微生物浓集方法

专利名称：微生物浓集方法
技术领域：
本发明涉及用于捕集或浓集微生物使得它们保持活力以便检测或测定的方法。在 其他方面，本发明还涉及用于实施所述浓集方法的诊断试剂盒。
背景技术：
由微生物污染导致的食品传染性疾病和医院内获得性感染为世界各地许多地方 所关注。因此，测定多种诊断样品、食品样品、环境样品或其他样品中细菌或其他微生物的 存在以测定所存在的微生物的身份和/或量常常是合乎需要的或是必要的。例如，可测定细菌DNA或细菌RNA，以甚至在存在其他细菌种类的情况下评估特定 细菌种类的存在与否。然而，能够检测特定细菌存在至少部分取决于所分析的样品中细菌 的浓度。可对细菌样品进行铺板或培养，以增加样品中细菌的数量，来确保足够的检测水 平，但培养步骤通常需要大量的时间且因此会显著耽搁评估结果。使样品中的细菌浓集可缩短培养时间或甚至消除对于培养步骤的需要。因此，已 经开发了通过使用菌株的特异性抗体(例如，为抗体包被的磁性珠或非磁性珠的形式)来 分离(并由此浓集)特定细菌菌株的方法。然而，这些方法倾向于昂贵，并且比至少一些诊 断应用所需的速度稍微慢些。也已经使用了非菌株特异性的浓集方法(例如，以获得样品中所存在的微生物的 更为一般性的评估)。在浓集了混合种群的微生物之后，如果需要，通过使用菌株特异性探 针来测定特定菌株的存在。已经通过基于碳水化合物和凝集素蛋白相互作用的方法实现了微生物的非特异 性浓集或捕集。涂覆壳聚糖的支持物已经用作非特异性捕集装置，并且用作微生物营养素 的物质(例如，碳水化合物、维生素、铁螯合的化合物以及铁载体)也已经被描述为可用作 提供微生物非特异性捕集的配基。多种无机材料(例如，羟基磷灰石和金属氢氧化物)已经用于非特异性结合和浓 集细菌。物理浓集方法(例如，过滤、色谱、离心和重力沉降)也已经用于非特异性捕集，其 使用和/或不使用无机结合剂。这些非特异性浓集方法在速度、成本(至少一些需要昂贵 的设备、材料和/或受过训练的技术人员)、样品需求(例如，样品性质和/或体积限制)、 空间需求、使用的方便性(至少一些需要复杂的多步骤方法)、现场使用的适合性和/或效 果方面不同。

发明内容
因此，我们认为迫切需要用于快速检测病原微生物的方法。所述方法将优选不仅 快速而且成本低、简单(涉及不复杂的设备或程序)和/或在多种条件下有效(例如，不同
4类型样品基质、不同细菌负荷以及不同样品体积)。简而言之，在一个方面，本发明提供了一种用于非特异性浓集样品中存在的微生 物菌株(例如，细菌、真菌、酵母、原生动物、病毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)和细菌 内生孢子的菌株)使得微生物保留用于检测或测定一种或多种菌株的活力的方法。所述方 法包括(a)提供浓集剂(例如，粒状浓集剂)，所述浓集剂包含无定形金属硅酸盐，并且具 有金属原子与硅原子比例小于或等于约0. 5的表面组成，如通过X射线光电子波谱(XPS) 检测(例如，球化的滑石)；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品(优选地，为流体形 式)；以及(c)使所述浓集剂与所述样品接触(优选地，通过混合接触)，使得至少一种微 生物菌株的至少一部分被所述浓集剂结合或捕集。优选地，所述方法还包括检测至少一种 结合的微生物菌株的存在(例如，通过基于培养的检测方法、显微镜法/成像检测方法、基 因检测方法、基于生物发光的检测方法或免疫检测方法)和/或离析(优选地，通过重力沉 降)所产生的结合微生物的浓集剂。所述方法还可任选包括将所产生的离析的浓集剂与样 品分罔。本发明的方法不靶向特定的微生物菌株。然而，已经发现，某些较便宜的无机材 料可令人惊讶地有效捕集多种微生物。这类材料可以以非菌株特异性方式浓集存在于样 品(例如，食品样品)中的微生物菌株，使得可较容易且快速地测定一种或多种微生物菌株 (优选地，一种或多种细菌菌株)。本发明的方法相对简单且成本低(不需要复杂的设备或昂贵的菌株特异性材 料)，并且相对快速(相对于无浓集剂的对照样品，优选的实施例在少于约30分钟捕集存在 于样品中的至少约70% (更优选地，至少约80%;最优选地，至少约90%)的微生物)。另 外，所述方法可对于多种微生物(包括诸如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之类的病原体) 和多种样品(不同的样品基质，并且与至少一些现有技术的方法不同，甚至具有低微生物 含量和/或大体积的样品)有效。因此，本发明的方法的至少一些实施例可满足上述对于 低成本、在多种条件下快速检测病原微生物的简单方法的迫切需要。在另一方面，本发明还提供了用于实施本发明的方法的诊断试剂盒，所述试剂盒 包括(a)浓集剂(优选地，粒状浓集剂)，所述浓集剂包含金属硅酸盐，并且具有金属原子 与硅原子比例小于或等于约0.5的表面组成，如通过X射线光电子波谱(XPS)检测；(b)检 测容器(优选地，无菌检测容器)；和(c)有关实施本发明方法中使用浓集剂的说明书。优 选地，所述诊断试剂盒还包括一种或多种选自以下的组份微生物培养基、裂解试剂、缓冲 剂、生物发光检测分析组分、基因检测分析组分以及它们的组合。
