以在可提供合适介质以使细菌细胞有 效结合固相支撑物的缓冲液存在下进行。可在与固相支撑物接触之前、接触的同时或接触 之后，将具有适当的电荷、同渗容摩(osmolarity)或其他特性的缓冲液加到样品中。PBS缓 冲液和PBS-L64缓冲液是这种细胞结合缓冲液的例子。在另一个实施例中，提供用于检测细菌细胞的装置，该装置包括组合物，该组合 物包含具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面的固相支撑物及多个非特异 性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞，其中该蛋白与该碳水化合物共价键 合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及用于检测细菌细胞的工具。在另一个实施例中，提供用于检测细菌细胞的装置，该装置包括组合物，该组合 物包含具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面的固相支撑物及留族化合物 或三萜烯的两亲性糖苷，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水 化合物与该固相支撑物连接；以及用于检测细菌细胞的工具。对于某些实施例，该组合物还 包含多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。该装置可包括一个或多个容纳该组合物和该用于检测细菌细胞的工具的结构部 件。该装置可为固相支撑物捕获细菌细胞、剩余样品与固相支撑物分离和检测细菌细胞 提供位置(一个或多个)和条件。可将样品定位在一个或多个位置或贮存器中。该装置 可提供对一个或多个位置或贮存器的均勻和准确的温度控制。该装置可例如提供位于各 位置或贮存器之间的通道，使得细菌细胞结合可在一个或多个位置或贮存器中发生，而细 菌细胞检测可在一个或多个其他的位置或贮存器中进行。对于某些实施例(包括任一个 上述的包括该用于检测细菌细胞的装置的实施例在内)，该装置是侧向流动装置、垂直流 动装置或者它们的组合。这种装置的一些例子在本受让人的共同待审美国专利申请序列 号60/989291中有描述。对于某些实施例，该装置是微流控装置。微流控装置的一些例子 在美国专利公告号 2002/0064885 (Bedingham 等人)；US2002/0048533 (Bedingham 等人)； US2002/0047003 (Bedingham 等人)；和 US2003/138779 (Parthasarathy 等人)；美国专利 第 6，627，159 号；第 6，720，187 号；第 6，734，401 号；第 6，814，935 号；第 6，987，253 号；第7,026，168 号和第 7，164，107 号；以及国际公告号 WO 2005/061084 Al (Bedingham等人)中 有描述。对于某些包括多个细菌细胞的实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实 施例或装置实施例在内)，该多个细菌细胞包括两种或更多种不同类型的细菌。一种类型 的细菌或一种类型的细菌细胞指该细菌或细菌细胞的菌株、菌种、菌属、菌科、菌目或菌部 (part) ο对于某些包括多个细菌细胞的实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方 法实施例或装置实施例在内)，细菌选自革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。对于某 些这些实施例，细菌选自芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、包 柔氏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒 杆菌属(Corynebacteria)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃 希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、李斯 特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria) > fx 单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄 球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Str印tococcus)、弧菌属(Vibrio)禾口耳口尔森氏 菌属(Yersinia)。对于某些实施例，细菌选自金黄色葡萄球菌(S. aureus)、绿脓杆菌 (P. aeruginosa)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、粪肠球菌(E. faecalis)、无乳链球菌 (Strep agalatiae)、停乳链球菌(Strep dysgalatiae)、大肠杆菌(E· coli)、沙门氏菌属 (Salmonella)和 B 组链球菌(Group B Strep) 在另一个实施例中，提供试剂盒，该试剂盒包含具有包含碳水化合物和生物素结 合蛋白的组合的表面的固相支撑物，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白 通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。对于某 些这些实施例，该试剂盒还包含用于检测细菌细胞的工具。对于某些实施例(包含任一个上述的装置或试剂盒实施例在内)，用于检测细菌 细胞的工具选自用于通过生物发光检测腺苷三磷酸(ATP)的试剂、PDA比色传感器、用于 核酸检测的试剂、用于免疫学检测的试剂、用于平板接种和计数细菌细胞的培养基、表面声 波传感器等。