单克隆抗体她3-巧-SP20和8G3-B5-SP20,再用蛋白 G亲和纯化血清纯化，纯化后得到两种单克隆抗体效价均达81000 W上，蛋白浓度分别为 0. 66mg/ml 和 0. 5mg/ml。
[0074] 实施例2、胶体金的制备及试纸条组装
[00巧]1.采用巧樣酸Η钢还原法制备胶体金溶液，制备方法如下：
[0076] 1)取250ml Η角瓶一个，加99ml超纯水及1ml 1 % (w/v)氯金酸，加热沸腾；
[0077] 。取1. 8血的1 % (w/v)巧樣酸钢加入上述溶液中，迅速混合均匀，再保持沸腾 lOmin，自然冷却后蒸傭水恢复至lOOmL体积；
[007引扣胶体金溶液用娃化过的试剂瓶4°C保存，备用。
[0079] 2.金标抗体的制备
[0080] (1)取 10ml 胶体金溶液，W 0. 2mol/L K2CO3 和 0.1mol/L 肥 1 调至最佳抑 9. 8 ;
[0081] (2)将6 μ 1体积8G3-B5-SP20抗体加入胶体金溶液中，混合均匀，于4°C放置化；
[0082] (3)量取与抗体等体积的2% (w/v)BSA溶液，加入到上述胶体金抗体结合液中混 合均匀，于4°C和1500r/min离必15min ;
[008引 （4)弃沉淀，用孔径为0.45 μ m的滤膜过滤上清除掉聚集体，于4°C和8000 Xg离 必 30min ;
[0084] (5)弃上清，用含有0. 5% (w/v)PEG20000的PBS重悬沉淀至原体积，于4°C和 8000 X g 离必 30min ;
[00财 （6)弃上清，用金标与抗体结合物保护液巧％ (w/v)BSA，60% (w/v)藏糖，1. 5% Tween-20及0. 5mol/L氯化钢加入到PBS中混匀）重悬沉淀，获得8G3-B5-SP20金标抗体， 避光保存于4°C备用。
[0086] 3、测试板的组装
[0087] (1)将浓度为0. 3mg/mL的8G3-B5-SP20金标抗体均匀涂布于经处理过的玻璃纤维 素膜上，置于4°C环境中干燥，制备出金标垫。
[0088] (2)将使用喷金划线仪将浓度分别为lmg/mL、0. 5mg/mL的媛弧菌单克隆抗体 6B3-C5-SP20和羊抗鼠第二抗体（购自北京天根公司）W 2 μ L/cm喷涂于硝酸纤维素膜上 的预定检测线和质控线上，置于4Γ环境中干燥，制备出分析膜。
[0089] (3)胶体金快速测试板由样品垫、金标垫、分析膜、吸水纸和PVC塑料底板组成。 其叠放顺序为：PVC塑料板置于最底层，其上黏贴有分析膜；分析膜两端分别放置胶体金 结合垫和吸水纸，胶体金结合垫和吸水纸均与分析膜重合3mm;胶体金结合垫的另一端 放置样品垫，样品垫与胶体金结合垫重合3mm。试纸条组装完成后，用切条机将其切割为 0. 4cmX 5cm的试纸条，置于塑料外壳中，与干燥剂一起放入锡巧纸中保存。具体组装步骤如 图1所示。
[0090] 实施例3、媛弧菌测试板特异性检测
[0091] W V. anguillarum MVM425 与弧菌属病原菌 V. alginolyticus、V. harve}^、 V. par址aemolyticus、V. vulnifi州s及鱼类常见病原菌迟纯爱德华氏菌E. tarda EIB202和 海豚链球菌S. iniae，水体常见细菌E. coli和S. aureus测试板的特异性。
[009引将W上细菌培养液浓度调整为IX 109C即/ml,各取100 μ 1检测，W PBS作为空白 对照。lOmin后，记录显色情况，其中质控线和检测线都显色的记为阳性，只有质控线显色 的记为阴性，质控线不显色视为无效。
[0093] 结果如图2。由结果可见，所述的试纸条能够特异性地检测V. anguillarum，与其 他菌株没有任何反应。
[0094] 实施例4、媛弧菌测试板灵敏度检测
[009引将培养至稳定期的V. anguillarum MVM425梯度稀释至1 X 109、1 X 108、1 X 107、 1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X l03c即/ml，各取100 μ 1加入试纸条样品垫上，W PBS作为空白对 照。15min后记录显色情况，质控线和检测线都显色的记为阳性，只有质控线显色的记为阴 性，质控线不显色视为无效。
[0096] 结果如图3。由结果可见，所述的试纸条的检测限低于10?即/ml,灵敏度很高。
[0097] 实施例5、复杂样品背景下的试纸条检测