具体实施例方式定义如本专利申请中所使用的“样品”是指通过非修饰方法(即，通过除了将包含上述浓集剂的组合物应用于人 体和/或将其从人体移取之外的方法)采集的(例如，待分析的)物质或材料。“样品基质”是指除了微生物以外的样品组分。“检测”是指鉴定微生物的至少一种组分，由此测定微生物的存在。“基因检测”是指对衍生自靶微生物的遗传物质组分如DNA或RNA的鉴定。
“免疫检测”是指对衍生自靶微生物的抗原物质如蛋白质或蛋白多糖的鉴定。“微生物”是指具有适于分析或检测的遗传物质的任何细胞，包括，例如细菌、酵 母、病毒和细菌内生孢子。“微生物菌株”是指可通过检测方法区分的特定类型的微生物，例如，不同属的微 生物，属内不同种的微生物或种内不同分离菌株的微生物)；并且“靶微生物”是指需要检测的任何微生物。浓集剂适用于实施本发明方法的浓集剂包括下述那些其包含金属硅酸盐，并且具有金 属原子与硅原子比例小于或等于约0. 5 (优选小于或等于约0. 4 ；更优选小于或等于约0. 3 ； 最优选小于或等于约0. 2)的表面组成，如通过X射线光电子波谱(XPS)检测。优选地，所 述表面组成还包括至少约10平均原子％的碳(更优选地，至少约12平均原子％的碳，最优 选地，至少约14平均原子％的碳)，如通过X射线光电子波谱(XPS)检测。XPS是一种可测 定样品表面最外面约3至10纳米(nm)的元素组成并且对于周期表中除了氢和氦之外的所 有元素都敏感的技术。XPS是对于大多数元素而言检测极限范围为0. 1至1原子％浓度的 定量技术。XPS的优选表面组成评价条件可包括相对于具有士 10度接受立体角的样品表面 测量的90度飞离角。使用上述浓集剂的浓集或捕集通常对于任何特定株系、种类或类型的微生物来说 是非特异性的，因此提供了对样品中一般群落的微生物的浓集。然后，可使用任何已知的 检测方法使用菌株特异性探针从捕集的微生物群落中检测特定的微生物菌株。因此，所述 浓集剂可用于检测临床样品、食品样品、环境样品或其他样品中的微生物污染物或病原体 (特别是食源性病原体，例如细菌)。当分散或悬浮于水系统中时，诸如金属硅酸盐之类的无机材料显示具有该材料的 特征性表面电荷和水系统的pH。该材料-水界面的电位称为“ζ电位”，这可从电泳迁移率 (即，从该材料颗粒在置于水系统中的带电荷的电极之间移动的速率)计算得来。用于实施 本发明方法的浓集剂具有ζ电位，比(例如)常用的金属硅酸盐如普通滑石带有更多负电 荷。然而，令人惊讶地，所述浓集剂比滑石更有效地浓集微生物，如细菌，其表面通常倾向于 带负电荷。优选地，所述浓集剂在约7的pH具有负ζ电位(更优选地，在约7的pH具有 范围在约_9豪伏至约-25豪伏的Smoluchowski ζ电位；甚至更优选地，在约7的pH具有 范围在约-10豪伏至约-20豪伏的Smoluchowski ζ电位；最优选地，在约7的pH具有范围 在约-11豪伏至约-15豪伏的Smoluchowski ζ电位)。可用的金属硅酸盐包括金属的无定形硅酸盐，金属例如为镁、钙、锌、铝、铁、钛等 (优选镁、锌、铁和钛，更优选镁)以及它们的组合。优选的是为至少部分熔凝的颗粒形式的 无定形金属硅酸盐(更优选无定形球化的金属硅酸盐；最优选无定形球化硅酸镁)。金属 硅酸盐是已知的，并且可通过已知方法化学合成或通过天然存在的原矿石的采矿和加工来 获得。至少部分熔凝的颗粒形式的无定形金属硅酸盐可通过在控制条件下熔化或软化 较小的供料颗粒(例如，平均粒度最多为约25微米)以制造通常是椭圆形或球形的颗粒的 任何已知方法来制备(即，具有扩大的通常为圆形和无尖锐角或边缘的二维图像的颗粒， 包括实际或基本上是圆球形和椭圆形和任何其他圆形或弯曲形状)。所述方法包括雾化、火抛光、直接熔化等。优选的方法是焰熔法，其中通过直接熔化或火抛光固体供料颗粒而形成 至少部分熔化的基本玻璃质的颗粒(例如，在美国专利号6，045，913 (Castle)中描述的方 法，将其说明内容以引用方式并入本文中)。最优选地，所述方法可通过将大部分的不规则 形状的供料颗粒(例如，约15至约99体积百分数；优选地，约50至约99体积百分数；更优 选地，约75至约99体积百分数；最优选地，约90至99体积百分数)转变为通常是椭圆形 或球形的颗粒而用于产生无定形球化的金属硅酸盐。