用于检测ATP的试剂包括萤光素、萤光素酶和任选包括裂解剂。用于核酸检测的 试剂包括例如引物、探针、用于延伸该引物的酶或者它们的组合。用于免疫学检测的试剂包 括例如至少一种抗体。对于某些包括留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷的实施例(包括任一个上述的 组合物实施例、方法实施例、装置实施例或试剂盒实施例在内)，该留族化合物或三萜烯的 两亲性糖苷是皂苷。皂苷是27个碳原子的留族化合物或30个碳原子的三萜烯通过糖苷键 与糖连接所成。对于某些实施例，糖选自己糖、戊糖、糖二酸和它们的组合。皂苷已被用作温 和的去污剂和用于裂解红细胞。但是，出乎意料的是，现已发现这类物质可与生物素结合蛋 白和碳水化合物(生物素结合蛋白通过碳水化合物连接到固相支撑物)的组合一起存在， 而不损失非特异性结合细菌细胞的有效性。此外，对于某些实施例，生物素结合蛋白和碳水 化合物(生物素结合蛋白通过碳水化合物连接到固相支撑物)的组合与留族化合物或三萜 烯的两亲性糖苷组合在一起，或以上所述的其实施例，对于非特异性结合细菌细胞更加有
12效。对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或 试剂盒实施例在内)，生物素结合蛋白是这样的蛋白，如果生物素与其一起存在的话，其可 每蛋白分子结合四个生物素分子。虽然本发明的实施例包括生物素结合蛋白，但所包括的 该生物素结合蛋白没有结合于其上的生物素(或与另一物质连接的生物素)。对于某些这 些实施例，生物素结合蛋白选自亲和素、链亲和素、中和亲和素(neutravidin)和经选择性 硝化的亲和素。亲和素是质量为约66kDa、等电点为10至10. 5的糖蛋白。亲和素约10% 的总质量是碳水化合物。亲和素可市售获得，例如获自Sigma-Aldrich公司。链亲和素是 质量为约60kDa、等电点为约5的四聚蛋白。链亲和素(其缺乏亲和素中存在的碳水化合 物组分)可市售获得，例如获自Pierce公司。中和亲和素为去糖基化的亲和素，质量为约 601^ 等电点为约6.3。中和亲和素可市售获自Pierce公司。经选择性硝化的亲和素是 亲和素的四个生物素结合位点中的酪氨酸残基被硝化，其可获自Molecular Probes, Inc公 司，商品名为CAPTAVIDIN。对于某些这些实施例，生物素结合蛋白是链亲和素。对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或 试剂盒实施例在内)，碳水化合物选自单糖、寡糖、多糖和它们的组合。合适的单糖包括例 如甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、鼠李糖、半乳糖 胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、N-乙酰神经胺酸、甲基-D-卩比喃甘露糖苷、α -甲基葡萄 糖苷、半乳糖苷、核糖、木糖、阿拉伯糖、糖二酸盐、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、甘油、这些单 糖中的任何一种的衍生物、以及它们的组合。合适的寡糖包括那些具有2-12个可相同或不 同的单糖单元的寡糖。例子包括具有2-6个单元的寡甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、纤维二 糖、水杨苷、这些寡糖中的任何一种的衍生物、以及它们的组合。合适的多糖包括那些超过 12个可相同或不同的单糖单元的多糖。例子包括诸如以下的多糖阿拉伯树胶(金合欢树 胶)，其据认为是半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡糖醛酸(作为钙盐、镁盐和钾盐)的分支聚 合物；半乳甘露聚糖多糖(刺槐豆胶)，其据认为是甘露糖的直链聚合物，在每四个甘露糖 上有一个半乳糖分支；瓜尔豆胶，其据认为是甘露糖的直链聚合物，每两个单元上有一个半 乳糖分支；和刺梧桐胶，其据认为包括半乳糖、鼠李糖和葡糖醛酸的部分乙酰化聚合物。对 于某些这些实施例，碳水化合物包括至少一个羧基基团。任何一种包括至少一个羧基基团 的上述单糖、寡糖、多糖和它们的组合都可使用。此外，任何一种被衍生化以包括至少一个 羧基基团的上述单糖、寡糖、多糖和它们的组合都可使用。对于某些这些实施例，碳水化合 物是多糖。对于某些这些实施例，碳水化合物包含阿拉伯酸。可通过生物素结合蛋白上的官能团与碳水化合物上的官能团之间的反应，使生物 素结合蛋白与碳水化合物共价键合。对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、 方法实施例、装置实施例或试剂盒实施例在内)，碳水化合物包括至少一个羧基基团，生物 素结合蛋白通过连接基团与碳水化合物共价键合，该连接基团是该蛋白和该碳水化合物的 至少一个羧基基团的反应产物。生物素结合蛋白通过公知的相互作用与碳水化合物发生共 价键合。例如，生物素结合蛋白的氨基与碳水化合物的羧基基团反应以提供连接基团，在这 个情况中是酰胺基团。在另一个例子中，生物素结合蛋白的羟基与碳水化合物的羧基基团 反应以提供连接基团，在这个情况中是酯基团。这些连接基团任一者或两者可提供该蛋白 和该碳水化合物之间的键，不过作为另外一种选择或除此之外，也可使用其他已知的键合
