一种鳗弧菌快速检测系统的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和免疫学领域，更具体地，本发明涉及一种媛弧菌快速检测 系统的制备与应用。
【背景技术】
[0002] 媛弧菌（Vibrio anguillarum)是目前在水产养殖业中具有极大危害的革兰氏阴 性杆菌，能够感染包括海水鱼和淡水鱼在内的多种鱼类。该菌在世界不少国家和地区都引 起了不同程度的病害爆发，近年来给我国水产养殖业造成了极大的危害。
[0003] 建立媛弧菌快速、简单、准确的检测方法，对水产养殖品种媛弧菌病害控制具有重 要的意义。目前，传统的检测方法，是对病原微生物富集，根据菌落形态特征和生理生化特 征或结合16S rDNA测序来判定病原种类。此外，免疫学检验技术被广泛的应用到病原微生 物的检测中。包括细菌凝集实验、免疫扩散实验、免疫英光技术、免疫印迹技术、酶联免疫吸 附技术巧LISA)等。部分研究工作者采用免疫学检验方法对媛弧菌进行检测，建立了媛弧 菌免疫组化检验方法、（间接）酶联免疫吸附法巧LISA)等检测方法。近几年，有人报道了 W聚合酶链反应（PCR)或环介导等温扩增技术（LAM巧对媛弧菌特异性基因进行检测。
[0004] 传统的细菌学生理生化鉴定方法费时繁琐，而一般的免疫酶试验、免疫英光法及 ELISA等方法虽然可W用于媛弧菌的检测，但其操作程序较复杂、检测相对费时费力。PCR 技术简便、快速、敏感性高，但对仪器设备及操作技能均要求较高，在水产养殖的基层单位 难W大面积推广，LAMP技术虽然不需要特殊仪器设备，但操作时易出现假阳性。
[0005] 20世纪90年代初，胶体金免疫层析技术（GICA)逐渐发展起来。该方法是一种W 胶体金为标记物的快速免疫结合分析技术，具有特异性强、灵敏度高、简便快速、肉眼判读、 稳定性高等优点。相比较传统的几种媛弧菌的检测方式，胶体金免疫技术在检测时间W及 操作简便性上占了极大的优势。但是，胶体金免疫技术需要借助特异性良好、灵敏度良好且 适用于制备金标抗体的抗体作为制备基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种媛弧菌快速检测系统的制备与应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种用于检测媛弧菌的测试板，其包括固相载体， W及：（1)包被于金标垫的金标抗体，其是特异性抗媛弧菌的单克隆抗体，其由保藏号为 CCTCC N0:C201477的杂交瘤细胞株产生；和（2)包被于检测线的抗体，其是特异性抗媛弧 菌的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC N0:C201478的杂交瘤细胞株产生。
[000引在一个优选例中，所述的测试板包括：固相载体（支撑板），W及位于固相载体上 的；样品垫，金标垫，分析膜，吸水垫；所述的分析膜上设置检测线和质控线。
[0009] 在另一优选例中，所述的质控线上标记与媛弧菌抗体免疫源相同的羊抗鼠第二抗 体。
[0010] 在另一优选例中，所述的固相载体是PVC塑料板。
[0011] 在另一优选例中，所述的分析膜为硝酸纤维素膜。
[0012] 在另一优选例中，所述的测试板的固相载体上，所述的样品垫，金标垫，分析膜，吸 水垫是有序排列的，使得样品在加样于样品垫后，依次流经金标垫、分析膜、吸水垫。
[0013] 在另一优选例中，所述测试板上各组件的叠放顺序为；固相载体置于最底层，其 上黏贴有分析膜；分析膜两端分别放置胶体金结合垫和吸水纸，胶体金结合垫和吸水纸均 与分析膜重合3± 1mm;胶体金结合垫的另一端放置样品垫，样品垫与胶体金结合垫重合 3 + 1mm。
[0014] 在另一优选例中，所述吸水垫为滤纸纤维。
[0015] 在另一优选例中，金标抗体W 0. 3 + 0.1 mg/mL的量均匀涂布于玻璃纤维素膜、聚 醋膜或滤纸纤维，获得金标垫；
[0016] 包被于检测线的抗体W 1 ±0. 2mg/mL的浓度、W 2 + 0. 3 μ L/cm喷涂于硝酸纤维素 膜上预定的检测线位置。
[0017] 在本发明的另一方面，提供所述的测试板的用途，用于检测媛弧菌，或用于制备检 测媛弧菌的试剂盒。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种用于检测媛弧菌的检测试剂盒，其中包括所述的 用于检测媛弧菌的测试板。
[0019] 在本发明的另一方面，提供特异性识别媛弧菌的单克隆抗体，其是由保藏号为 CCTCC N0:C201477的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；和/或其是由保藏号为CCTCC N0:C201478的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