一些无定形金属硅酸盐可商购获得。例如，无定形球化硅酸镁可商购获得用于化 妆品(例如，3M Cosmetic Microspheres CM-111，可从 3M 公司(St. Paul，MN)获得)。除了无定形金属硅酸盐，所述浓集剂还可包含其他材料，包括金属(例如，铁或 钛)氧化物、晶态金属硅酸盐、其他晶态材料等，前提条件是所述浓集剂具有上述表面组 成。然而，所述浓集剂优选基本不含有晶态二氧化硅。在实施本发明方法中，可以以适于样品接触和微生物捕集的任何形式(例如，以 颗粒形式或用于支持物的形式，例如浸渍片、薄膜、过滤器、试管、微孔、培养板、珠、膜或微 流体装置的通道等)使用所述浓集剂。优选地，以颗粒形式使用浓集剂，更优选包括微粒 (优选地，粒度范围为约1微米(更优选地，约2微米)至约100微米(更优选地，约50微 米；甚至更优选地，约25微米；最优选地，约15微米；其中，范围的任何较低限可与任何较 高限配对)的微粒)。MM本发明的方法可用于多种不同类型的样品，包括但不限于医学样品、环境样品、食 品样品、饲料样品、临床样品和试验样品以及它们的组合。医学或兽医样品可包括(例如) 来自临床诊断待测定的生物来源(例如，人或动物)的细胞、组织或流体。环境样品可为 (例如)来自医学或兽医设施、工业设施、土壤、水源、食品制备区(食品接触和非接触区)、 实验室或可潜在经历生物恐怖的区域。优选的是食品加工、处理以及制备区样品，这是因为 这些在细菌病原体导致的食品供应污染方面常常受到特别的关注。液体形式或以固体于液体中的分散液或悬浮液形式获得的样品可直接使用，或可 进行浓缩(例如，通过离心)或稀释(例如，通过添加缓冲液(控制PH的溶液))。固体或 半固体形式的样品可直接使用，或者，如果需要的话，可通过例如用液体介质(例如，缓冲 液)洗涤或漂洗或者悬浮或分散于该液体介质(例如，缓冲液)中的方法萃取。可从表面 (例如，通过擦洗或漂洗)获取样品。优选地，样品为流体(例如，液体、气体，或者固体或液 体于液体或气体中的分散体或悬浮液)。可用于实施本发明方法的样品的例子包括食品(例如，新鲜生产或即食型午餐食 品或“deli”肉)、饮料(例如，果汁或碳酸盐饮料)、饮用水和生物流体(例如，全血或其 组分，例如血浆，富含血小板的血液级分、血小板浓缩物或浓缩红细胞；细胞制剂(例如，分 散的组织、骨髓抽吸物或椎体骨髓)；细胞悬浮液；尿液、唾液以及其他体液；骨髓；肺流体； 脑流体；伤口渗出物；伤口活检样品；眼睛流体；脊髓液等)，以及可使用已知程序例如使用 裂解缓冲液形成的裂解制剂，例如细胞裂解物等。优选的样品包括食品、饮料、引用水、生物 流体以及它们的组合(更优选为食品、饮料、饮用水以及它们的组合)。样品体积可根据具体应用而不同。例如，当本发明方法用于诊断或研究应用时，所 述样品的体积通常为微升范围(例如，10微升或更大)。当所述方法用于食品病原体检测
7分析或用于饮用水安全性检测时，样品的体积可通常为毫升至升的范围(例如，100毫升至 3升)。在工业应用中，例如生物工艺或制药配方中，所述体积可为千分之十升。本发明方法可从浓集状态的样品分离微生物，并且还可使得能从可抑制待使用的 检测程序的样品基质组分分离微生物。在所有这些情况中，本发明的方法可排除或替代微 生物浓集的其他方法而使用。因此，任选地，如果需要另外的浓集，可在实施本发明方法之 前或之后从样品培养培养物。SM可通过多种已知的或将来开发的提供两种材料之间接触的方法中的任何方法来 实施本发明方法。例如，可将浓集剂添加至样品，或者可将样品添加至浓集剂。可将涂覆 浓集剂的浸渍片浸于样品溶液中，可将样品溶液倾注至涂覆浓集剂的薄膜上，可将样品溶 液倾注至涂覆浓集剂的试管或微孔中，或者可将样品溶液通过涂覆有浓集剂的过滤器(例 如，机织滤布或无纺滤布)。然而，优选地，在多种容器中的任何容器(任选地但也优选地，盖帽的容器、闭合 或密封容器，更优选地，带盖的试管、瓶子或罐)中合并(使用任何添加次序)浓集剂和样 品。用于实施本发明方法的合适的容器将由具体样品决定，可在尺寸和性质上有很大程度 不同。例如，所述容器可为小容器，例如10微升容器(例如，试管)或较大的容器，例如100 毫升或3升容器(例如，Erlenmeyer锥形瓶或聚丙烯大口瓶)。容器、浓集剂以及直接接触 样品的任何其他装置或附属物可在使用前进行灭菌(例如，通过控制热、环氧乙烷气或辐 射来进行)，以减轻或防止可导致检测误差的任何样品污染。足以捕集或浓集特定样品的 微生物用于成功检测的浓集剂的量将不同(取决于例如，浓集剂的性质和形式以及样品体 积)，可由本领域技术人员容易地确定。