13途径和连接基团。固相支撑物可部分或完全由碳水化合物构成。固相支撑物被构造成在其表面具有 碳水化合物，使得该碳水化合物可供与生物素结合蛋白反应。该生物素结合蛋白于是与该 碳水化合物键合，而该碳水化合物是与该固相支撑物连接，或者就是该固相支撑物。固相支撑物可以是任何已知的目前被用于进行分离或固定化的支撑物或基质。对 于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或试剂盒实施 例在内)，固相支撑物选自珠子、凝胶、薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛 细管、以及它们的组合。固相支撑物可包含玻璃、二氧化硅、陶瓷、金属、聚合物或它们的组 合。合适的聚合物包括例如乳胶、纤维素、多糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃(如 聚乙烯、聚丙烯和聚(4-甲基丁烯))、聚烯烃共聚物、聚烯烃离子聚合物、聚烯烃共混物、聚 苯乙烯、聚酰胺(如尼龙)、聚(丁酸乙烯酯)、聚酯(如聚(对苯二甲酸乙二醇酯))、聚氯 乙烯、聚(乙烯醇)和聚碳酸酯。对于某些实施例，固相支撑物包含多糖。固相支撑物可用碳水化合物(如一种或多种以上所述的那些碳水化合物)进行包 覆。包覆的碳水化合物可通过已知的键合方法和结构结合于固相支撑物。例如，固相支撑 物表面可首先用异氰酸基团进行官能化，然后用碳水化合物进行包覆。碳水化合物上的羟 基基团(和氨基基团，如果存在的话)与异氰酸基团反应，从而使碳水化合物键合到固相支 撑物。对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或 试剂盒实施例在内)，固相支撑物是磁性颗粒。有多种磁性颗粒可市售获得，包括例如其 中包入了磁性胶体的聚(乙烯醇)基聚合物颗粒(Chemagen AG，德国)、包含磁赤铁矿 (Y -Fe2O3)和磁铁矿(Fe3O4)混合物与聚苯乙烯壳的分散体的聚苯乙烯球(Dynal Biotech ASA，挪威奥斯陆)、具有多糖基质的磁性颗粒(Chemicell GmbH，德国柏林)和具有多糖芯 并包覆有链亲和素的磁性颗粒(Chemicell GmbH)。那些不包含可供与生物素结合蛋白键合 的碳水化合物的磁性珠子或颗粒，可例如如上所述进行修饰以连接上碳水化合物，该碳水 化合物然后就可与生物素结合蛋白键合。具有多糖芯或基质的磁性颗粒可与生物素结合蛋 白反应，以提供上述的碳水化合物与蛋白的组合。已经包覆有链亲和素的具有多糖芯或基 质的磁性颗粒不经修饰即可使用。对于某些实施例(包括任一个上述的包括磁性珠子或颗粒的实施例在内)，磁性 珠子或颗粒的直径为约0. 02至约5微米。对于非球形的珠子或颗粒，这个直径指珠子或颗 粒的至少一个维度。这个直径范围为细菌细胞的有效非特异性捕获提供合适的表面积。通过以下的实例进一步说明本发明的目标和优点，但不应当将这些实例中例举的 具体材料及其量以及其它的条件和细节理解成对本发明的不当限制。^M实例中以及说明书通篇中的所有份量、百分数、比例等均以摩尔计，除非另外 指明。所有没有指出供应商的溶剂和试剂均购自Aldrich Chemical (美国威斯康星州 Milwaukee 市)。水是用电阻系数为 18. 2Mohms/cm 的 U-V Milli-Q 纯水器(Millipore,美 国马萨诸塞州Bedford市)进行纯化。缩写表
权利要求
一种组合物，其包含固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
2.一种组合物，其包含固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其 中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连 接；以及甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。
3.根据权利要求2所述的组合物，其还包含多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋 白的组合的细菌细胞。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的组合物，其中所述多个细菌细胞包括两种或更 多种不同类型的细菌。
5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的组合物，其中所述细菌选自芽孢杆菌 属(Bacillus)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆 菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacteria)、肠杆菌 属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌 属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、李斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属 (Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌 属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属 (Str 印 tococcus)、弧菌属(Vibrio)禾口耳口尔森氏菌属(Yersinia)。
6.根据权利要求2、3和作为权利要求3的从属权利要求的权利要求4或5中任一项所 述的组合物，其中所述留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷是皂苷。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述生物素结合蛋白选自亲和素、 链亲和素、中和亲和素和经选择性硝化的亲和素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述碳水化合物选自单糖、寡糖、 多糖、以及它们的组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述碳水化合物包括至少一个羧 基基团，且其中所述生物素结合蛋白通过连接基团与所述碳水化合物共价键合，该连接基 团是所述蛋白和所述碳水化合物的该至少一个羧基基团的反应产物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述固相支撑物选自珠子、凝胶、 薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述固相支撑物是磁性颗粒。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述磁性颗粒的直径为约0.02至约5微米。