[0020] 在本发明的另一方面，提供产生特异性识别媛弧菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞 株，其在中国典型培养物保藏中必的保藏号是CCTCC NO:C201477 ;和/或其在中国典型培 养物保藏中必的保藏号是CCTCC NO:C201478。
[0021] 在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测媛弧 菌的检测试剂盒。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种检测媛弧菌的方法，所述方法包括；将待测样品加 样于所述的测试板的样品垫中，观察分析膜上检测线和质控线，若检测线和质控线同时显 色，则认为待测样品包含媛弧菌。
[0023] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0024] 图1、胶体金快速测试板的组装步骤。其中T为检测线，包被媛弧菌单克隆抗体；C 为质控线，包被羊抗鼠 IgG ;阳性检测结果为T、C线同时显色；阴性检测结果仅C线显色；无 效检测结果则C线不显色。
[00巧]图2、胶体金快速测试板特异性检测结果。
[0026] 图3、胶体金快速测试板灵敏度检测结果。
[0027] 图4、鱼体组织与菌液混合物的检测。
【具体实施方式】
[002引本发明人经过深入的研究，筛选到了特异性良好、灵敏度良好且适用于免疫胶体 金技术的抗体。在此基础上，本发明人基于胶体金免疫检测技术，建立了针对媛弧菌的简 便、快速、敏感、准确诊断检测媛弧菌的方法，从而实现早期控制媛弧病的蔓延，在水产养殖 媛弧菌病害控制中具有重要的意义。
[0029] 本领域技术人员均了解，细菌包含有多种蛋白抗原，每种抗原可能含有多个抗原 表位（抗原决定簇），因此，针对一种细菌可W获得难W计数的抗体，送些抗体对抗原（细 菌）的结合特性（如特异性等）均可能是不同的。因此，针对一种细菌，往往需要进行大量 的反复比较、筛选和鉴定，才能找到适合于特异性结合、并适用于产业化应用的单抗。
[0030] 本发明人在研究中发现，一些利用媛弧菌制备的抗体或利用媛弧菌的裂解蛋白制 备的抗体，当用于实际检测时，遭遇到与媛弧菌结合特性差的问题，送可能是由于待测样品 中与该抗体相应的抗原决定簇被包在蛋白结构内部，无法接触到抗体造成的。送给该菌株 的检测带来了难题，难W找到一种具备对于媛弧菌的识别能力且具备该菌株特异性（不与 其它菌株发生交叉反应）的抗体。另外，适用于普通化ISA技术的单克隆抗体与适用于基 于免疫胶体金技术的单克隆抗体也存在差异，不能交互使用。例如，一对抗体适用于一般的 双夹必化ISA法检测，但当应用于基于免疫胶体金的双夹必化ISA技术时，则可能并没有良 好的检测效果。
[0031] 针对上述技术难题，本发明人经过大量的单克隆筛选和验证，从而获得本发明的 杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC N0:C201477和杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC N0:C201478的 单克隆抗体，该两个单克隆抗体针对两个来自媛弧菌的不同抗原决定簇。W所述的单克隆 抗体为基础，可制备准确地检测媛弧菌的测试板及检测试剂盒。
[0032] 本发明的单克隆抗体利用杂交瘤技术来制备。在获得了所述杂交瘤的情况下，可 按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单 克隆抗体。作为一种实施方式，所述的单克隆抗体可W由下列制备方法制备：
[0033] (1)提供佐剂预处理的小鼠；
[0034] (2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；
[0035] (3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。
[0036] 作为一种方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，经硫酸倭，接着用 Protein G层析柱纯化，获得高纯度的抗媛弧菌的单克隆抗体。
[0037] 在获得了本发明的抗体后，本领域技术人员可W通过本领域已知的测序技术来获 得该单抗的序列信息，例如测得其重链和轻链的序列。从而可应用生物工程技术人工制备。
[0038] 本发明的单克隆抗体可W利用重组方法制备或利用多肤合成仪合成。本领域人员 均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手