例如，对于一些应用而言，每毫升样品10毫克浓集 剂是可用的。如果需要，可通过将粒状浓集剂至少一次通过样品来产生接触(例如，通过依赖 经一段时间例如约10分钟的重力沉降)。可通过混合(例如，通过搅拌、摇动或使用振动 台)使得浓集剂颗粒重复通过样品的大部分或经样品的大部分沉降来增强接触。对于微升 级的小体积(通常，小于0.5毫升)来说，可通过快速的如涡旋或“回转”来混合，例如，如 美国专利号5，238，812 (Coulter等人)所述，将其说明内容以引用方式并入本文中。对于 大于或等于0.5毫升(通常0.5毫升至3升)级的较大体积来说，可通过以“端对端”的方 式轻柔翻转粒状浓集剂和样品来实现混合，例如，如美国专利号5，576，185 (Coulter等人) 所述，将其说明内容以引用方式并入本文中。可借助于例如配置成容纳试管或其他类型反 应容器并以“端对端”方式缓慢旋转试管或容器的装置来实现所述翻转。可进行所需时间 的接触(例如，对于等于或小于约100毫升体积的样品，最多约60分钟的接触是有用的；优 选，约15秒至约10分钟或更长时间；更优选，约15秒至5分钟)。因此，在实施本发明方法中，混合(例如，搅动、振动或搅拌)和/或孵育(例如， 在室温下)是任选的但也是优选的，以便增加微生物与浓集剂的接触。优选的接触方法包 括将含微生物的样品(优选为流体)与粒状浓集剂一起混合(例如，约15秒至约5分钟) 和孵育(例如，约3分钟至约30分钟)。如果需要，在浓集剂和样品的组合物中，可包括一 种或多种添加剂(例如，裂解试剂、生物发光检测试剂、核酸捕集试剂(例如，磁性珠)、微生 物培养基、缓冲剂(例如，润湿固体样品的缓冲剂)、微生物染色试剂、洗液(例如，洗除未
8结合材料的洗液)、洗脱剂(例如，血清白蛋白)、表面活性剂(例如，可从Union Carbide Chemicals and Plastics (Houston, TX)获得的 Triton X-100 非离子型表面活性剂)、机械 磨蚀剂/洗脱剂(例如，玻璃珠)等)。如果需要，可将浓集剂(单独，或与例如抗微生物材料和/或与液体形式的载体材 料(例如水或油)、固体(例如，纤维、聚合物、纸或无机固体)、凝胶、乳膏、泡沫或糊剂组 合)涂覆至无孔或多孔、固体、污染微生物的或可污染微生物的材料或表面，或针对无孔或 多孔、固体、污染微生物的或可污染微生物的材料或表面摩擦(例如，用作“清洁”剂)。如 果需要，可使用粘合剂、稳定剂、表面活性剂或其他特性改性剂。对于这样的用途，可将浓集剂涂覆至机织物或无纺物，并且可涂覆至一次性表面， 例如纸、组织、棉拭子以及多种吸附性和非吸附性材料。例如，可将浓集剂掺入布或纸载体 材料，以用作“清洁”擦拭物。可将浓集剂涂覆至(例如，以包含载体材料的擦拭物或糊剂 的形式)固体表面，例如，在家庭、日间护理、工业以及医院设施中用于清洗玩具、设备、医 学装置、工作表面等。当用于清洗或其他目的时，如果需要，可同时采集样品并在单独的步 骤中使样品与浓集剂接触。离析和/或分离任选地但也优选地，本发明的方法还包括离析所产生的结合微生物的浓集剂。优 选可通过至少部分依赖于重力沉降(重力沉积，例如，经约5分钟至约30分钟的时间段) 实现这样的离析。然而，在一些情况下，促进离析(例如，通过离心或过滤)或使用任何离 析方法的组合是理想的。本发明的方法还可任选包括分离产生的结合微生物的浓集剂和样品。对于流体样 品而言，这可包括去除或分离离析时产生的上清液。可通过本领域熟知的多种方法(例如， 通过倾析或虹吸，以使得结合微生物的浓集剂位于实施本发明方法中使用的容器或器皿的 底部)实现上清液的分离。本发明的方法可人工实施(例如，以分批方式实施)或者可为自动化的(例如，以 使得能够连续或半连续处理)。腿可通过使用本发明方法来浓集并任选但也优选地检测多种微生物，包括(例如) 细菌、真菌、酵母、原生动物、病毒(包括无包膜病毒和有包膜病毒)、细菌内生孢子等以 及它们的组合(优选为细菌、酵母、病毒、细菌内生孢子、真菌以及它们的组合；更优选为 细菌、酵母、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合；甚至更优选为细菌、病毒、细菌内生孢子 以及它们的组合；最优选为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、无包膜病毒(例如，诺沃克病毒 (norovirus)、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、鼻病毒以及它们的组合)、细菌内生孢子以 及它们的组合)。所述方法可用于检测病原体，这对于食品安全或对于医学、环境或反恐怖 主义原因来说是重要的。