13.一种分离细菌细胞的方法，其包括提供固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表 面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑 物连接；提供怀疑具有多个细菌细胞的样品；使具有包含该碳水化合物和该生物素结合蛋白的组合的表面的该固相支撑物与该样 品接触；其中来自该样品的多个细菌细胞中的至少一部分非特异性结合于该固相支撑物的 表面；以及在来自该样品的多个细菌细胞中的该至少一部分非特异性结合于该固相支撑物的表 面后，使该固相支撑物与该样品的其余部分分离。
14.根据权利要求13所述的方法，其还包括检测所述多个细菌细胞中的所述至少一部分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述检测是通过选自以下的检测方法来进行 通过生物发光进行的腺苷三磷酸(ATP)检测、聚二乙炔(PDA)比色检测、核酸检测、免疫学 检测、基于生长的检测和表面声波检测。
16.根据权利要求13、14和15中任一项所述的方法，其中使该固相支撑物与该样品接 触是在留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷存在下进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷是皂苷。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述生物素结合蛋白选自亲和 素、链亲和素、中和亲和素和经选择性硝化的亲和素。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物选自单糖、寡糖、 多糖、以及它们的组合。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物包括至少一个羧 基基团，且其中所述生物素结合蛋白通过连接基团与所述碳水化合物共价键合，该连接基 团是所述蛋白和所述碳水化合物的该至少一个羧基基团的反应产物。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述固相支撑物选自珠子、凝胶、 薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述固相支撑物是磁性颗粒。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述磁性颗粒的直径为约0.02至约5微米。
24.根据权利要求13至23中任一项所述的方法，其中所述多个细菌细胞包括两种或更 多种不同类型的细菌。
25.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，其中所述细菌选自芽孢杆菌 属(Bacillus)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆 菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacteria)、肠杆菌 属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌 属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、李斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属 (Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌 属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属 (Str 印 tococcus)、弧菌属(Vibrio)禾口耳口尔森氏菌属(Yersinia)。
26.一种用于检测细菌细胞的装置，其包括 一种组合物，所述组合物包含固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连 接；以及多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞；以及用于检测细菌细胞的工具。
27.一种用于检测细菌细胞的装置，其包括一种组合物，所述组合物包含固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其 中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连 接；以及甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷；以及用于检测细菌细胞的工具。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述组合物还包含多个非特异性结合于该碳水 化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
29.根据权利要求26或权利要求28所述的装置，其中所述多个细菌细胞包括两种或更 多种不同类型的细菌。