[0098] 取已检验无媛弧菌的健康大菱解组织研磨成浆，加入媛弧菌V. angui 11 arum MVM425菌，混合液中媛弧菌浓度为7. 5X105CFU/ml，取100μ 1混合物至胶体金测试板样品 孔，反应lOmin后观察显色结果。
[0099] 结果如图4。可见即使在复杂样品中，本发明的试纸条也能够特异性地检测出媛弧 菌 V. anguillarum。
[0100] 生物材料保藏
[0101] 本发明中，小鼠杂交瘤细胞株8G3-B5-SP20已经保藏于中国典型培养物保藏中必 (中国，武汉），其保藏号是；CCTCC N0:C201477,保藏日是2014年4月21日。
[0102] 本发明中，小鼠杂交瘤细胞株她3-巧-SP20已经保藏于中国典型培养物保藏中必 (中国，武汉），其保藏号是；CCTCC N0:C201478,保藏日是2014年4月21日。
[0103] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考郝样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员 可W对本发明作各种改动或修改，送些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的 范围。
【主权项】
1. 一种用于检测鳗弧菌的测试板，其特征在于，其包括固相载体，以及：（1)包被于金 标垫的金标抗体，其是特异性抗鳗弧菌的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC N0:C201477的 杂交瘤细胞株产生；和（2)包被于检测线的抗体，其是特异性抗鳗弧菌的单克隆抗体，其由 保藏号为CCTCC N0:C201478的杂交瘤细胞株产生。2. 如权利要求1所述的测试板，其特征在于，所述的测试板包括：固相载体，以及位于 固相载体上的：样品垫，金标垫，分析膜，吸水垫；所述的分析膜上设置检测线和质控线。3. 如权利要求2所述的测试板，其特征在于，固相载体上，所述的样品垫，金标垫，分析 膜，吸水垫是有序排列的，使得样品在加样于样品垫后，依次流经金标垫、分析膜、吸水垫。4. 如权利要求2所述的测试板，其特征在于，金标抗体以0.3±0. lmg/mL的量均匀涂布 于玻璃纤维素膜、聚酯膜或滤纸纤维，获得金标垫； 包被于检测线的抗体以1 ±0. 2mg/mL的浓度、以2±0. 3 μ L/cm喷涂于硝酸纤维素膜上 预定的检测线位置。5. 权利要求1-4任一所述的测试板的用途，其特征在于，用于检测鳗弧菌，或用于制备 检测鳗弧菌的试剂盒。6. -种用于检测鳗弧菌的检测试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求1-4任一所述 的用于检测鳗弧菌的测试板。7. 特异性识别鳗弧菌的单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC N0:C201477的杂交瘤细 胞株分泌的单克隆抗体；和/或其是由保藏号为CCTCC NO:C201478的杂交瘤细胞株分泌的 单克隆抗体。8. 产生特异性识别鳗弧菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中 心的保藏号是CCTCC NO:C201477 ;和/或其在中国典型培养物保藏中心的保藏号是CCTCC N0:C201478。9. 权利要求7所述的单克隆抗体的用途，用于制备特异性检测鳗弧菌的检测试剂盒。10. -种检测鳗弧菌的方法，其特征在于，所述方法包括：将待测样品加样于权利要求 2-4任一所述的测试板的样品垫中，观察分析膜上检测线和质控线，若检测线和质控线同时 显色，则认为待测样品包含鳗弧菌。
【专利摘要】本发明涉及一种鳗弧菌快速检测系统的制备与应用。本发明首次揭示了特异性良好、灵敏度良好且适用于免疫胶体金技术的单克隆抗体，建立了针对鳗弧菌的简便、快速、敏感、准确诊断检测鳗弧菌的方法，从而实现早期控制鳗弧病的蔓延，在水产养殖鳗弧菌病害控制中具有重要的意义。CCTCC NO:C20147820140421
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105628921
【申请号】CN201410624014
【发明人】肖婧凡, 王倩倩, 姚曈晖, 麦祺, 陈捷, 张元兴
【申请人】华东理工大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月7日