所述方法尤其可用于检测病原性细菌(例如，革兰氏阴性菌和革 兰氏阳性菌)，以及多种酵母、霉菌和支原体(以及这些中的任何的组合)。待检测的靶微生物属包括(但不限于)李斯特菌(Listeria)、埃希杆菌 (Escherichia)、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、梭状芽孢杆 菌(Clostridium)、缠绕杆菌(Helicobacter)、分枝杆菌(Mycobacterium)、葡萄球菌 (Staphylococcus)、志贺氏菌(Shigella)、肠球菌(Enterococcus)、芽抱杆菌(Bacillus)、奈瑟氏菌(Neisseria)、志贺氏菌(Shigella)、链球菌(Str 印 tococcus)、弧菌(Vibrio)、 耶尔森氏菌(Yersinia)、博德特氏菌(Bordetella)、包柔氏螺旋体(Borrelia)、假单胞菌 (Pseudomonas)、酵母菌(Saccharomyces)、念珠菌(Candida)等以及它们的组合。样品可 含有多种微生物菌株，并且任何一种菌株可独立于任何其他菌株而被检测到。可作为用于 检测的靶的具体微生物菌株包括大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、小肠结肠炎耶尔森 氏菌(Yersinia enterocolitica)、假结核耳口尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)、 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、创伤弧菌 (Vibrio vulnificus)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡 萄球菌(Staphylococcusaureus)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、酿酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、葡萄球菌肠毒素亚禾中 (Staphylococcal enterotoxin ssp)、赌样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis)(Bacillus atrophaeus)lif (Bacillus
subtilis)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭状芽孢杆菌 (Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、阪崎肠杆菌 (Enterobacter sakazakii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等以及它们的组合 (优选地，金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、酿酒酵母菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠 埃希氏杆菌、人类感染性无包膜肠道病毒(大肠埃希氏杆菌噬菌体为替代物)以及它们的 组合)。由浓集剂捕集或结合(例如，通过吸附)的微生物可通过目前已知或将来开发的 基本任何所需方法来检测。该方法包括(例如)基于培养的方法(当时间允许时可为优 选)、显微镜法(例如，使用可用于观察标记荧光染料的微生物的透射光显微镜或落射荧光 显微镜)以及其它成像方法、免疫检测方法和基因检测方法。微生物捕集之后的检测过程 可任选包括洗涤，以去除样品基质组分。免疫检测是对衍生自靶生物体的抗原物质的检测，该抗原物质通常是用作细菌或 病毒颗粒表面标志的生物分子(例如，蛋白质或蛋白多糖)。抗原物质的检测通常可通过抗 体、选自诸如噬菌体展示之类的过程的多肽或来自筛选过程的适体来进行。免疫检测方法是熟知的，并且包括(例如)免疫沉淀和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。可以多种方式(例如，通过使用荧光染料、使用量子点或使用可产生化学发光或 有色底物的酶来标记初级抗体或次级抗体，和使用读板机或侧流装置)来检测抗体结合。还可通过基因检测(例如，通过核酸杂交或引物指导的扩增)来进行检测，基因 检测常常是优选的方法。可将捕集或结合的微生物裂解成使得它们的遗传物质可用于检 测。