30.根据权利要求26、28和29中任一项所述的装置，其中所述细菌选自芽孢杆 菌属(Bacillus)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、弯曲 杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacteria)、肠杆 菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆 菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、李其Jf特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌 属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏 菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属 (Str 印 tococcus)、弧菌属(Vibrio)禾口耳口尔森氏菌属(Yersinia)。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的装置，其中所述用于检测细菌细胞的工具选 自用于通过生物发光检测腺苷三磷酸(ATP)的试剂、PDA比色传感器、用于核酸检测的试 剂、用于免疫学检测的试剂、用于平板接种和计数细菌细胞的培养基和表面声波传感器。
32.根据权利要求27，28，作为权利要求28的从属权利要求的权利要求29，作为权利要 求28的从属权利要求或作为权利要求28的从属权利要求的权利要求29的从属权利要求 的权利要求30，和作为权利要求27、权利要求28、作为权利要求28的从属权利要求的权利 要求29或者作为权利要求28的从属权利要求或作为权利要求28的从属权利要求的权利 要求29的从属权利要求的权利要求30的从属权利要求的权利要求31中任一项所述的装 置，其中所述留族化合物或三萜烯的两亲性糖苷是皂苷。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的装置，其中所述生物素结合蛋白选自亲和 素、链亲和素、中和亲和素和经选择性硝化的亲和素。
34.根据权利要求26至33中任一项所述的装置，其中所述碳水化合物选自单糖、寡糖、 多糖、以及它们的组合。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的装置，其中所述碳水化合物包括至少一个羧 基基团，且其中所述生物素结合蛋白通过连接基团与所述碳水化合物共价键合，该连接基 团是所述蛋白和所述碳水化合物的该至少一个羧基基团的反应产物。
36.根据权利要求26至35中任一项所述的装置，其中所述固相支撑物选自珠子、凝胶、 薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。
37.根据权利要求36所述的装置，其中所述固相支撑物是磁性颗粒。
38.根据权利要求37所述的装置，其中所述磁性颗粒的直径为约0.02至约5微米。
39.一种试剂盒，其包括固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其 中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连 接；以及甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其还包括用于检测细菌细胞的工具。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述用于检测细菌细胞的工具选自用于通 过生物发光检测腺苷三磷酸(ATP)的试剂、PDA比色传感器、用于核酸检测的试剂、用于免 疫学检测的试剂、用于平板接种和计数细菌细胞的培养基和表面声波传感器。
42.根据权利要求39、40和41中任一项所述的试剂盒，其中所述留族化合物或三萜烯 的两亲性糖苷是皂苷。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的试剂盒，其中所述生物素结合蛋白选自亲和 素、链亲和素、中和亲和素和经选择性硝化的亲和素。
44.根据权利要求39至43中任一项所述的试剂盒，其中所述碳水化合物选自单糖、寡 糖、多糖、以及它们的组合。
45.根据权利要求39至44中任一项所述的试剂盒，其中所述碳水化合物包括至少一个 羧基基团，且其中所述蛋白通过连接基团与所述碳水化合物共价键合，该连接基团是所述 蛋白和所述碳水化合物的该至少一个羧基基团的反应产物。
46.根据权利要求39至45中任一项所述的试剂盒，其中所述固相支撑物选自珠子、凝 胶、薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。
47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述固相支撑物是磁性颗粒。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中所述磁性颗粒的直径为约0.02至约5微米。
全文摘要
本发明涉及用于非特异性分离细菌细胞的组合物、方法、装置和试剂盒。所述组合物包含以下组分固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及1)多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞或者2)甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷中的至少一者。所述方法、装置和试剂盒包括这些组合物中的至少一个。
文档编号G01N33/543GK101952727SQ200880126955
公开日2011年1月19日 申请日期2008年12月23日 优先权日2007年12月31日
发明者图沙尔·A·克希尔萨加尔, 斯里达尔·V·达萨拉塔, 马尔科·G·博马里托 申请人:3M创新有限公司