裂解方法是熟知的，并包括(例如)下述处理，例如声裂法、渗透压休克、高温处理(例 如，约50°C至约IOCTC )，以及与酶一起孵育，该酶例如为溶菌酶、葡萄糖酶、酵母裂解酶 (zymolose)、溶细胞酶、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒内溶素。许多常用的基因检测分析可检测特定微生物的核酸，包括DNA和/或RNA。基因检 测方法中使用的条件的严格性与所检测的核酸序列的变异水平相关。盐浓度和温度的高严 格条件可限制对靶的准确核酸序列的检测。因此，使用高度严格的基因检测可区分靶核酸 序列中具有小变异度的微生物菌株。基因检测可以基于核酸杂交，其中，单链核酸探针与微 生物的变性核酸杂交，使得产生包含探针链的双链核酸。本领域技术人员应熟悉探针标记，
10例如放射性标记、荧光标记以及化学发光标记，其用于在凝胶电泳、毛细管电泳或其他分离 方法之后检测杂交物。特别有用的基因检测方法是基于引物指导的核酸扩增。引物指导的核酸扩增方法 包括(例如)热循环方法(例如，聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)以 及连接酶链反应(LCR))和等温法以及链置换扩增(SDA)(以及它们的组合，优选地，为PCR 或RT-PCR)。用于检测扩增产物的方法包括(但不限于)例如凝胶电泳分离和溴化乙锭染 色，以及检测产物中掺入的荧光标记或放射性标记。还可使用在检测扩增产物之前不需要 分离步骤的方法(例如，实时PCR或均相检测)。生物发光检测方法是熟知的，并且包括(例如)腺苷酸三磷酸(ATP)检测方法，包 括美国专利号7，422，868 (Fan等人)中所描述的那些，将其说明内容以引用方式并入本文中。由于本发明方法是非菌株特异性的，它提供了允许在相同样品中对多种微生物菌 株靶向以进行检测的常用捕集系统。例如，在测定食品样品的污染中，检测相同样品中的所 有单核细胞增多性李斯特菌、大肠埃希氏杆菌以及沙门氏菌是合乎需要的。然后，在单个捕 集步骤之后可为(例如)使用扩增来自这些微生物菌株中各菌株的不同核酸序列的特异性 引物的PCR或RT-PCR测定。因此，可避免对各菌株的分开的样品处理和制备程序的需要。诊断试剂念用于实施本发明方法的试剂盒包括(a)上述浓集剂(优选地，为颗粒)；(b)检测 容器(优选地，无菌检测容器)；和(c)有关在实施本发明方法中使用浓集剂的说明书。优 选地，所述诊断试剂盒还包括一种或多种选自以下的组分微生物培养基或生长培养基、裂 解试剂、缓冲剂、生物发光检测分析组分(例如，光度计、裂解试剂、荧光酶、酶底物、反应缓 冲剂等)、基因检测分析组分以及它们的组合。优选的裂解试剂是在缓冲剂中提供的水解 酶，优选的基因检测分析组分包括靶微生物的一种或多种特异性引物。例如，本发明的诊断试剂盒的优选实施例包括粒状浓集剂(例如，在诸如玻璃 或聚丙烯瓶的无菌一次性容器中)，连同用以在实施本发明方法中使用所述试剂的说明书 (例如，通过将浓集剂与待分析的流体样品混合，通过重力使得浓集剂沉降，去除产生的上 清液，以及检测浓集剂结合的至少一种靶微生物菌株的存在)。任选地，浓集剂可在含有防 腐剂的小量缓冲液中水合，以增强储存和运输过程中的稳定性和/或可容纳/等分于撕开 式密封袋中以防止污染。浓集剂可以是液体中的分散液或悬浮液形式，或者可为粉末形式。 优选地，诊断试剂盒包括粒状浓集剂的预测量的等分试样(例如，基于样品体积)，更优选 地，其容纳于一个或多个撕开式密封袋内。实施例通过以下的实例进一步说明本发明的目标和优点，但不应当将这些实例中例举的 具体材料及其量以及其它的条件和细节理解成对本发明的不当限制。材料晶态硅酸镁浓集剂(下文中为Talc)购自Mallinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ) 0所有微生物培养物均购自美国模式培养物保藏中心(ATCC; Manassas, VA)。无定形球化硅酸镁浓集剂(下文中为AS-Talc)以3M CosmeticMicrospheresCM-Ill获得(固体球形形状，2. 3g/立方米的颗粒密度，3. 3m2/g的表面积，颗粒大小90% 小于约11微米，50%小于约5微米，10%小于约2微米，获得自3M公司(St. Paul，MN))。ζ电位测量使用装配有ΤΜ200自动滴定模块、ρΗ电极和在线电导池的Colloidal Dynamics Acoustosizer II 多频电声光谱仪(ColloidalDynamics，Warwick，RI)将 Talc 和 AS-Talc 浓集剂(于18兆欧姆去离子水(通过使用Millipore Corporation，Bedford，MA的 Milli-Q Elix 10 Synthesis AlO去离子系统获得)中的分别为5. 75重量百分数的Talc 和5. 8重量百分数的AS-Talc)的水分散体的ζ电位作为添加的盐酸(ρΗ)的函数来进行 测量。使用极性校正和极性样品沉降用下述常用参数进行测量起始体积170mL分散体滴定体积终末时5至IOmL ；各滴定为20步，滴定剂1. ON水中的盐酸(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)搅拌速率300转/分钟(rpm)泵速率400mL/分钟混合延迟时间在测量前酸加成之后搅拌120秒在约7 的 pH，AS-Talc 表现出约 _12mV 的 Smoluchowski ζ 电位，Talc 表现出 约-8mV 的 Smoluchowski ζ 电位。表面组成分析通过X射线光电子波谱(XPS，也称为ESCA)分析Talc和AS-Talc浓集剂的样品的 表面组成。将粉末样品压至铝箔上的双面压敏粘合带上。通过用压缩氮气扫动来从各样品 表面去除多余的粉末。使用具有单色Al-K。X射线激发源(1487eV)的Kratos AXIS Ultra DLD光谱仪 (Kratos Analytical, Manchester, England)和在恒定通过能量模式操作的半球电子能量 分析仪获取光谱数据。在相对于士 10度的接受立体角的样品表面测量的90度的飞离角检 测发射的光电子。低能量泛射式电子枪用于使表面带电荷最小化。使用140瓦特阳极功率 和2X 10_8托的腔室压进行测量。对各浓集剂样品表面测量的约300微米至约700微米的区域进行各数据点的分 析。分析各样品上三个区域，并取平均数，获得所报道的平均原子％数值。使用标准的 Vision2 软件(Kratos Analytical, Manchester, England)进行数据处理。结果(以 XPS 可检测到的水平存在于浓集剂表面的元素)显示于下面的列表A中表 A。
镁娃镁与硅碳氧浓集(平均(平均的(平均(平均剂原子％)原子％ )比例原子％ )原子％ )Talc17260. 656. 950
权利要求
一种方法，该方法包括(a)提供浓集剂，所述浓集剂包含无定形金属硅酸盐，并且具有如下表面组成，该表面组成具有如通过X射线光电子波谱(XPS)检测的小于或等于0.5的金属原子与硅原子比例；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品；以及(c)使所述浓集剂与所述样品接触，使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分与所述浓集剂结合或被其捕集。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括检测至少一种结合的微生物菌株 的存在。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓集剂是粒状浓集剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面组成具有小于或等于0.4的金属原子与 硅原子比例。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述表面组成为至少10平均原子％的碳。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓集剂在PH为7时具有负ζ电位。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属选自镁、钙、锌、铝、铁、钛以及它们的组
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述金属是镁。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述浓集剂包含至少部分熔凝的颗粒形式的无定形金属硅酸盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述无定形金属硅酸盐是球化的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述浓集剂是无定形的球化硅酸镁。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是流体形式。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物菌株选自如下物质的菌株细菌、真 菌、酵母、原生动物、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述微生物菌株选自如下物质的菌株细菌、酵 母、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触是通过将所述浓集剂与所述样品混合 来进行的。
16.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测是通过选自如下的方法进行的基于培 养的方法、显微镜法和其它成像方法、基因检测方法、免疫检测方法、基于生物发光的检测 方法以及它们的组合。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括离析所得的结合了微生物的浓 集剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述离析是通过选自如下的方法实现的重力 沉降、离心、过滤以及它们的组合。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述离析至少部分通过重力沉降来实现。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法还包括将所述所得的离析的浓集剂与 所述样品分离。
21.一种方法，该方法包括(a)提供浓集剂，所述浓集剂包含无定形的球化硅酸镁，并 且具有如下表面组成，该表面组成具有如通过X射线光电子波谱(XPS)检测的小于或等于 0.5的金属原子与硅原子比例；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品，所述微生物选自细菌、酵母、病毒、细菌内生孢子以及它们的组合；以及(C)使所述浓集剂与所述样品接触， 使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分与所述浓集剂结合或被其捕集。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法还包括检测至少一种结合的微生物菌 株的存在。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述浓集剂包括微粒，所述样品是流体形式，并 且所述接触是通过将所述浓集剂与所述样品混合来进行的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述方法还包括至少部分通过重力沉降来离析 所述所得的结合了微生物的浓集剂。
25.—种试剂盒，其包括(a)浓集剂，所述浓集剂包含无定形金属硅酸盐，并且具有如 下表面组成，该表面组成具有如通过X射线光电子波谱(XPS)检测的小于或等于0.5的金 属原子与硅原子比例；(b)检测容器；和(c)在实施根据权利要求1所述的方法中使用所述 浓集剂的说明书。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括至少一种选自如下的组 分微生物培养基、裂解试剂、缓冲剂、生物发光检测分析组分、基因检测分析组分以及它们 的组合。
27.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述浓集剂是颗粒形式，所述检测容器是无 菌且一次性的，并且所述检测容器容纳有所述浓集剂。
28.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括处于至少一个撕开式密封袋 中的至少一个预测量等份的颗粒形式的所述浓集剂。
29.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述浓集剂包含无定形的球化硅酸镁。
全文摘要
本发明描述了一种用于捕集或浓集用于检测或测定的微生物的方法，所述方法包括(a)提供浓集剂，所述浓集剂包含无定形金属硅酸盐，并且具有如下表面组成，该表面组成具有如通过X射线光电子波谱(XPS)检测的小于或等于0.5的金属原子与硅原子比例；(b)提供包含至少一种微生物菌株的样品；以及(c)使所述浓集剂与所述样品接触，使得所述至少一种微生物菌株的至少一部分与所述浓集剂结合或被其捕集。
文档编号G01N33/543GK101981177SQ200880110360
公开日2011年2月23日 申请日期2008年10月2日 优先权日2007年10月3日
发明者图沙尔·A·克希尔萨加, 托马斯·E·伍德, 曼基里·T·克什尔萨格尔 申请人:3M创新有限公司